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防御素与肠道疾病的关系
防御素是一类重要的内源性抗菌肽亚家族，广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物以及人类中。它具有广谱抗菌活性、抗病毒活性以及肿瘤细胞毒性作用，是先天性免疫和获得性免疫系统的重要组成部分。近年来，防御素已成为国内外研究的热点。本文主要就防御素的分类、分布、生物活性以及与肠道疾病的关系方面作一综述。
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Paneth细胞防御素的功能对中医药体内抗菌机理的启示
Paneth细胞防御素是一类具有广谱、高效抗微生物活性的小分子肽,在肠道的先天性免疫中起着重要作用.本文从Paneth细胞防御素的生物学特性、抗菌活性及抗菌机制等方面对其进行了较全面的综述,同时也展望了Paneth细胞防御素在中医药研究中的前途,并提出使用药物诱导机体本身产生内源性的抗菌肽以达到抗感染目的的设想.
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子宫内膜异位症患者在位和异位内膜组织中人β防御素-2的表达
[目的]检测人β防御素-2(hBD-2)在正常子宫内膜、子宫内膜异位症(内异症)患者的在位和异位内膜组织中的表达,探讨hBD-2在内异症发病中的作用.[方法]选择25例内异症患者的卵巢异位内膜组织(异位内膜组)和相应的在位子宫内膜(在位内膜组),以及25例非子宫内膜异位症的子宫肌瘤患者(对照组)的子宫内膜组织.采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)和原位杂交技术检测各组内膜组织中hBD-2的基因表达,以及hBD-2在内异症不同临床分期的异位内膜和在位内膜组织中的表达差异.[结果]异位内膜组内膜组织中hBD-2的基因表达水平显著高于在位内膜组和对照组(P<0.05).在位内膜组和对照组子宫内膜组织中hBD-2的基因表达水平,差异无统计学意义(P>0.05).异位内膜组中,hBD-2临床分期表达为Ⅰ期高于Ⅲ期和Ⅳ期、Ⅱ期高于Ⅲ期和Ⅳ期,差异有统计学意义(P<0.05).[结论]异位内膜组织中hBD-2的高表达可能参与了内异症的发病.
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NSAIDs肠病时肠道防御素变化对肠道炎症反应的影响
目的：探讨大鼠NSAIDs肠病时肠道防御素变化对肠道炎症反应的影响。方法：34只SD大鼠随机分为模型组及对照组，每组17只。免疫组化检测回肠组织rAD-5、rAD-6的IOD值。 ELISA检测回肠组织IL-1β、IL-8、IL-10、ANCA、内毒素水平。结果：模型组rAD-5、rAD-6、IL-1β、IL-8、IL-10、ANCA水平均较对照组上升，差异均有统计学意义（P＜0．01）。模型组内毒素水平与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0．01）。结论：NSAIDs 100 mg／kg的阿司匹林腹腔注射2周并不能使黏膜损伤达到细菌内毒素移位的程度。伴随有微生物或其毒素的入侵，免疫屏障和局部炎症反应起着重要作用，其中的α－防御素可能起着多种桥梁作用。
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人防御素1研究进展
防御素（defensins）为参与机体初防御活动的小分子肽，是极为重要的一类内源性抗菌肽，具有广谱的抗微生物活性，能有效地杀灭病毒、细菌、真菌、螺旋体等，对肿瘤细胞也有细胞毒作用，在粘膜上皮广泛表达，是粘膜防御系统的重要介质，还可作为趋化因子连接天然免疫和获得性免疫。人体防御素主要以α-防御素、β-防御素两种为主，目前已经识别和分离出6种α-防御素和6种β-防御素。研究表明，hβD1具有广谱的抗菌活性。在体外hβD1在毫摩尔浓度下对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌及有包膜病毒均具有杀灭作用[1]，并具有一定的抗肿瘤作用。人β－防御素1独特之处在于，其在各种上皮组织中固有表达，受到感染和或微生物刺激后可以出现平衡调节，而被认为具有独特的研究和开发价值。
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白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定
目的克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析.方法提取白纹伊蚊基因组DNA,根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物,PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析.结果从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约375bp的片段,PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较,具有很高的同源性.结论克隆了白纹伊蚊的防御素基因,为下一步蚊虫防御素蛋白的研究奠定了基础.
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扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究
目的 应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法.方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA.根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′ RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析.结果采用改良5′ RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600 bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511 bp.通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因.结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因.应用改良5′ RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性.
关键词： 防御素 抗菌肽 扇贝 cDNA末端快速扩增聚合酶链反应 基因 -
人乳头瘤病毒假病毒体外感染模型的建立及人α防御素5抗病毒作用
目的 建立用人乳头瘤病毒16亚型假病毒(HPV-16 Psv)感染官颈癌细胞模型,并研究3种不同构型人α防御素5(HD-5)抗HPV的作用.方法 将表达HPV-16假病毒衣壳蛋白的重组质粒p16L1L2和含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒Pfwb共转染293FT细胞,分离、纯化病毒颗粒后感染官颈癌细胞株C-33a,同时分别给予20 μg/ml的HD-5/N(天然构型)、HD-5/Acm(半胱氨酸被Acm修饰)或HD-5/Abu(半胱氨酸被Abu替换)处理,培养48 h后荧光显微镜观察和流式细胞分析病毒感染率.结果 Pfwb与P16L1L2成功转染293FT细胞并获得滴度达2.5×108TU/ml的HPV-16假病毒液,镜检和流式细胞术检测显示官颈癌细胞C-33a能够被假病毒感染并表达GFP.HD-5/N、HD-5/Acm和HD-5/Abu对HPV-16感染C-33a细胞的抑制率分别为(96.48±5.67)％、(69.02±7.88)％和(2.71±1.53)％.与HD-5/N相比,HD-5/Acm和HD-5/Abu的抗病毒作用显著降低(P＜0.01).结论 建立了基于流式细胞分析的HPV-16假病毒感染模型并将其用于抗病毒药物活性检测.发现HD-5的空间结构和分子中半胱氨酸对其抗HPV感染的活性有重要作用.
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β防御素2在恶性黑色素瘤B16细胞中的稳定表达及其生物学效应研究
目的 建立稳定表达防御素mBD2的恶性黑色素瘤细胞B16-mBD2,研究mBD2对B16细胞生物学特性的影响.方法 在前期构建好mBD2真核表达质粒的基础上,脂质体法转染恶性黑色素瘤B16细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株B16-mBD2,RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达;MTT法鉴定其生长曲线;流式细胞仪分析细胞周期分布、凋亡情况及细胞膜表面分子CD80、CD86、MHCⅠ(H-2Kd)、MHCⅡ(I-Ad)的表达.结果 成功构建稳定表达mBD2的B16细胞,RT-PCR和Western blot分别从mRNA及蛋白水平验证了mBD2分子表达;稳定表达mBD2的细胞B16-mBD2与转染空载体的B16-p细胞及野生型B16细胞相比,细胞增殖明显减慢,从48 h开始,各时间点细胞活力显著降低(P<0.05);B16-mBD2细胞处于S期的比例(36.03±0.97)%显著增高(P<0.05);凋亡率及细胞膜表面分子CD80、CD86、MHCⅠ(H-2Kd)、MHCⅡ(I-Ad)表达无明显差异(P>0.05).结论 mBD2明显抑制恶性黑色素瘤B16细胞的增殖,其机制可能与诱导细胞周期S期阻滞有关;mBD2对细胞凋亡率及细胞膜表面免疫分子的表达无影响.
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人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究
目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His+/Mut+表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.
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hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体的构建及表达
目的 制备人血小板源性生长因子-A(human platelet-derived growth factor A, hPDGF-A) 和人β防御素2(human beta defensins, hBD2)双基因共表达腺病毒载体并观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)中的表达.方法 将hPDGF-A和hBD2通过内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site, IRES) 连接后,以同源重组的形式插入腺病毒表达载体,由人胚肾293 细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒.重组病毒感染BMSCs后,用RT-PCR检测重组腺病毒的表达.结果 ①成功构建穿梭质粒pAdTrack-hPDGF-A-IRES2-hBD2.②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-hPDGF-A-IRES2-hBD2.③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒.④转染的BMSCs高表达hPDGF-A和hBD2.结论 构建了hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体,证实其转染BMSC后的表达.
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猪中性粒细胞抑菌蛋白的分离及对细菌影响
目的提取、分离、纯化、高效高活性杀烧伤创面病原菌的猪血中性粒细胞防御素.方法用5%乙酸提取猪血中性粒细胞溶酶体可溶性成分,经制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化猪中性粒细胞防御素,用SDS-PAGE检测防御素的分子质量,以体外杀烧伤创面白色念珠菌试验、体外抑制烧伤创面金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的生长作用检测其活性.结果可从提取物中纯化出7种多肽(ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、ND7),它们的分子质量在2 800～6 800之间.体外杀白色念珠菌试验和体外抑制金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌的生长作用证实,ND1、ND2有高效杀菌活性,ND3也有较强的杀菌活性.结论通过猪血中性粒细胞的分离、纯化,可获得高效高活性杀烧伤创面病原菌的防御素.
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抗菌肽促进创伤愈合研究进展
抗菌肽（antibacterial peptide），由10～50个氨基酸组成，存在于上皮和免疫组织中，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性，人类抗菌肽构成了机体先天性免疫系统的第一道防线，被广泛研究［1］。目前越来越多的研究表明，抗菌肽的作用远不止于此，它广泛参与维持机体完整性的一系列相关生物学活动，包括创伤修复［2］。国内相关报道较少，现将其中3种抗菌肽与创伤修复研究进展综述如下。
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银杏叶提取物对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠防御素的调节作用
目的:银杏叶提取物(gingko biloba extract,EGB 761)对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠防御素的调节作用.方法:30只小鼠随机分为正常对照组、模型组、EGB761组,建立急性溃疡性结肠炎动物模型;观察小鼠一般情况及结肠病理学变化,应用免疫组织化学染色、Westem blot技术检测结肠组织的防御素～1(HBD-1)和防御素～2(HBD-2)的蛋白表达情况.结果:经EGB 761治疗后模型小鼠的一般情况及病理组织学均有明显改变,与模型组比较,EGB 761组结肠组织HBD-1 mRNA和蛋白表达明显增加,但HBD-2mRNA和蛋白表达明显下降.结论:可见EGB761对急性期溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织中的防御素具有调节作用.
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不同分子量段黄芪多糖的肠道粘附及对肠道呼吸道防御素分泌的研究
目的:研究不同分子量段黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide,APS)对肠道及呼吸道防御素(defensins,DF)分泌的影响及其在肠道派伊氏结(Peyer's patch,PP)的黏附.方法:皮下注射环磷酰胺/克霉唑制备黏膜免疫低下小鼠模型,灌胃给予总APS及不同分子量段APS连续5日,ELISA测定肠道及呼吸道灌洗液中DF；制备离体小鼠潘氏细胞,加入不同分子量段APS,共孵育后ELISA检测α-DF；对不同分子量段APS进行荧光素衍生化,采用激光共聚焦显微镜观察荧光素衍生化APS在小鼠肠道PP的粘附.结果:157.7kDa、69.9kDa分子量段APS 139mg/kg灌胃给予对模型小鼠肠道及呼吸道DF分泌减少均有明显对抗作用,其强度高于相同多糖含量的总APS;157.7kDa的APS在终浓度10～1000μg/ml范围内对离体潘氏细胞有直接刺激α-DF分泌作用；荧光素衍生化的APS157.7kDa与肠道作用后,存留于肠道粘膜的荧光强度为249,远高于荧光素衍生化的APS1.4kDa和右旋糖酐的60和39.结论:较大分子量的APS可促进肠道、呼吸道黏膜免疫,该作用可能与较大分子量APS更多黏附于肠道有关.
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TLR4-NF-κB在防御素调节获得性免疫中的作用
目的 探讨TLR4-NF-κB是否介导防御素Gal-13的获得性免疫调节作用.方法 体外培养小鼠外周血单核细胞,加入Gal-13(1 μg /mL)后 , 分别于不同时间中止刺激,免疫细胞化学检测单核细胞NF-κB、CD80、CD86的变化,ELISA 法检测IFN-α,IL-12的浓度,流式细胞术检测TLR4受体数目,并观察Gal-13对外周血单核细胞增殖功能的影响.另外加入TLR4阻断剂,观察上述因子的变化.结果 Gal-13刺激单核细胞NF-κB、CD80和CD86的活化,促进IL-12和IFN-α的分泌,增加 Con A刺激的细胞增殖,TLR4阻断剂可阻断Gal-13的这些作用.Gal-13的作用可下调TLR4 受体数目.结论 防御素Gal-13是TLR4的内源性配体之一,可通过TLR4- NF-κB途径调节获得性免疫反应.
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IL-1α及LPS 刺激Caco-2细胞防御素表达的差异性
目的比较细胞因子及LPS组对Caco-2细胞防御素表达的差别.方法用LPS和rhIL-1α刺激Caco-2细胞,采用半定量RT-PCR技术观察防御素HD-5、HD-6、hBD-1和hBD-2 mRNA的表达差异.结果经IL-1α刺激后,hBD-1的表达量有所增加,同时hBD-2、HD-5和HD-6也能表达;但LPS刺激后,hBD-1的表达量增加不明显,HD-5、HD-6和hBD-2仍未表达.结论 Caco-2细胞对LPS的刺激产生"哑"反应,推测肠上皮对LPS存在一定的适应性,这对维持一定的正常菌群有益.
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支气管哮喘与急性呼吸道感染患儿血浆β防御素3水平的对照研究
目的 β防御素3(HBD3)除了具有天然免疫功能,还发挥调节后天适应性免疫的作用.本研究拟通过支气管哮喘患儿、急性上呼吸道感染患儿及正常儿血浆HBD3浓度的比较,探讨HBD3在哮喘发病中的作用.方法 研究对象选择2009年4月到12月在哈尔滨医科大学附属第一医院儿科就诊病例共81例,其中哮喘组21例,为急性发作期支气管哮喘患儿,感染组29例,为急性上呼吸道感染患儿,正常对照组31例,为健康体检儿.采用酶联免疫吸附试验( ELISA)法进行血浆HBD3水平测定.同时测定血嗜酸性粒细胞总数和白细胞数,9例哮喘儿测定了血清IgE浓度.结果 血浆HBD3浓度正常儿为(8.028±1.078)μg/ml,哮喘患儿( 12.212±1.124)μg/ml感染患儿(8.976±1.110) μg/ml,哮喘患儿与急性呼吸道感染及正常儿3组总体比较,血浆HBD3浓度明显升高,差异有显著性(F=4.448,P＜0.05)；哮喘组与正常组比较,差异显著,P＜ 0.01;哮喘组与感染组比较,差异有显著性P＜ 0.05;感染组与正常组比较,差异无显著性P＞0.05;同时发现血浆HBD3水平与血清总IgE,血嗜酸性粒细胞及白细胞水平无显著相关性.结论 支气管哮喘发作时HBD3表达升高,HBD3可能是超越感染之外,参与哮喘发病的独立因素.HBD3是否始动因素尚待进一步探索.
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诱导毕赤酵母分泌表达致倦库蚊防御素Defensin成熟肽
目的 诱导毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达表达致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)防御素(defensin)成熟肽,为进一步研究致倦库蚊defensin的抗病原作用、机理及其应用奠定基础.方法 利用生物信息和RT-PCR技术克隆了编码致倦库蚊防御素的成熟肽全基因序列,并克隆到毕赤酵母甲醇诱导型分泌表达载体pPICZα-A的α-factor信号肽序列的下游,构建成pPICZα-A-defensin重组表达载体,表达载体经Sac Ⅰ线性化处理后电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选,菌落PCR,Mut表型鉴定和Tricine-SDS-PAGE分析,成功获得了能够有效表达重组defensin的pPICZα-A-Defensin/X-33甲醇利用表型工程菌.结果 在甲醇诱导24 h后pPICZα-A-Defensin/X-33的工程菌分泌表达了预期Mr8 200大小的致倦库蚊防御素成熟重组肽.结论 致倦库蚊防御素可以在毕赤酵母中诱导分泌表达.
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CYP27B1在溃疡性结肠炎肠上皮组织中的表达及其与防御素-2的关系
目的 检测人溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)患者结肠黏膜中CYP27B1和HBD-2变化,探讨维生素D在UC发病中的可能机制.方法 选择在河北医科大学第二医院消化内科诊断明确的活动期UC患者35例,应用免疫组织化学方法、real-time PCR、western blot方法测定正常对照、UC患者炎症和非炎症部位CYP27B1和HBD-2的表达和分布.结果 ①HBD-2蛋白分布于UC炎症部位上皮细胞胞浆,炎性细胞核中也有表达.HBD-2总体表达在炎症部位较正常对照组显著升高(P<0.01);CYP27B1蛋白在正常组织、UC非炎症部位及炎症部位均表达.在上皮细胞主要位于近隐窝腺腔面细胞膜,在UC炎症部位淋巴细胞核中表达明显,炎症部位较正常对照组显著升高(P<0.05),UC炎症部位结肠上皮HBD-2和CYP27B1的表达呈正相关(r=0.710,P<0.01).②HBD-2和CYP27B1的蛋白表达结果显示:UC患者炎症部位二者的表达较正常黏膜均显著升高(P<0.01,P<0.05).UC炎症部位HBD-2和CYP27B1的蛋白表达呈正相关(r=0.620,P<0.01).③HBD-2和CYP27B1的mRNA表达结果显示:UC患者炎症部位二者的表达较正常对照组均显著升高(P<0.01).且UC炎症部位结肠上皮HBD-2和CYP27B1的mRNA水平表达呈正相关(r=0.893,P<0.01).结论 CYP27B1和HBD-2在病变部位显著高表达且呈正相关,CYP27B1可能参与了维生素D局部活化及调控防御素表达.
关键词： 溃疡性结肠炎 维生素D 25-羟维生素D 1α-羟化酶 防御素
