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多形性腺瘤基因1与肝细胞癌关系探讨
我们前期应用含19 378个已知基因的寡核苷酸芯片筛选出肝硬化及肝细胞癌(HCC)差异基因表达谱,发现多形性腺瘤基因1(PLAG1)在HCC中是一个明显高表达的基因[1].PLAG1位于人染色体8q12,属锌指蛋白家族中的一种,已发现在腮腺多形性腺瘤、脂母细胞瘤、间质细胞瘤、子宫平滑肌瘤和平滑肌肉瘤中PLAG1呈异常表达,通过激活靶基因胰岛素样生长因子(IGF)Ⅱ等方式改变细胞增殖引起肿瘤的发生发展.国内外文献对PLAG1和肝癌关系的研究甚少.本研究应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹和免疫组织化学法检测PLAG1在人正常肝脏、肝硬化和HCC组织中的基因和蛋白的表达,探讨PLAG1在HCC发生发展过程中的作用及其与临床病理特征之间的关系.
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MicroRNA在6种肿瘤细胞中的表达差异
目的:利用生物芯片技术分析6种不同器官肿瘤细胞中microRNA(miRNA)的表达差异.方法:将210个与已知人类和小鼠miRNA互补的序列(206个miRNA,4个阳性对照)作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片.提取肿瘤细胞HeLa(人宫颈癌上皮细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、ES-2(人卵巢透明细胞癌)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞)的miRNA,荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交;用ScanArrayTM Express1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果;Northern blotting和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证.结果:在6种不同器官肿瘤细胞中,检测到115种miRNA存在差异,91种miRNA没有明显差异;其中,miR-21在6种肿瘤细胞表达水平均较高,miR一125b表达水平均较低,let-7不同亚型在6种细胞系中表达水平较低;miR-17-5p和miR一20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞中的表达水平高于其他细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA表达谱聚为一类.Northern blotting检测到miR-17-5p及其前体在K562细胞中均见表达,A549和ES-2细胞中只见较弱的前体表达,MCF-7、HeLa和HT-29中可见明显的前体和较弱的成熟miRNA的表达.RT-PCR检测到miR-17-5p前体在K562细胞中表达水平高于其他几种细胞,在ES-2细胞中的表达量低于K562细胞,同时高于另外4种细胞;miR-21在6种肿瘤细胞中表达水平均较高,在A549细胞中表达高.结论:应用生物芯片技术检测肿瘤细胞中miRNA的表达差异为进一步探索miRNA与肿瘤间的关系奠定基础.
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血管外膜肌成纤维细胞分化的基因表达谱
我们以往的研究表明,TGF-β1可以诱导血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts,AFs)向肌成纤维细胞(myofibroblasts,MFs)分化.为寻找可能涉及MF分化的基因,本实验采用寡核苷酸芯片技术动态检测细胞表型转化过程中基因表达的变化,实时定量RT-PCR验证芯片结果.在芯片上的15 866条总探针组中,2 121个探针组在TGF-β1刺激后至少一个时间点的表达发生2倍以上变化,其中1 318个基因表达上调,761个基因表达下调,还有少数基因(42个)在不同的时间点既有上调又有下调表达.在1 231个已知功能基因中,分泌磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,APP1)、Rho-associated coiled-coil forming kinase 2(ROCK2)的表达趋势与标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的表达趋势相同,TGF-β1诱导MF分化过程中上调了电压门控性钾通道Shal家族成员2(potassiumvoltage-gated channel,Shal-related family and member 2,KCND2)的表达,这些基因参与了MF的分化;此外,还发现内皮素1(endothelin 1,EDN1)、补体成分、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)和NAD(P)H dehydrogenase,quinone 1(NQO1)可能参与了MF分化.本实验用寡核苷酸芯片技术验证了通过其它技术证实的同MF分化相关的基因,并发现了新的涉及该过程的基因,基因表达谱研究有利于鉴定参与细胞分化的基因和通路.
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寡核苷酸芯片杂交技术对HBV DNA分型的研究
目的建立单碱基延伸(SBE)标记靶序列的方法,解决目前寡核苷酸芯片存在的空间障碍、特异性差、重复性差等问题.方法利用不同的方法标记靶序列或把已标记好的长片段靶序列片段化后,与寡核苷酸芯片进行杂交分析.结果用两种方法检测HBV DNA及分型,得到了相同的结果.结论以单碱基延伸(SBE)标记靶序列的方法重复性好,适用于病毒基因的检测及分型.
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利用基因芯片技术检测BRAF基因在胰腺癌组织中的表达
目的:研究BRAF基因在正常胰腺与胰腺癌组织中表达的情况.方法:收集正常胰腺组织3例以及胰腺癌手术切除标本6例,后者均经病理学检查证实;用TRizol法对组织进行总RNA抽提,采用无RNA酶的DNA酶Ⅰ等方法进行纯化;通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及Lab-on-chip对总RNA进行质控;利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达,并且应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术加以验证.结果:总RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.8～2.0之间;琼脂糖凝胶电泳18 s和28 s电泳条带清晰,且28 s和18 s亮度之比≥2;Lab-on-chip检测显示18 s和28 s双峰比例及位置均正常,无降解杂峰出现.芯片杂交扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比;Ratio分析表明,BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调(Cy3/Cy5＞2.0).RT-PCR验证了胰腺癌组织中BRAF mRNA表达上调.结论:BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调,其在胰腺癌发生发展过程中的作用机制还有待于进一步探讨.
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MicroRNA在六种不同器官肿瘤细胞系中的差异表达
[目的]利用生物芯片技术分析microRNA(miRNA)在六种不同器官肿瘤细胞系中microRNA(miRNA)的表达差异.[方法]将210个(206个miRNA,4个阳性对照)与已知人类和小鼠miRNA互补的序列作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片.提取肿瘤细胞(HeLa、MCF-7、A549、HT-29、ES-2、K562)的miRNA,用荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交.用ScanArrayTMExpress1.0手1描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果.并用Northern blot和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证.[结果]芯片检测到在六种不同器官肿瘤细胞系中,发现115种miRNA存存差异,91种miRNA没有明显差异.其中,miR-21在六种肿瘤细胞表达水平均较高,miR-125b表达水平均较低,let-7在六种细胞系中表达水平较低.miR-17-5p和miR-20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞系巾的表达水平高于其它细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA的表达谱聚为一类.[结论]应用生物芯片技术检测细胞中miRNA的表达差异谱是可行的,miRNA可能参与肿瘤的发生发展.
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人线粒体 DNA 基因表达谱芯片的制备及鉴定
研制人线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）表达谱芯片，鉴定芯片的特异性和稳定性，完善芯片的制备和使用程序，优化实验参数，为线粒体功能研究提供物质基础及技术保障。以人 mtDNA 剑桥序列为标准，设计 mtDNA 编码的13种 mRNA、2种 rRNA 和9种 tRNA 基因及蛋白产物定位于线粒体的核 DNA （nDNA）编码的5种凋亡相关基因寡核苷酸探针。芯片点样仪点制芯片，进行荧光显示和洗脱，用其检测人宫颈癌上皮 Hela 细胞和人肾小管上皮 Hc1细胞 cDNA 文库 mtDNA 编码基因及 nDNA 编码凋亡相关基因的差异表达情况。所点制的芯片扫描结果显示，样点分布均匀、清晰，规整度好，无漏点、连点。cDNA 文库杂交鉴定结果显示，整张芯片荧光信号均匀一致，背景清晰，各基因重复样点杂交结果一致，各质控点能正常显示。成功制备了人 mtDNA 基因表达谱芯片，完善了该芯片的制备和使用程序，通过初步应用，证明所研制的人 mtDNA 基因表达谱芯片具有特异性高、稳定性好等优点，可用于不同组织或细胞样本 cDNA 文库 mtDNA基因的差异表达分析。
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利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒
目的:利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒.方法:根据序列Blast比对分析结果,设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针.采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA,经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交,杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析.结果:SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号,具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一.结论:寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒.
关键词： 严重急性呼吸综合征 逆转录-不对称聚合酶链反应 寡核苷酸芯片 -
肝癌组织中KLF4的表达及意义
目的 探讨Kruppel样因子4(KLF4)在肝细胞癌(简称肝癌)中的表达及意义.方法 应用寡核苷酸基因芯片、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学技术检测KLF4在健康人、肝硬化及肝癌组织中的表达,并分析KLF4与肝癌临床病理特征的关系.结果 寡核苷酸基因芯片分析,KLF4在肝癌差异表达基因谱中明显下调(Ratio=0.438);RT-PCR及免疫组织化学方法证实,KLF4在肝癌中低表达,其表达缺失与病理学分级显著相关.结论 KLF4在肝癌组织中的低表达与肿瘤分化程度密切相关.
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CYP1A1、GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性的关系
目的 探讨CYP1A1 m1、m2位点和GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性的关系.方法采用病例对照研究方法和寡核苷酸芯片技术对110例山东汉族肺癌患者和125例正常对照者的基因组DNA进行CYP1A1、GSTM1基因多态性分析.结果 CYP1A1 m2位点、GSTM1基因型分布在肺癌组和对照组间存在统计学差异(P<0.05);携带CYP1A1 Val/Val基因型或GSTM1缺失基因型者患肺癌的危险性增高,其中吸烟个体患肺癌的风险进一步增加.结论 CYP1A1 m2位点和GSTM1基因多态性可能与肺癌发生有关,吸烟与CYP1A1、GSTM1基因具有协同作用.
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寡核苷酸芯片技术检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌的研究
目的:建立肠杆菌科食源性感染常见致病菌的快速检测方法.方法:选带正电荷的尼龙膜作为寡核苷酸芯片载体,采用寡核苷酸芯片技术对肠杆菌科食源性感染常见致病菌进行检测和鉴定.结果:在同一条件下运用多重PCR扩增出14种(属)细菌的16S rRNA、23S rRNA基因片段,随后应用寡核苷酸芯片技术对致病菌进行检测得到了相应的特异性杂交图谱.结论:建立的寡核苷酸芯片技术可快速检测肠杆菌科食源性感染常见致病菌,为食源性感染的快速诊断与预防奠定了良好的基础.
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实时荧光定量RT-PCR和寡核苷酸芯片方法分析食管腺癌组织中基因的表达
目的 采用实时荧光定量RT-PCR和寡核苷酸芯片技术分析食管腺癌基因表达的特征.方法 应用寡核苷酸芯片筛选6例食管腺癌基因表达谱,实时荧光定量RT-PCR验证其中8个基因的表达变化.结果 2倍差异表达基因(DEGs)中,上调基因共212个,下调基因共126个;涉及细胞周期相关基因、信号转导相关基因、血管生成相关基因、细胞增殖相关基因、凋亡抑制基因、抑癌基因、黏附和代谢等.实时荧光定量RT-PCR和寡核苷酸芯片技术对8个基因的检测结果一致,不仅变化方向相同,而且表达值非常接近.结论 食管腺癌的发生、发展涉及多基因多步骤,是一个复杂的过程.寡核苷酸芯片和实时荧光定量RT-PER分析基因表达变化都是可信的,基因芯片筛选基因表达谱具有高通量大规模的特点,而实时荧光定量RT-PCR则适合单个基因表达变化的研究,两者互为补充和印证.
关键词： 食管腺癌 寡核苷酸芯片 基因表达谱 实时逆转录多聚酶链反应 -
肝硬化和肝癌差异基因表达的对比研究
目的利用寡核苷酸芯片筛选肝硬化和肝癌的差异基因表达,并对比研究其共同阳性基因在肝癌中的作用.方法应用含有18 993个已知基因的Affymetrix U133plus 2.0芯片,对从肝癌、肝硬化及正常肝组织抽提并纯化标记的mRNA进行芯片杂交,GenePix 4000A荧光激光扫描系统对芯片进行扫描,GenePix Pro 3.0分析软件处理杂交信号获取结果.Northern印迹技术检验芯片分析结果的可靠性.结果芯片分析结果具有可重复性.肝硬化表达差异基因为118个,其中上调表达基因数为63,下调表达基因数为55.肝癌表达差异基因为1455个,其中上调表达基因数为761,下调表达基因数为694.在肝硬化上调表达的基因中,25个基因继续在肝癌中上调表达,2个基因下调表达,36个基因在肝癌中阴性表达;在肝硬化下调表达的基因中,36个基因继续在肝癌中下调表达,1个上调表达,18个在肝癌中阴性表达.结论利用寡核苷酸表达谱芯片,能够快速筛查出肝癌及肝硬化相关基因.有多个在肝硬化中异常表达的基因持续在肝癌中表达,这可能是肝硬化癌变的分子基础.
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k-ras基因寡核苷酸芯片的研制及在胰腺癌组织中检测应用研究
目的 建立ras基因寡核苷酸芯片对胰腺癌基因突变的检测系统.评估16例胰腺癌组织k-ras基因12、13、61位密码子变突检测.方法 采用双重或单独不对称PCR扩增标本中的目的 DNA.扩增产物加杂交液后与芯片进行杂交、清洗、扫描.结果 16例胰腺癌组织中k-ras为75%,突变都发生在12密码子,k-ras以12密码子第2位核苷酸突变发生率高(8/12).结论 k-ras基因芯片系统具有高度的灵敏性和准确性、快速简便、自动化程度高等优点,可同时检测胰腺癌k-ras多个突变位点基因,有利于临床应用.
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发囊基因芯片法和血样单克隆抗体法在HLA-Ⅱ类分型中的比较研究
目的同步双盲法研究单克隆抗体法和基因芯片法在HLA分型中的准确性、重复性和实用性.方法研究样本46份,单克隆抗体法采用一步法单抗分型技术,基因芯片法采用寡核苷酸芯片技术.结果46份标本的单克隆抗体法和基因芯片法分型成功,对有差异的结果进行基因芯片法复查,重复率100%.单克隆抗体法耗时1.5 h,基因芯片法耗时3.5 h.基因芯片法的漏检率低于单克隆抗体法.两种方法主要在对DR2(DR15,DR16)的检测结果上不一致.结论目前HLA-Ⅱ类抗原的分型,尤其是临床大样本分型,可以采用单克隆抗体分型技术进行快速分型.对于要求精细配型的骨髓移植,应该采用基因芯片分型或其他DNA分型技术.对于单克隆抗体分型结果可疑的样本应用基因芯片分型确认.
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寡核苷酸芯片技术在胰腺癌诊断中的应用
目的探讨基因突变寡核苷酸芯片技术检测K-ras基因与p53基因突变在胰腺癌诊断中的价值.方法应用芯片技术检测25例胰腺癌和5例慢性胰腺炎患者外周血浆游离DNA和组织标本中K-ras基因与p53基因突变.结果胰腺癌病人外周血血浆游离DNA中K-ras基因突变率为52.0%,p53基因突变率为20.0%;联合检测阳性率为60.0%,肿瘤组织标本中K-ras基因突变率为76.0%,p53基因突变率为32.0%,联合检测阳性率为92.0%.结论寡核苷酸芯片技术能够为胰腺癌的相关基因分析提供可靠的数据,检测K-ras基因突变有助于胰腺癌早期诊断,联合检测p53基因突变可提高诊断的敏感性和特异性.
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基于GenMAPP的气道变应性疾病基因芯片实验差异基因的功能路径分析
目的:利用生物信息学方法对变应性鼻炎并发哮喘机制进行初步探讨.方法:利用GenMAPP软件对季节性变应性鼻炎(SAR)与SAR并发哮喘患者鼻黏膜组织Affymetrix寡核苷酸芯片表达谱结果进行分析.首先筛查差异表达基因,然后对差异基因做数据库检索,并对其生物路径进行分析.结果:在38500多个基因中(47000个转录本中),SAR并发哮喘者,其鼻黏膜发生4倍以上差异表达的基因共有689个,其中有233个基因表达上调,456个基因表达下调.MAPPfindder分析示这些差异表达基因参与了69条生物路径.其中细胞因子与细胞因子受体间作用路径中差异表达基因多,且在此路径中趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在变应性鼻炎并发哮喘患者中较单纯变应性鼻炎患者表达均发生显著上调.结论:变应性鼻炎及其并发哮喘过程中许多生物路径参与此过程,其中CXCL12/CXCR4相互作用构成的反应轴在气道变应性疾病中发挥着重要作用.
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样品制备与扩增条件对寡核苷酸芯片杂交结果的影响
目的以HLA-A小阵列检测芯片为平台,确定HLA-A寡核苷酸芯片检测中优化实验条件.方法观察了样品制备方法(传统酚-氯仿法、白细胞裂解液法、Fe2O3纳米磁珠)、不对称PCR制备ssDNA的参数、PCR产物纯化方法对杂交结果的影响.结果3种不同的基因组提取方法均获得良好的特异性PCR扩增结果,纳米磁珠应用于样品提取和PCR扩增获得成功,实验条件需进一步完善;在不对称PCR佳实验条件为反向引物与正向引物浓度比25:1,正向引物浓度为0.04 μmol/L,PCR灵敏度可达ng(纳克)模板DNA,Qiagen纯化试剂盒效果略强于其它两种,但差异无显著性.结论本研究初步探讨HLA-A生物芯片样品制备条件,并取得理想结果,为寡核苷酸生物芯片的实际操作提供一定的参考和指导.
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非荧光法与荧光法芯片检测细菌感染的研究
目的研制一种用于快速检测急症常见感染细菌的芯片反应系统.方法应用生物信息学技术,设计检测细菌的探针和聚合酶链反应扩增引物,探针点制成寡核苷酸芯片,待测样本经扩增并标记生物素或CY5荧光素后与芯片杂交,再经链酶亲和素-碱性磷酸酶显色反应后,获得肉眼可见的杂交信号,或通过荧光检测仪读出样本的检测结果.结果建立了针对临床急症患者标本的非荧光法与荧光法芯片检测系统,芯片的检测灵敏度(大肠埃希菌)为10～100 CFU/反应体系.结论两种方法不仅能快速、灵敏地检测靶细菌感染,且重复性好、信号强及不易出现非特异信号.生物素酶联显色芯片法由于更为经济、简便而有重要的临床价值.
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应用基因芯片技术筛查肠型胃癌发生发展中差异基因表达的研究(四)
目的 应用寡核苷酸芯片研究胃正常组织、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎伴非典型性增生和肠型胃癌黏膜的基因表达谱,筛选肠型胃癌发生相关基因.方法 利用激光切割显微捕获联合基因芯片研究胃正常黏膜组织与慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎伴非典型性增生和肠型胃癌黏膜组织研究肠型胃癌发展中的差异基因表达谱.结果 在慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎伴非典型性增生和肠型胃癌黏膜组织中,筛选出共同差异基因109个,其中有61个基因持续上调表达,48个基因持续下调表达,包括细胞信号传导、细胞周期相关基因、代谢酶类相关基因、细胞信号和传递蛋白、细胞外基质基因、原癌基因、抑癌基因、细胞黏附分子、生长因子、免疫相关基因、细胞骨架和运动相关蛋白、凋亡相关基因和肿瘤相关抗原等.将各组筛选出的基因进行聚类并结合各组临床病理资料统计分析后发现一些表达上具有特征意义的基因.其中ALDOB下调、CDX2和MUC2上调与Hp感染和肠化之间存在关联;Bin-1、hTERT、PTTG和COX2上调,TFF3下调与肠上皮化生和不典型增生具有相关性;Bim-1、PGA5、HAP1、STS和LIPF表达改变与胃癌Borrmann分型、Hp感染阳性率和淋巴结转移数目等存在关联;在慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎伴非典型性增生和肠型胃癌黏膜共同差异基因中聚类分析并结合临床资料分析发现,ALDOB和TFF3表达下调与肠上皮化生具有负相关性,hTERT、COX-2和hMSH2上调和上皮非典型增生具有正相关. 结论基因表达谱芯片能够快速筛选出肠型胃癌发生癌相关基因,有多种基因共同参与肠型胃癌发生的整个过程.
