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金雀异黄素对巨噬细胞RAW 264.7 增殖、形态和细胞周期的影响
目的 研究金雀异黄素对巨噬细胞RAW 264.7增殖、细胞形态及细胞周期的影响,以探讨其对免疫系统的作用.方法 以鼠源巨噬细胞系RAW 264.7为细胞模型,将金雀异黄素用二甲基亚砜(DMSO)溶解,再用培养液稀释成所需终浓度为12.5、25、50、100μmol·L-1的4组及溶剂对照组(DMSO体积含量比低于0.1%).通过WST-1细胞增殖实验、倒置相差显微镜及流式细胞仪分别检测金雀异黄索对巨噬细胞的增殖、细胞形态及细胞周期的影响.结果 金雀异黄素对巨噬细胞的影响呈时间和剂量依赖关系.56~100 μmol1·L-1浓度的金雀异黄素作用巨噬细胞24 h和48 h后均能抑制细胞增殖,细胞增殖率分别为77%～81%、58%~73%(P<0.01);并能影响细胞形态改变,表现为细胞体积增大,并形成较长伪足.流式细胞结果 显示,该浓度金雀异黄素可将巨噬细胞阻滞在S-G2/M期.结论 金雀异黄索能抑制巨噬细胞细胞增殖,影响巨噬细胞形态,可能与干扰细胞周期有关.
关键词： 金雀异黄素 巨噬细胞RAW264.7 细胞增殖 细胞周期 -
TLR4抗体对姬松茸多糖作用巨噬细胞产生细胞因子的影响
目的 研究TLR4抗体对巴氏蘑菇多糖(Agaricus blazei Murrill polysaccharide,ABPS)对体外巨噬细胞RAW264.7产生细胞因子白介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-β(IFN-β)的影响.方法 相同浓度ABPS及脂多糖(LPS,阳性对照)作用巨噬细胞RAW264.7 3 h、6h、12h、18h和36h;不同浓度ABPS及LPS作用巨噬细胞RAW264.7 24 h;TLR4抗体作用巨噬细胞RAW264.7 1 h后,更换含有ABPS和LPS的细胞培养液作用24h.收集细胞培养上清,采用ELISA法检测细胞培养上清细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-β的含量.结果 ABPS作用巨噬细胞RWA264.7 24 h后,细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IFN-β含量明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P＜ 0.01),但显著低于LPS组.在一定浓度范围内,细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IFN-β的含量随ABPS浓度增大而增大,浓度为1000 μg/ml时IL-1β、TNF-α、IFN-β含量达到大.TLR4抗体处理的巨噬细胞RAW264.7经ABPS和LPS作用,IL-1β、TNF-α、IFN-β含量低于未处理组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TLR4抗体能够一定程度抑制ABPS作用巨噬细胞RAW264.7产生IL-1β、TNF-α、IFN-β,推测ABPS可能通过TLR4受体信号转导通路影响三种细胞因子的释放.
关键词： 巴氏蘑菇多糖 巨噬细胞RAW264.7 TLR4抗体 细胞因子 -
转录因子Foxo1对RAW264.7细胞迁移产生的影响
目的 观察Foxo1基因过表达对鼠源性单核巨噬细胞RAW264.7中单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 及其受体CCR2表达的影响, 探讨转录因子Foxo1在早期心血管疾病识别及预防中的作用.方法 实验分为未转染的对照组、Foxo1基因转染组及空质粒转染组, Foxo1基因转染组的转染方法为:运用脂质体转染方法将pc DNA-Foxo1真核表达载体瞬时转染至RAW264.7细胞中.空质粒转染组的转染方法为:运用脂质体转染方法将pc DNA-3.1质粒瞬时转染至RAW264.7细胞中.通过Western blot检测细胞中Foxo1的过表达情况.采用实时定量聚合酶链反应 (RT-PCR) 及蛋白免疫印迹法分别检测各组细胞中MCP-1及CCR2的表达情况.采用transwell小室法检测各组细胞的迁移能力.结果 pc DNA-Foxo1重组质粒转染48 h后, RAW264.7细胞中Foxo1蛋白的表达量为 (1.812±0.067), 明显高于空质粒转染组的 (1.092±0.088) 和未转染组的 (1.107±0.095), 差异均有统计学意义 (均P＜0.05) .Foxo1基因转染组RAW264.7细胞中MCP-1 mRNA表达量为 (3.331±0.587), 明显高于空质粒转染组的 (1.125±0.114) 和未转染组的 (1.121±0.065), 差异均有统计学意义 (均P＜0.05) .Foxo1基因转染组RAW264.7细胞中MCP-1蛋白的表达量为 (2.670±0.117), 明显高于空质粒转染组的 (1.128±0.107) 和未转染组的 (1.037±0.096), 差异均有统计学意义 (均P＜0.05) .Foxo1基因转染组RAW264.7细胞中CCR2的mRNA的表达量为 (2.099±0.331), 明显高于空质粒转染组的 (1.027±0.095) 和未转染组的 (1.018±0.177), 差异均有统计学意义 (均P＜0.05) .计数Transwell小室膜下表面细胞数, 结果显示Foxo1基因转染组RAW264.7细胞穿过小室的数量为 (39.670±2.333) 个, 明显高于未转染组的 (22.000±2.309) 个, 差异有统计学意义 (P＜0.05) .结论 转录因子Foxo1过表达通过促进MCP-1及CCR2的表达从而增强RAW264.7细胞的迁移, 参与巨噬细胞的炎症反应, 推测Foxo1在心血管疾病早期识别及预防中具有重要作用.
关键词： 转录因子Foxo1 巨噬细胞RAW264.7 受体CCR2 细胞迁移 心血管疾病 -
补充生物活性肽QRPR对巨噬细胞RAW264.7抵御脂多糖刺激的作用
目的 研究补充生物活性肽QRPR(Gln-Arg-Pro-AH)对巨噬细胞RAW264.7抵御脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激的作用.方法 用不同浓度的UPS刺激RAW264.7细胞不同时间,ELISA法测定细胞培养上清中细胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的浓度,确定LPS刺激RAW264.7细胞的适浓度和时间,建立RAW264.7细胞抵御LP刺激模型.采用ELISA法测定QRPR肽对RAW264.7细胞抵御LPS刺激时IL-6和TNF-α表达量的影响.MTS法检测QRPR肽对RAW264.7细胞的毒性作用.结果 100 ng/mL LPS诱导16 h为刺激RAW264.7细胞验证QRPR肽调节作用的佳浓度和时间.QRPR肽可以抑制RAW264.7细胞受LPS刺激后IL-6和TNF-α的产生,QRPR肽浓度为250 μmol/L时,其降低LPS刺激产生IL-6和TNF-α的能力强.QRPR肽本身对RAW264.7细胞的生长既无促进作用,也无毒性和抑制作用.结论 补充活性肽QRPR对巨噬细胞RAW264.7抵御LPS刺激具有积极的调节作用.
关键词： 活性肽QRPR 巨噬细胞RAW264.7 脂多糖 -
金雀异黄素对脂多糖诱导RAW264.7细胞分泌功能的影响
目的:研究金雀异黄素对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7分泌功能的影响,探讨金雀异黄素抗炎作用及其机制,为临床应用提供理论基础.方法:用脂多糖诱导巨噬细胞株Raw264.7建立体外细胞炎症模型,金雀异黄素与巨噬细胞株Raw264.7温孵1h后,加入100ng·mL-1脂多糖以诱导巨噬细胞的活化,采用Griess试剂检测细胞培养液中NO的含量,通过双抗体夹心酶联分析法和细胞转染技术观察不同浓度金雀异黄素对脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10含量及对核转录因子NF-κB和AP-1表达的影响.结果:金雀异黄素(4～111μmol L-1)能明显抑制脂多糖刺激巨噬细胞生成一氧化氮产生(P<0.05);显著抑制脂多糖诱导巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10(P<0.01),并能抑制核转录因子NF-κB和AP-1的表达.结论:本实验证明了金雀异黄素有抗炎作用,其能显著降低脂多糖诱导巨噬细胞分泌NO及细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的释放,通过抑制这些炎症因子的释放来达到抗炎作用,金雀异黄素抑制核转录因子NF-κB和AP-1的表达来实现的.
关键词： 金雀异黄素 脂多糖 巨噬细胞RAW264.7 一氧化氮 细胞因子 NF-κB和AP-1 -
脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成
目的 构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程.方法 根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1 /LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布.结果 成功构建真核表达质粒pEGFP-C1 /LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果 显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加.结论 成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成.
关键词： 巨噬细胞RAW264.7 微管相关蛋白1轻链3 绿色荧光蛋白 -
载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用
目的 构建小鼠巨噬细胞半乳糖特异性凝集素(GSL)靶向的RNAi质粒载体,研究其对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的沉默作用.方法 根据GSL核苷酸序列,合成3条特异性双链小干扰RNA(siRNA)分子,退火形成双链,分别连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen Vector,转化大肠杆菌得到阳性克隆,经测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BALB/c小鼠,应用实时定量PCR和免疫组化法评价siRNA载体对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的抑制作用.结果 siRNA载体对小鼠体内GSL基因的抑制率为84-96%,对巨噬细胞GSL基因的抑制率可达61.98%～83.02%. 结论构建的siRNA载体能有效抑制目的 基因在体内外的表达, 该结果为分析半乳糖特异性凝集素在布鲁氏菌侵染过程中的功能奠定了基础.
关键词： RNAi 半乳糖特异性凝集素 巨噬细胞RAW264.7 小鼠 -
不同剂量异鼠李素对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响及其机制探讨
目的 观察异鼠李素(ISO)对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响,并探讨其机制.方法 取对数生长期RAW264.7细胞,将细胞分为5组,低、中、高剂量组分别加入已经配好含10 ng/mL脂多糖(LPS)及低、中、高剂量ISO(50、100、200 μg/mL)的溶液,模型组加入含10 μg/mL LPS的1640培养基(含10％ FBS),对照组加入含10％溶剂对照的1640完全培养基.测算各组细胞增殖指数,检测各组一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-αt).结果 与对照组比较,模型组细胞12、24、36、48 h细胞增殖指数增加(P均＜0.05);与模型组比较,低剂量组24、36 h及中剂量组和高剂量组12、24、36、48 h细胞增殖指数减少(P均＜0.05);与低剂量组比较,中剂量组24h及高剂量组24、48 h细胞增殖指数减少(P均＜0.05).与对照组比较,模型组NO、TNF-α水平升高(P均＜0.05);与模型组比较,低剂量组NO水平及中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均＜0.05);与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低(P均＜0.05).结论 ISO可抑制RAW 264.7细胞增殖能力,且呈剂量依赖性,高剂量作用大;机制可能与抑制NO、TNF-α有关.
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小鼠巨噬细胞体外吞噬功能方法比较
目的 比较巨噬细胞吞噬功能常用方法(乳胶颗粒)与吞噬真菌病原体、中性粒细胞的异同.方法 取小鼠巨噬细胞分别与乳胶颗粒、灭活真菌孢子、中性粒细胞共培养,在2h、4h、6h、8h时分别计数巨噬细胞总数及吞噬异物的细胞数、每视野被吞噬异物数.计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数.结果 在8h时,巨噬细胞对灭活真菌孢子的吞噬率,为22.73％,中性粒细胞次之,为18.75％,乳胶颗粒低,为12.50％,各组与2h相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);与乳胶颗粒组相比,各时间点差异有统计学意义(P＜0.05).在8h时,巨噬细胞对灭活真菌孢子的吞噬指数为0.30,中性粒细胞为0.21,乳胶颗粒为0.14,各组较2h相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);与乳胶颗粒组相比,2h、6h、8h差异有统计学意义(P＜0.05),4h差异无统计学意义(P＞0.05).结论 小鼠巨噬细胞对乳胶颗粒、灭活真菌孢子、中性粒细胞的吞噬能力不同.因此单纯使用乳胶颗粒作为指标来评价巨噬细胞的吞噬能力是不准确、不全面的.
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金沙藤乙酸乙酯提取物对小鼠巨噬细胞炎症因子的影响
目的:研究金沙藤乙酸乙酯提取物(EHL)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎症因子的影响,并探讨其抗炎作用机制.方法:取RAW264.7细胞,分为空白对照组、LPS刺激组、地塞米松干预组、EHL低、中、高剂量组,采用MTT法测定EHL对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响;Griess法测定NO的释放量;ELISA法检测TNF-α、IL-6的分泌水平.结果:EHL能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、IL-6,且呈剂量依赖性.结论:EHL具有体外抗炎作用,其机制可能与抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的分泌有关.
关键词： 金沙藤乙酸乙酯提取物 巨噬细胞RAW264.7 TNF-α IL-6 抗炎 -
佛波酯对LPS/IFN-γ诱导的巨噬细胞活性氧产生的影响
目的 研究佛波酯(PMA)对脂多糖/γ-干扰素(LPS/IFN-γ)诱导的巨噬细胞RAW264.7活性氧产生的影响.方法 于实验前0、3、6、9、12、18 h,用1 μg/mL的LPS和100 U/mL IFN-γ诱导处于对数生长期的RAW264.7细胞,采用蛋白质印迹技术检测细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的表达;对经LPS/IFN-γ诱导12 h的RAW264.7细胞加入终浓度为200 ng/mL的PMA,应用激光共聚焦显微技术观察RAW264.7细胞中活性氧的产生.结果 LPS/IFN-γ可使RAW264.7细胞的诱导型iNOS表达增加,同时PMA可刺激经LPS/IFN-γ诱导后的RAW264.7细胞产生呼吸爆发,细胞的荧光强度较未刺激组增强(P<0.01).结论 PMA可促使经LPS/IFN-γ诱导的RAW264.7细胞产生大量活性氧.
关键词： 佛波酯 可诱导型一氧化氮合酶 巨噬细胞RAW264.7 活性氧 -
12味止血中药对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化碳的抑制作用
目的:研究12味止血中药对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的抑制作用,并探讨其止血机制.方法:以1μg·mL-1 LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7,22h后以Griess法测定NO的终产物亚硝酸盐的含量,观察LPS对NO生成的影响.结果:12味止血药均可抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7中NO的生成.三七、地榆、仙鹤草、槐花、艾叶、蒲黄、侧柏叶及白茅根的抑制作用显著(P＜0.05).结论:本实验为12味止血中药对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生NO的抑制作用提供了一定的理论依据.
关键词： 止血中药 脂多糖 一氧化碳 巨噬细胞RAW264.7 -
insig-1基因siRNA干扰质粒的构建及对炎症状态下细胞胆固醇代谢的影响
目的 构建针对insig-1 基因的siRNA 表达载体,观察其对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇代谢的影响.方法 根据insig-1核苷酸序列,设计并构建针对insig-1 基因mRNA的3个特异性siRNA表达载体(si-1、si-2、si-3)和1个无同源性的阴性对照载体(si-nc),经酶切和测序鉴定确认 siRNA 载体构建成功后,转染RAW264.7小鼠巨噬细胞,RT-PCR、免疫组化法检测insig-1 基因的表达,筛选出佳抑制基因后,应用酶学方法 和油红O 染色观察炎症处理后RAW264.7细胞内胆固醇含量的变化.结果 经酶切证实,siRNA表达载体构建成功,RT-PCR、Western blot、免疫组化法显示与未转染组相比,si-1、si-2、si-3组RAW264.7细胞中insig-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),其中si-2干扰效果强.酶学方法 和油红O 染色结果 表明,炎症状态下细胞insig-1沉默后胆固醇的含量和油红O 颗粒增多.结论 成功构建了insig-1基因 siRNA干扰质粒,insig-1缺失对炎症状态下细胞胆固醇摄取有促进作用.
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巨噬细胞RAW264.7诱导共培养HL60细胞凋亡的实验研究
目的 研究巨噬细胞RAW264.7诱导共培养HL60细胞凋亡的作用机理.方法 用佛波脂(phorbol-1,2-myristate-1,3-acetate,PMA)、脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)诱导培养的巨噬细胞RAW264.7,并与HL60细胞共培养12h.采用MTT法、流式细胞计量术、DNA琼脂糖凝胶电泳及蛋白印迹技术,观察巨噬细胞与肿瘤细胞共培养体系中,RAW264.7细胞对HL60细胞的作用.结果 与巨噬细胞RAW264.7共培养的HL60细胞存活率减少,表现出凋亡细胞特有的标志,即“G1亚峰”和DNA梯状电泳条带,在这一过程中还伴随有促凋亡基因P53和P21表达.结论 诱导刺激巨噬细胞RAW264.7导致了共培养HL60细胞的凋亡.
关键词： 巨噬细胞RAW264.7 HL60细胞 共培养 凋亡 -
西他沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌的活性研究
目的 对西他沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌的活性进行体内外研究,从而更好地指导临床用药,降低细菌耐药性.方法 本研究选用金黄色葡萄球菌ATCC25923,采用微量肉汤稀释法检测药物的MIC,MBC及MPC；构建新型巨噬细胞RAW264.7细菌感染模型,检测体外药物的胞内外活性；构建药物胞内蓄积模型,采用HLPC检测胞内药物含量；构建小鼠腹腔巨噬细胞细菌感染模型,采用琼脂平板稀释法检测药物时间及浓度杀菌曲线.结果 在体外实验中,MIC,MBC,MPC及时间与浓度杀菌曲线实验表明西他沙星胞内外抑菌活性均强于莫西沙星；在体内试验中,结果表明细胞内药物活性取决于给药频率及药物浓度,同时得出药物胞内含量与胞内活性并非一致.通过药物时间与浓度胞内外杀菌曲线测定,得出西他沙星的抑菌活性强于莫西沙星.结论 体内外研究表明西他沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌的活性强于莫西沙星,能够更好的用于临床治疗.
关键词： 西他沙星 莫西沙星 巨噬细胞RAW264.7 金黄色葡萄球菌 -
实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用
目的 建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的Th1和Th2型细胞因子荧光定量PCR检测方法.方法 依据GenBank中小鼠的β-actin基因序列、Th1型及Th2型细胞因子的核苷酸序列设计特异性引物,以RAW264.7巨噬细胞mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测上述细胞因子转录水平的real-time PCR方法.结果 用建立的荧光定量PCR方法,检测牛型布鲁氏菌S2308株感染RAW264.7巨噬细胞后,巨噬细胞Th1和Th2型细胞因子的转录水平.低检测量为102拷贝/μL,线性关系很好,R2≥0.982,该方法具有良好的特异性和重复性.结论 成功建立了检测巨噬细胞中Th1和Th2型细胞因子转录水平的荧光定量PCR方法.
