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食管癌细胞株高侵袭力亚系的建立及其生物学特性研究
目的:建立具有不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系并研究其生物特性.方法:利用Transwell侵袭小室从人食管鳞癌Eca-109细胞株筛选高侵袭能力食管癌亚系,HE染色比较细胞形态；四甲基偶氯唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力的变化；流式细胞术( FCM)检测细胞周期；蛋白质印迹法检测与侵袭能力相关基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白醇组织抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表达.结果:利用Transwell侵袭小室从食管癌Eca-109细胞株中筛选出高侵袭能力食管癌细胞株亚系,命名为Eca-109 T4.2个细胞系细胞形态没有明显差异.MTT法检测显示,亚系Eca-109 T4增殖能力强.细胞周期显示,增殖指数(PI)高,PI=41.0％,且MMP-2蛋白表达相比增高,P=0.023;TIMP-2蛋白表达相比增高,但差异无统计学意义,P=0.392.结论:建立了不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系,将可以用于探讨食管癌转移机制的研究.
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CIP-13F抗肿瘤转移作用及机制的探讨
目的:研究APN抑制剂CIP-13F抗肿瘤侵袭转移及血管生成的作用机制,为药物开发和恶性肿瘤临床治疗奠定实验基础.方法:体外培养人卵巢透明细胞癌ES-2和人纤维肉瘤细胞HT-1080,应用L-亮氨酰对硝基苯胺底物法评价CIP-13F对APN酶活性的抑制作用,通过MTT比色评价CIP-13F对肿瘤细胞的生长抑制作用.以Transwell chamber法观察CIP-13F对ES-2细胞游走能力的抑制作用.体内建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,分别给药后取肿瘤组织和肺组织,应用免疫组织化学法检测Lewis肺癌组织中APN的表达水平.以免疫组织化学法检测CD34表达水平评价肿瘤微血管密度(MVD).结果:采用4、20、100和500 μmol/L CIP-13F作用于ES-2和HT-1080细胞发现,对ES-2细胞,APN的表达和生长抑制作用呈现剂量-效应相关性,对HT-1080细胞中APN和生长抑制作用较弱.另外,不同浓度的CIP-13F与ES-2细胞穿过人工基底膜的能力呈剂量依赖性关系.100和500 μmol/L的CIP-13F对肿瘤细胞穿过Matrigel的游走能力抑制率分别为42.0％和72.1％,P值分别为0.003和0.001.体内试验表明,Bestatin 100 mg/kg组、CIP-13F 50和100 mg/kg剂量的肿瘤生长抑制率分别为33.2％、29.4％和45.8％(P值分别为0.013、0.020和0.005),同时,与阴性对照组相比,50和100 mg/kg CIP-13F对Lewis肺癌肺转移抑制率分别为52.2％和81.3％(P值分别为0.001和0.000).另外,50和100 mg/kg CIP-13F作用下,Lewis肺癌组织的MVD值分别为18.6和14.9,与阴性对照组比较,MVD值均明显降低,P值分别为0.000和0.001.结论:环酰亚胺类肽化合物CIP-13F通过抑制APN活性,抑制肿瘤细胞的增殖和转移,进而抑制移植瘤鼠的腋部原发肿瘤灶的生长,降低肺继发转移灶的数目.CIP-13F用于治疗APN表达阳性的肿瘤有良好的应用前景.
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鼻咽癌咽旁间隙侵犯对预后的影响
目的:探讨鼻咽癌咽旁间隙受侵对预后的影响.方法:咽旁间隙的侵犯程度根据SO线(茎突到枕骨大孔中线后缘中点连线)进行划分,无咽旁侵犯记录为0级,SO线以前的咽旁侵犯记录为1级,SO线以后记录为2级.Kaplan-Meier法计算总生存率、无瘤生存率、无局部复发生存率和无远处转移生存率,Cox模型进行预后的多因素分析.结果:176例患者中,咽旁受侵的发生率为81.8%,其中1级为70.1%,2级为29.9%.咽旁间隙受侵与颈部淋巴结转移有明显相关性,χ2=8.185,P=0.004 0.咽旁受侵0、1和2级患者5年总生存率分别为90.2%、75.1%和51.2%,log-rank检验值为16.45,P=0.000 3;5年无瘤生存率分别为87.2%、71.5%和53.3%,log-rank检验值为10.87,P=0.004 4;5年无远处转移生存率分别是93.7%、82.2%和62.7%,logrank检验值为9.41,P=0.009 1.多因素分析显示,咽旁受侵不是独立的预后因素,但严重咽旁间隙侵犯是影响鼻咽癌总生存、无瘤生存及远处转移的独立预后因素.结论:咽旁侵犯应该根据程度进行划分,单纯咽旁侵犯的有无不能独立的影响预后,但根据咽旁侵犯程度进行分级后,严重的咽旁侵犯是影响总生存、无瘤生存和远处转移的独立预后因素.
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侵及胰腺晚期胃癌的外科治疗
回顾性分析我院1995年1月1日～2000年1月1日施行的晚期胃癌侵犯胰腺手术46例患者的临床资料.结果46例患者中,根治性切除26例,姑息性手术20例.其中胃次全切除加胰体尾部和脾切除11例,全胃切除加胰体尾部和脾切除9例,胃次全切除加胰十二指肠切除3例,全胃切除加胰十二指肠切除2例,胃次全切除加胰体尾部切除1例;姑息性胃大部分切除术11例,短路手术(胃空肠吻合)7例,探查活检加空肠造瘘术1例,单纯探查活检术1例.随访40例,术后1、3和5年生存率,根治手术组分别为65.2%(15/23)、30.4%(7/23)和13%(3/23),姑息手术组分别为35.3%(6/17)、11.8%(2/17)和0.根治手术组术后1、3和5年生存率明显高于姑息手术组,x2=4.62,P=0.030.初步研究结果提示,对晚期胃癌侵犯胰腺的患者,严格掌握手术适应证,选择合理的手术方式,注重患者围手术期的营养支持,这是降低并发症,提高联合胃胰切除手术成功率及远期生存率的重要因素.
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北京市住院女性浸润性乳腺癌HER-2受体状态特征分析
目的:探讨北京市住院女性浸润性乳腺癌人表皮生长因子受体-2(HER-2)状态特点以及与临床病理因素的相关性.方法:回顾性分析中国医学科学院肿瘤医院外科1997-03-2008-10收治的5 326例女性浸润性乳腺癌患者资料,HER-2采用免疫组化法检测, + + +定义为HER-2过表达.结果:全组HER-2过表达率为16.4%.雌激素受体(ER)阳性组HER-2过表达率为10.8%,阴性组为26.4%,P<0.001;孕激素受体(PR)阳性组过表达率为13.1%,阴性组为24.1%,P<0.001;单因素分析显示,组织学分化差、腋窝淋巴转移、肿瘤体积较大、病期较晚和年轻患者中HER-2过表达率较高,P＜0.05;多因素分析显示,ER、PR状况和组织学分化程度是影响HER-2表达的独立因素.结论:HER-2过表达者肿瘤侵袭性较强、病期较晚,HER-2过表达与多种因素有关.
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E6-AP基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中调节膜联蛋白A2的表达
目的：检测E6-AP基因及膜联蛋白A2( Annexin A2)在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达,探讨其对癌细胞增殖、凋亡及浸润转移的影响。方法设计1条无关序列Negative-siRNA作为阴性对照组和针对E6-AP基因的3条特异性E6-AP-siRNAs片段转染至MDA-MB-231细胞内作为实验组,未经处理细胞作为空白对照组,加入脂质体处理的细胞为脂质体组,利用RT-PCR检测干扰E6-AP后在MDA-MB-231细胞中 E6-AP 和 Annexin A2 mRNA 相对表达水平。选择出转染效率高的 E6-AP-siRNA1组及阴性对照组、空白对照组继续行后续实验。 Western blot 检测干扰 E6-AP 后 E6-AP 和Annexin A2在 MDA-MB-231细胞中的蛋白的相对表达水平。利用 CCK-8试剂盒法、流式细胞术、Transwell小室侵袭实验分别检测干扰 E6-AP 后 MDA-MB-231细胞的增殖、凋亡、侵袭能力。基因的mRNA及蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞数的组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD法,吸光度比较采用重复测量的方差分析。结果转染72 h后, E6-AP基因干扰后各实验组( E6-AP-siRNA1组、E6-AP-siRNA2组、E6-AP-siRNA3组)及空白对照组、阴性对照组及脂质体组中的E6-AP mRNA相对表达水平分别为0.159±0.003、0.325±0.006、0.229±0.007、0.593±0.031、0.594±0.012、0.612±0.016, Annexin A2 mRNA相对表达水平分别为0.929±0.017、1.013±0.082、0.992±0.024、1.341±0.037、1.323±0.010、1.326±0.012,差异均有统计学意义(F=850.792、417.447,P均<0.050)。转染72 h后,E6-AP-siRNA1组、空白对照组和阴性对照组中 E6-AP 及 Annexin A2蛋白相对表达水平为分别为0.271±0.017、0.492±0.018、0.477±0.016及0.447±0.034、0.887±0.022、0.849±0.033,组间差异均有统计学意义(F=256.850、350.149,P均<0.050)。转染24、48、72、96 h后,E6-AP-siRNA1组、阴性对照组和空白对照组间比较,不同时间点之间比较,细胞吸光度差异均有统计学意义( F=524.828, P<0.001；F=904.079,P<0.001)；分组与时间点存在交互作用(F=28.116, P<0.001)。转染72 h后,空白对照组、阴性对照组、E6-AP-siRNA1组的凋亡率分别为2.959±0.117、3.097±0.070、10.812±0.199,组间差异有统计学意义(F=3110.005,P<0.050)。 Transwell检测E6-AP-siRNA1组、空白对照组、阴性对照组中细胞穿透Matrigel胶到达Transwell下室的细胞数分别为99±5、96±6、62±7,组间差异有统计学意义(F=55.404,P<0.001)。结论干扰E6-AP基因可使Annexin A2表达下调,同时可诱导MDA-MB-231细胞的凋亡,其增殖、侵袭能力也受到抑制。
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阿司匹林对HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3侵袭和迁移能力的影响
目的 探讨阿司匹林对乳腺癌细胞SKBR3侵袭和迁移能力的影响.方法 先采用MTT法检测不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L)阿司匹林及DMSO(对照组)对SKBR3细胞生长抑制的影响.然后,将乳腺癌细胞SKBR3分为3组,即2.5 mmol/L阿司匹林组、10.0 mmol/L阿司匹林组和对照组(DMSO 处理),采用 Transwell 实验、划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力,实验重复3次.Transwell实验和划痕实验结果数据比较,采用单因素方差分析,组间两两比较采用 LSD 法.结果 MTT结果显示,随着阿司匹林浓度的增大,SKBR3细胞生长抑制明显增加,其半数抑制浓度(IC50)为7.91 mmol/L.Transwell实验显示,对照组侵袭细胞染色570 nm吸光度值为2.232 ±0.054, 2.5 mmol/L 组为1.648±0.069,10.0 mmol/L组为0.372±0.019,3组间相比,细胞侵袭能力的差异有统计学意义(F=338.1,P<0.001);并且,与对照组相比,2.5 mmol/L和10.0 mmol/L阿司匹林组细胞侵袭能力明显受到抑制(P均<0.001).划痕实验显示,24 h后对照组细胞迁移愈合率为(69.78±2.87)%, 2.5 mmol/L阿司匹林组为(50.16±3.10)%,10.0 mmol/L阿司匹林组为(16.08±2.10)%,3组间相比,细胞迁移能力的差异也有统计学意义(F=100.8, P<0.001);并且,与对照组相比,2.5 mmol/L 和10.0 mmol/L 阿司匹林组细胞迁移能力均明显受到抑制(P均<0.050).结论 阿司匹林能够抑制乳腺癌细胞SKBR3的侵袭和迁移能力.
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BTBD7基因通过作用于 Wnt/β-catenin 信号通路促进人乳腺癌 MCF-7细胞的侵袭转移
目的：观察敲减 BTBD7基因后人乳腺癌 MCF-7细胞的运动侵袭能力的变化,并探讨其作用机制。方法将经慢病毒转染 shRNA,敲减 BTBD7基因表达后的细胞作为实验组(MCF-7-shBTBD7),未进行慢病毒转染的细胞为对照组(MCF-7-vec)。应用划痕愈合实验、Transwell 侵袭实验、MTT 法绘制细胞生长曲线等方法来检测实验组和对照组内 MCF-7细胞的侵袭转移以及增殖能力之间的区别,两组试验结果比较采取独立样本 t 检验。在此基础上通过肿瘤信号通路筛选芯片筛选出 BTBD7作用的下游信号通路,并以 Western blot 实验验证这条信号通路是否确实参与其中发挥作用。结果划痕愈合实验结果显示,与对照组相比,实验组 MCF-7细胞的迁移能力显著降低[24 h 愈合率：(85．95±5．30)%比(43．38±4．01)%, t=18．108, P<0．001]；Transwell 侵袭实验显示实验组和对照组细胞侵袭能力出现明显的差别,与对照组相比,实验组细胞的侵袭能力显著降低(24 h 细胞计数：152±7比50±8,t =27．378, P<0．001)；MTT 实验显示从第4天开始两组细胞增殖能力出现差异,对照组细胞数为(3．17±0．23)×104/ ml,明显高于实验组的细胞数为(2．58±0．21)×104/ ml,差异具有统计学意义(t =3．189, P<0．050)；第7天对照组的细胞数为(9．57±0．36)×104/ ml,仍然显著高于实验组的细胞数(7．29±0．37)×104/ ml,差异具有统计学意义(t=7．654, P<0．050)。通过双荧光素酶检测系统检测肿瘤信号通路筛选芯片的结果表明 Wnt 信号通路的相对荧光强度在两组间差异有统计学意义(t =12．509, P<0．001),Western blot实验结果同样表明,与对照组相比,实验组的 c-Myc、MMP-7以及β-catenin 的蛋白水平均发生变化。结论 BTBD7基因可能通过作用于 Wnt/β-catenin 信号通路促进人乳腺癌 MCF-7细胞的侵袭转移。
关键词： 乳腺肿瘤 同源盒结构域蛋白质类 WNT 蛋白质类 肿瘤侵润 肿瘤转移 -
表皮生长因子受体在涎腺腺样囊性癌中的表达及其在肿瘤侵袭中的作用
目的 研究表皮生长因子受体(EGFR)在涎腺腺样囊性癌(SACC)中的表达,探讨EGFR的表达与SACC临床病理特征的关系及其在肿瘤侵袭中的作用.方法 收集54例SACC患者的临床病理资料,采用免疫组化SP法检测EGFR在SACC组织中的表达,分析EGFR表达与SACC临床病理特征的关系.结果 EGFR在SACC组织中的表达主要分布于细胞膜和细胞浆中.在54例SACC患者中,EGFR的阳性表达率为75.9％；而在正常涎腺组织中,EGFR表达不明显或仅在腺管周围的腺泡细胞内微量表达,阳性表达率为10.0％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).EGFR的表达与SACC的T分期、组织学类型、远处转移、淋巴结转移、神经侵犯有关(均P＜0.05).结论 EGFR在胞浆中的高水平表达可能在侵袭癌的进展中发挥重要作用,对其深入研究有望为腺样囊性癌的治疗带来新的策略.
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乳腺肿瘤间质重构中间质成纤维细胞的免疫表型转换及其临床意义
目的 探讨在乳腺疾病谱系发展过程中间质成纤维细胞免疫表型的转化及其临床意义.方法 采用免疫组织化学方法分别检测60例正常乳腺、46例乳腺导管上皮细胞不典型增生(ADH)、60例乳腺导管内癌(DCIS)、47例乳腺导管内癌微浸润(DCIS-MI)和60例乳腺浸润性导管癌(IDC)组织中间质成纤维细胞成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD34的表达.结果 正常乳腺组织中间质成纤维细胞的CD34、FAP-α和α-SMA阳性表达率分别为93.3％、6.7％和18.3％,ADH组织中间质成纤维细胞的CD34、FAP-α和α-SMA阳性表达率分别为95.7％、4.3％和10.9％,DCIS组织中间质成纤维细胞的CD34、FAP-α和α-SMA阳性表达率分别为95.0％、8.3％和15.0％,IDC组织中间质成纤维细胞的CD34、FAP-α和α-SMA阳性表达率分别为35.0％、85.0％和93.3％.正常乳腺、ADH和DCIS组织中间质成纤维细胞的CD34、α-SMA和FAP-α表达差异无统计学意义(x2=1.142,P=0.896),正常乳腺、ADH和DCIS组织的间质成纤维细胞免疫表型主要为CD34+ α-SMA-FAP-α-.IDC与正常乳腺、ADH和DCIS组织中间质成纤维细胞的CD34、α-SMA和FAP-α表达差异有统计学意义(x2=8.351,P＜0.001),IDC和DCIS-MI组织中间质成纤维细胞的免疫表型为CD34-α-SMA+ FAP-α+.结论 间质成纤维细胞CD34表型的丢失及α-SMA和FAP-α表型的获得可能是DCIS-MI浸润前沿间质改变的一项敏感指标,检测DCIS间质成纤维细胞免疫表型的转化将有助于判断DCIS是否已有微浸润,提高DCIS-MI诊断的准确率.
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抗菌肽hCAP 18／LL-37在卵巢癌微环境中的作用及表达调控机制
目的：探讨抗菌肽hCAP18／LL?37在卵巢癌微环境中的作用及表达调控机制。方法采用侵袭实验检测巨噬细胞对卵巢癌细胞SKOV3侵袭能力的影响。采用实时荧光定量PCR（ qRT?PCR）和Western blot检测hCAP18／LL?37和versican V1蛋白的表达。采用干扰质粒抑制 SKOV3细胞中versican V1的表达，分析巨噬细胞hCAP18／LL?37的表达及SKOV3细胞的侵袭能力。结果共培养组（SKOV3细胞与巨噬细胞共培养）的侵袭穿膜数为（112．8±17．1）个，高于SKOV3培养组[SKOV3细胞单独培养，（8．2±1．9）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。 hCAP18／LL?37中和抗体共培养组（SKOV3细胞、巨噬细胞和hCAP18／LL?37中和抗体共培养）的侵袭穿膜细胞数为（22．2±5．6）个，少于对照IgG共培养组[SKOV3细胞、巨噬细胞和对照IgG共培养，（100．6±25．2）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。与SKOV3细胞共培养后，巨噬细胞中 hCAP18／LL?37蛋白和 mRNA水平均升高，而在SKOV3细胞中无变化。与巨噬细胞共培养后，卵巢癌细胞中versican V1蛋白的表达和分泌均升高。干扰卵巢癌SKOV3细胞中versican V1的表达（ SKOV3ver－／－细胞）后，巨噬细胞中hCAP18／LL?37蛋白和mRNA水平均低于对照细胞株（ SKOV3ver＋／＋细胞）；与巨噬细胞共培养后，SKOV3ver－／－细胞的穿膜细胞数[（24．8±4．6）个]低于SKOV3ver＋／＋细胞[（104．6±16．0）个]，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论卵巢癌微环境中，巨噬细胞表达分泌的抗菌肽hCAP18／LL?37促进卵巢癌细胞的侵袭，其表达受到肿瘤细胞分泌的versicanV1蛋白调控。
关键词： 卵巢肿瘤 巨噬细胞 肿瘤侵润 hCAP18/LL-37 versican V1 -
沉默高迁移族蛋白B1基因抑制胃癌MGC-803细胞的侵袭转移
目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)抑制高迁移族蛋白B1(HMGB1)基因表达对胃癌细胞株MGC-803侵袭转移能力的影响及其作用机制.方法 设计、合成靶向HMGB1基因的siRNA,以脂质体为载体转染胃癌细胞株MGC-803.Transwell小室模型和划痕实验测定细胞侵袭及迁移能力,四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞对Matrigel基质胶的黏附能力,电泳迁移实验检测化学合成核因子κB(NF-κB)的活性,逆转录聚合酶链反应和Western blot方法检测HMGB1、基质金属蛋白酶9(MMP-9) mRNA和蛋白的表达.结果 HMGB1 siRNA可明显抑制MGC-803胃癌细胞株HMGB1mRNA和蛋白的表达.HMGB1 siRNA转染组细胞侵袭穿膜细胞的数量为(142.7±3.4)个/视野,与未转染组[(303.5±4.3)个/视野]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).HMGB1 siRNA转染组细胞迁移穿膜细胞的数量为(293.7±4.4)个/视野,与未转染组[(445.5±5.6)个/视野]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).HMGB1 siRNA转染组的细胞黏附率为(33.4±0.03)％,与未转染组[(57.4±4.2)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).HMGB1 siRNA转染组MGC-803细胞MMP-9 mRNA的相对表达水平(0.2±0.1)低于未转染组(1.4±0.4,P＜0.05).HMGB1 siRNA转染组细胞MMP-9蛋白的相对表达水平(0.4±0.1)低于未转染组(2.3±0.7,P ＜0.05).HMGB1 siRNA转染组NF-κB活性明显低于未转染组.结论 HMGB1基因沉默可有效抑制MGC-803细胞的侵袭转移,其机制可能与调控NF-κB的活性和MMP-9表达有关.
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中药松友饮对裸鼠体内化疗后残余肝癌的作用
目的 探讨中药松友饮对化疗后残余肝癌细胞侵袭转移潜能的影响及相关机制.方法 采用人肝癌MHCC97L细胞构建奥沙利铂化疗后的残余肝癌裸鼠原位移植模型.成瘤后,实验组裸鼠以2.1 g/kg、4.2 g/kg和8.4 g/kg的松友饮灌胃,对照组裸鼠灌服生理盐水,检测松友饮对化疗后残余肝癌生长、转移及对裸鼠生存时间的影响.结果 松友饮可有效降低化疗后残余肝癌的肺转移能力,对照组、2.1 g/kg松友饮治疗组、4.2 g/kg松友饮治疗组和8.4 g/kg松友饮治疗组裸鼠的肺转移率分别为86.7％(13/15)、73.3％(11/15)、40.0％ (6/15)和20.0％(3/15),与对照组比较,4.2 g/kg松友饮治疗组和8.4g/kg松友饮治疗组裸鼠肺转移率显著下降(P=0.021,P=0.001).松友饮可延长残余肝癌再接种裸鼠的生存时间,对照组、2.1 g/kg松友饮治疗组、4.2 g/kg松友饮治疗组和8.4g/kg松友饮治疗组裸鼠的生存时间分别为(53.83 ±4.71)d、(56.50 ±6.09)d、(66.67 ±5.61)d和(81.17±7.36)d,与对照组比较,4.2 g/kg松友饮治疗组和8.4 g/kg松友饮治疗组裸鼠生存时间延长(P =0.002,P=0.001).松友饮治疗后,残余肝癌组织的上皮-间质转化(EMT)现象显著减少,E-cadherin表达恢复,钙黏蛋白转换现象逆转.结论 松友饮可有效抑制化疗后残余肝癌组织的EMT,降低残余肝癌组织侵袭转移潜能,延长残余肝癌再接种裸鼠的生存时间.松友饮与化疗药物合用有可能进一步提高肝癌化疗的疗效.
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消癌平联合顺铂对高转移人卵巢癌HO-8910PM 细胞的抑制作用
目的：探讨消癌平和顺铂对高转移人卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，及其对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法将不同浓度消癌平注射液和（或）顺铂作用于体外培养的高转移人卵巢癌HO-8910PM细胞，采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。建立裸鼠皮下HO-8910PM细胞移植瘤模型，比较药物作用后移植瘤体积的差异。结果0．1、0．5、1．0、1．5、2．0 mg／ml消癌平作用于HO-8910PM细胞后，细胞增殖受到抑制，随着消癌平浓度的增加，细胞增殖抑制率增高。1．0 mg／ml消癌平作用HO-8910PM细胞48 h后，细胞增殖抑制率为（38．3±4．5）％；消癌平联合顺铂作用后，细胞增殖抑制率为（53．4±3．0）％，差异有统计学意义（P＜0．05）。消癌平组和顺铂组中G0／G1期细胞的比例分别为（74．1±1．6）％和（68．6±1．6）％，与对照组[（64．2±1．6）％]比较，差异均无统计学意义（均P＞0．05）；经消癌平和顺铂联合作用后，G0／G1期细胞比例为（79．9±1．7）％，与顺铂组比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。1．0 mg／ml消癌平和10．0μg／ml顺铂处理HO-8910PM细胞48 h后，早期凋亡细胞的比例分别为（16．1±1．6）％和（35．6±1．6）％，与对照组[（2．2±1．6）％]比较，差异均有统计学意义（均P＜0．05）；联合用药组早期细胞凋亡的比例为（59．9±1．8）％，与消癌平组和顺铂组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．01）。顺铂和消癌平联合作用HO-8910PM细胞后，侵袭至滤膜下表面的细胞数为（89．2±20．7）个／视野，低于对照组[（187．2±24．6）个／视野]、消癌平组[（141．8±13．7）个／视野]和顺铂组[（155．8±19．4）个／视野]，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。顺铂组、消癌平组和联合用药组裸鼠的移植瘤抑瘤率分别为34．2％、23．4％和59．0％，联合用药组的抑瘤率高于顺铂组和消癌平组，差异均有统计学意义（均P＜0．01）。结论消癌平能抑制高转移人卵巢癌HO-8910PM细胞增殖，引起G0／G1期细胞阻滞，促进细胞凋亡，降低HO-8910PM细胞的侵袭能力。消癌平联合顺铂可以产生协同抗肿瘤作用。
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CCL20-CCR6-Th17轴与肝细胞癌血管浸润转移的关系
目的 探讨CCL20-CCR6-Th17轴在肝细胞癌血管浸润转移中的作用.方法 采用SYBR Green实时定量PCR测定人肝细胞系L-02、肝细胞癌细胞系Hep3B、Huh7和HepG2中CCL20mRNA的表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中CCL20蛋白的分泌,Transwell迁移实验检测肝细胞癌细胞系对人外周血单个核细胞的趋化作用.采用ELISA定量检测93例肝细胞癌患者(转移组51例,无转移组42例)术前外周血中白细胞介素1α(IL-1α)、IL-1β 、IL-6 、IL-8 、IL-10、IL-17、IL-23、γ-干扰素、肿瘤坏死因子α和CCL20的水平,采用SYBR Green RT-PCR检测41例肝细胞癌癌组织及其相应的癌旁组织中CCL20和CCR6的表达水平,免疫组织化学染色检测肝细胞癌及其对应的癌旁组织和正常人供肝组织中CCL20的表达水平.结果 人肝细胞癌细胞系中CCL20的表达水平高于正常肝细胞,对外周血表达CCR6的T细胞具有趋化作用.93例肝细胞癌患者血清中CCL20蛋白的表达水平为(38.2±28.4) pg/ml,高于肝血管瘤患者[(7.8±17.8) pg/ml,P＜0.01].肝细胞癌患者血清中CCL20蛋白的表达水平与肿瘤直径呈正相关(r=0.32,P=0.0018).41例肝细胞癌组织CCL20 mRNA的表达水平高于癌旁组织(P＜0.05),CCL20蛋白主要在肝细胞癌细胞质中表达,某些浸润的免疫细胞也有一定程度表达.多因素分析结果显示,血清中IL-17和CCL20水平是影响肝细胞癌患者发生血管浸润转移的独立影响因素(均P ＜0.05).41例肝细胞癌患者癌组织及对应的癌旁组织中CCL20 mRNA的表达水平与肝细胞癌发生血管浸润转移均无关(均P＞0.05).在发生血管浸润转移患者的癌组织及其对应的癌旁组织中CCR6 mRNA的表达水平分别为5.75 (1.79,19.13)和7.99(4.49,19.54),均高于未发生血管浸润转移的患者[分别为1.69 (0.76,2.87)和3.58(1.84,4.32)],差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 CCL20/CCR6/Th 17轴可能促进肝细胞癌的血管浸润转移.
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miR－155在肺腺癌 A549细胞侵袭和转移中的作用
目的：探讨 miR－155在肺腺癌侵袭和转移中的作用。方法采用实时荧光定量 PCR和原位杂交检测 miR－155在肺腺癌和癌旁组织以及转移淋巴结中的表达，采用划痕实验和 Transwell迁移实验检测 miR－155对 A549细胞的迁移和侵袭能力的影响；利用生物信息学软件预测 miR－155的靶基因，并采用双荧光素酶检测靶基因；采用 Western blot 和实时荧光定量 PCR 检测 miR－155调控靶基因鼠抗人第10号染色体同源缺失性磷酸酶张力蛋白（PTEN）的表达水平。结果实时荧光定量PCR 检测显示，肺腺癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结中的 miR－155表达水平分别为9．6±3．1、4．1±0．5和7．8±2．2。原位杂交检测显示，肺腺癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结中 miR－155阳性表达率分别为（75．4±20．2）％、（23．2±15．3）％和（60．4±25．1）％。划痕实验检测显示，miR－155模拟物组、miR－155模拟物对照组、miR－155抑制剂组和 miR－155抑制剂对照组24 h 伤口愈合率分别为（43．2±2．2）％、（21．3±4．2）％、（24．3±5．3）％和（35．2±5．1）％，而48 h 伤口愈合率分别为（75．2±4．5）％、（52．6±5．2）％、（39．4±4．2）％和（51．5±4．3）％。双荧光素酶报告基因检测显示，miR－155模拟物组与含有PTEN 3′UTR 野生型和突变型质粒共转染的荧光素酶值分别为4．7±0．5和7．3±0．7，而 miR－155模拟物对照组与含有 PTEN 3′UTR 野生型和突变型质粒共转染的荧光素酶值分别为7．8±0．9和7．5±0．8。实时荧光定量 PCR 检测显示，miR－155模拟物组、miR－155模拟物对照组、miR－155抑制剂组和 miR－155抑制剂对照组的 PTEN mRNA 相对表达水平分别为0．5±0．3、1．0±0．1、2．2±0．2和1．2±0．1。 Western blot 检测显示，miR－155模拟物组、miR－155模拟物对照组、miR－155抑制剂组和 miR－155抑制剂对照组的 PTEN 蛋白相对表达水平分别为0．4±0．1、1．0±0．3、2．8±0．2和1．4±0．1。 miR－155模拟物组与miR－155模拟物对照组、miR－155抑制剂组与 miR－155抑制剂对照组的 PTEN mRNA 和蛋白表达差异均有统计学意义（均 P＜0．05）。结论miR－155可能是通过下调靶基因 PTEN 的表达而促进肺腺癌的侵袭和转移。
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miR-140通过下调Smad3表达抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力
目的 探讨miR-140对结肠癌RKO细胞迁移和侵袭能力的影响及其调控机制.方法 将miR-140模拟物、miR-140特异性抑制物和Smad3小干扰RNA(siRNA)等分别通过脂质体转染至细胞,应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测细胞中miR-140和Smad3 mRNA的表达,应用Western blot检测Smad3蛋白的表达.采用细胞划痕实验和Transwell小室模型检测miR-140上调、miR-140下调和Smad3下调对RKO细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 Western blot结果显示,上调miR-140后,miR-140组中Smad3蛋白的相对表达水平为0.04±0.01,低于空白对照组(0.47±0.02)和阴性对照组(0.52 ±0.06,均P＜0.05).real-time PCR检测结果显示,miR-140组中Smad3 mRNA表达水平为1.11 ±0.13,与阴性对照组(1.00±0.06)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).细胞划痕实验显示,miR-140转染细胞的迁移能力均低于空白对照组和阴性对照组,而与Smad3 siRNA组比较,迁移能力无明显改变.Transwell小室迁移实验显示,miR-140组的穿膜细胞数为76.2±4.4,低于空白对照组(267.1±4.9)和阴性对照组(336.1±5.7,均P＜0.05),而与Smad3 siRNA组(83.5±7.3)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Transwell小室侵袭实验显示,miR-140组的穿膜细胞数为109.5±7.4,低于空白对照组(403.1±5.1)和阴性对照组(392.6±8.4,均P＜0.05);而与Smad3 siRNA组(138.8±3.6)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).miR-140下调可使Smad3蛋白表达增高,部分逆转miR-140对细胞迁移和侵袭能力的抑制作用.miR-140抑制剂和Smad3 siRNA共转染则对Smad3蛋白表达和细胞的迁移和侵袭能力无明显影响.结论 miR-140在转录后水平调控Smad3的表达.miR-140抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力,可能是通过下调Smad3来实现.miR-140可能作为肿瘤转移诊断及治疗的潜在候选靶点.
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miR-124抑制胃癌细胞增殖和侵袭的机制研究
目的 探讨miR-124抑制胃癌细胞增殖和侵袭的机制.方法 构建鞘氨醇激酶1(SPHK1) 3'UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告基因实验检测miR-124对SPHK1 3'UTR-荧光素酶活性的影响.将miR-124模拟物转染胃癌细胞MGC-803,采用Western blot检测SPHK1表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和Transwell侵袭实验检测miR-124与SPHK1 siRNA对MGC-803细胞生长、侵袭转移能力的影响.结果 荧光素报告载体系统证实,SPHK1是miR-124直接调控的靶基因.Western blot检测结果显示,miR-124可抑制SPHK1蛋白的表达.MTT法检测结果显示,转染12、24、48 h后,对照组的A值分别为0.316±0.010、0.429 ±0.002和0.517±0.007,miR-124模拟物组的A值分别为0.152±0.003、0.216±0.001和0.242±0.020,SPHK1 siRNA组的A值分别为0.167±0.006、0.286±0.011和0.311±0.040,miR-124模拟物组和SPHK1 siRNA组与对照组差异均有统计学意义(均P ＜0.05),且具有时间依赖性.Transwell侵袭实验显示,转染24h后,对照组、miR-124模拟物组和SPHK1 siRNA组的穿膜细胞数分别为(100.6±11.3)个、(47.8±6.6)个和(54.6±8.3)个,miR-124模拟物和SPHK1 siRNA能明显减缓MGC-803细胞的侵袭能力,与对照组差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR-124可通过靶向调控SPHK1的表达而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力.
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miR-200b通过靶向PROM1抑制胶质瘤细胞侵袭
目的 探讨miR-200b靶向调控PROM1的表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响以及miR-200b抑瘤的分子机制.方法 构建PROM1 3’端非翻译区(3'UTR)荧光素酶报告载体,荧光素酶报告检测miR-200b对PROM1 3'UTR-荧光素酶活性的影响.将miR-200b模拟物转染胶质瘤U87细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测PROM1 mRNA和蛋白的表达水平.将PROM1 siRNA转染U87细胞,Transwell侵袭实验检测PROM1下调对U87细胞侵袭能力的影响.结果 双荧光素酶报告检测显示,miR-200b能特异性地与PROM1 3'UTR结合,抑制其荧光素酶活性,其荧光素酶活性强度下降了57.0％,差异有统计学意义(P＜0.01).过表达miR-200b的U87细胞中PROM1蛋白和mRNA表达水平均降低,转染miR-200b组和对照组中PROM1 mRNA的表达水平分别为0.64 ±0.05和0.95 ±0.09,差异有统计学意义(P＜0.05).siRNA于扰PROM1表达能抑制U87细胞的生长和侵袭能力.转染PROM1siRNA组和对照组中穿膜细胞数分别为(85±9)个和(155±16)个,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-200b可通过靶向调控PROM1的表达而抑制胶质瘤细胞的侵袭力.
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下调泛素特异性蛋白酶18抑制胃癌细胞的侵袭和增殖
目的 分析泛素特异性蛋白酶18(USP18)在人胃癌细胞株中的表达及其作用,探讨其与胃癌发生、发展的关系.方法 蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测永生化胃黏膜上皮细胞株GSE和胃癌细胞株(AGS、MKN45、MKN25、BGC823、BGC803、SGC7901)中USP18蛋白和mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell实验检测USP18在胃癌细胞侵袭和增殖中的作用.结果 GSE细胞中USP18 mRNA的含量表达低于各胃癌细胞株(F=794.052,P＜0.000 1).6种胃癌细胞株中,BGC823和BGC803中USP18 mRNA的相对含量高,分别为17.62±0.55和13.52±0.50,而在MKN28和MKN45细胞中的含量低,分别为1.40±0.17和4.23±0.26.在蛋白水平上,USP18在GSE细胞中的表达低,在6株胃癌细胞中,USP18在侵袭能力较强的SGC7901和BGC803细胞中的表达高,而在AGS和MKN45细胞中的表达低.与对照组相比,干扰USP18后SGC7901和BGC803的侵袭和增殖能力降低,差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论 USP18在侵袭能力较强的胃癌细胞株中高表达,下调USP18能抑制胃癌细胞的侵袭和增殖.
关键词： 胃肿瘤 泛素特异性蛋白酶18 肿瘤侵润 细胞增殖
