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RT-PCR技术在肺炎克雷伯菌耐药性方面的研究进展
肺炎克雷伯菌是一种能够引起一系列严重疾病的条件致病菌,近年来随着耐药肺炎克雷伯菌的广泛传播,real-time PCR技术在疾病早期检测其耐药基因显得尤为重要.本文就real-time PCR技术在诊断肺炎克雷伯菌耐药性方面的应用进行总结.
关键词： Real-time PCR 肺炎克雷伯菌 诊断 抗生素耐药 -
吉林地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的基因分型
目的 对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带的ESBLs耐药基因进行分型,为临床合理应用抗生素提供理论依据.方法 收集住院患者标本中分离出的51株大肠埃希菌和32株肺炎克雷伯菌,经PCR对上述菌株所携带的ESBLs耐药基因进行分型.结果 产ESBLs大肠埃希菌中耐药质粒编码TEM型、SHV型和非TEM非SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的百分率依次为80.4%,7.8%和11.8%;而在肺炎克雷伯菌中的百分率依次为78.1%,71.9%和25.0%.多数产ESBLs肺炎克雷伯菌同时产生一种以上的β-内酰胺酶.结论 获得了吉林地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的不同基因型,ESBLs基因型具有地区性差异.
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2499例肺炎克雷伯菌临床分布及耐药性分析
目的 分析肺炎克雷伯菌耐药性趋势,指导临床合理用药.方法 对医院2 499例临床送验标本分离出的肺炎克雷伯菌耐药性进行统计分析.结果 标本来源以痰液、尿液和血液居前3位,分别占比52.78％、12.28％、10.04％.肺炎克雷伯菌对青霉素类、头孢类抗菌药物耐药率高于80％;对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南耐药率有增长趋势;对替甲环素和厄他培南均高度敏感.2 499例多重耐药的肺炎克雷伯菌检出率分别为24.45％,多重耐药的肺炎克雷伯菌检出率呈上升趋势.结论 针对肺炎克雷伯菌耐药性变迁,及时采取抗菌药物预警指导,合理使用抗菌药物,有效控制繁殖耐药菌产生,降低耐药率.
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肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究进展
喹诺酮类药物作为广谱抗菌药物,已被广泛应用于革兰阴性肺炎克雷伯菌的治疗,而肺炎克雷伯菌为了不被杀灭产生对喹诺酮耐药的分子机制成为细菌治疗研究的热点之一.本文对肺炎克雷伯耐喹诺酮的主要机制及目前的研究进展作一综述.
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氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌外排蛋白表达差异的研究
目的探讨氟喹诺酮体外诱导肺炎克雷伯菌外排蛋白表达的差异.方法取临床分离对喹诺酮敏感的肺炎克雷伯菌20株,分2组,每组10株,1组作对照组,观察组将应用不同浓度梯度环丙沙星逐级诱导,后成为耐药株,观察2组细菌在不同浓度抗生素应用后的差异,并比较观察组的10株敏感菌和诱导后耐药菌在应用外排泵抑制剂前后低抑菌浓度(MIC)及SDS-PAGE电泳外排泵膜蛋白表达的差异.结果环丙沙星从小至大剂量体外诱导出高度耐药株的出现,其53KDa外膜蛋白TolC表达增多.应用外排泵抑制剂利血平后,70%诱导耐药菌MIC有明显下降.结论喹诺酮体外诱导可使肺炎克雷伯菌的耐药性出现,TolC表达增多表明外排泵在肺炎克雷伯菌耐药机制中起重要作用.外排泵抑制剂的应用对肺炎克雷伯菌耐药有一定的遏制作用.
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Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)“超级细菌”的暴发暴露当前抗生素滥用危机
2010年8月，Kumarasamy等[1]报道，在印度、马基斯坦和英国分离出180株带有I型新德里金属β内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1)基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，除对替加环素和多黏菌素仍敏感外，几乎对所有抗生素耐药。
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儿童产超广谱β-内酰胺酶细菌感染的检测与分析
目的了解儿童感染性疾病中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌感染时产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的情况及其耐药特点.方法对202株肺炎克雷伯菌和134株大肠埃希菌应用双纸片协同试验进行ESBLs的测定,纸片扩散法进行常规药敏试验,按照NCCLS的标准判读结果.结果对336株儿童患者感染菌株试验,共检测出81株ESBLs菌株,ESBLs总产生率为24.1%;其中肺炎克雷伯菌产ESBLs率为29.7%,大肠埃希菌产ESBLs率为15.7%.产ESBLs菌株的耐药率显著高于不产ESBLs菌株(t＝6.603,p<0.01),对氨苄西林、氨曲南、头孢他定和头孢噻肟耐药,对复方新诺明、氨苄西林/舒巴坦的耐药率也较高(耐药率高于60%),且多为多重耐药株,对丁胺卡那霉素、诺氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦敏感率较高(耐药率低于30%);所有被测菌株对亚胺培南的耐药率为0.结论儿童感染细菌ESBLs发生率相当高,产ESBLs菌株已成为引起医院感染的重要病原菌,耐药高且多重耐药情况严重,治疗较困难,需加强ESBLs检测,以合理使用抗生素,延缓和防止ESBLs的发生和播散.
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克雷伯菌属噬菌体LH-01的生物学特性及其对败血症小鼠疗效的初步研究
目的 自地下生活污水中分离肺炎克雷伯菌的噬菌体,明确其生物学特性,观察其对小鼠多重耐药肺炎克雷伯菌所致败血症的疗效. 方法 电镜观察LH/01形态,调查其噬菌谱、生长曲线等生物学特性.建立小鼠败血症感染模型,观察LH-01的疗效. 结果 LH-01在其宿主菌的菌苔上形成毒性噬菌体所具有的完全透明的噬菌斑,电镜观察LH-01具典型的有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的形态特征.一步生长曲线显示LH-01的潜伏期约为10 min,裂解量约为100 PFU/细胞.稳定性试验显示LH-01在pH 5～10及50 ℃和60℃环境均具良好稳定性.LH-01治疗克雷伯菌感染败血症小鼠的存活率为90％,对照组存活率为0,差异有统计学意义(P＜0.001),且无毒副作用. 结论 LH-01具有高效的裂菌活性和高稳定性,治疗克雷伯菌感染小鼠败血症有效且安全,有望成为生物抗菌剂,其有效成分有待进一步研究.
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产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布及耐药性分析
目的 了解医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布及耐药性特点. 方法 对我院2004年7月～2006年7月间各类临床标本分离出的大肠埃希菌307株和肺炎克雷伯菌202株,用CLSI/NCCLS推荐的表型确证法检测其ESBLs,采用K-B纸片琼脂扩散法进行药敏试验,分析产ESBLs菌株的分布及耐药性. 结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株的检出率分别为38.4%(118/307)和31.7%(64/202),主要分布于尿和痰、咽拭子中,病区主要集中于肺科、神经外科、感染科、泌尿外科、ICU室.产ESBLs菌株对亚胺培南和美罗培南呈高度敏感,对哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁耐药率较低,对其他抗菌药物均出现较高耐药. 结论 产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分布在不同病区的不同标本中,碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南是治疗产ESBLs菌株感染的较佳药物.
关键词： 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 耐药性 -
噬菌体LH-01治疗不同宿主菌所致小鼠致死性败血症影响因素研究
目的 观察肺炎克雷伯菌噬菌体LH-01治疗不同宿主菌所致小鼠败血症的效果,分析影响疗效因素,探索评价噬菌体疗效的方法. 方法 通过比较噬菌斑和成斑率,从9株LH-01宿主菌中选择对其敏感性较强的菌株.尾静脉注射绝对致死量的不同敏感菌致小鼠败血症,2h后通过尾静脉注射LH-01治疗并观察其疗效.比较LH-01在小鼠新鲜血清、补体热灭活血清,以及在标准补体溶血活性由低至高的溶液中对敏感菌的杀灭能力,明确引起LH-01对不同敏感菌感染组小鼠疗效差异的因素. 结果 9株宿主菌中KP6、KP13、KP16和KP22在营养肉汤中对LH-01为敏感.当小鼠全身感染致死量的这4种细菌后,LH-01的治疗可使KP6感染组小鼠生存率达90％(9/10),KP13组为30％(3/10),而KP16组和KP22组小鼠全部死亡.体外试验显示,除LH-01对KP6的作用不受补体影响外,LH-01对其余3株菌的杀灭作用均受补体影响,其中25 U/ml的补体活性即可完全抑制LH-01对KP16和KP22的杀灭作用,而完全抑制对KP13的杀灭作用所需的补体活性≥50 U/ml. 结论 补体是影响LH-01治疗小鼠肺炎克雷伯菌感染疗效的主要原因.血清中噬菌体对致病菌的杀菌力和补体干扰杀菌的程度有助于预测噬菌体疗效,指导细菌感染的噬菌体治疗.
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左氧氟沙星与加替沙星对肺炎克雷伯菌防耐药突变的比较
目的 观察左氧氟沙星与加替沙星对肺炎克雷伯菌的防耐药突变作用. 方法 肉汤法富集受试菌菌液,接种含不同浓度左氧氟沙星及加替沙星琼脂平皿,测定左氧氟沙星、加替沙星对临床分离的肺炎克雷伯菌、ATCC700603及其耐药突变体的防耐药突变浓度；菌落计数法描绘菌落恢复生长曲线；测定ATCC700603及突变体的耐药突变窗及选择指数；结合药代动力学和药效动力学参数确定临床治疗方案. 结果 左氧氟沙星较加替沙星的防耐药突变浓度与细菌耐药选择指数大；菌落恢复生长曲线显示加替沙星的平台期窄于左氧氟沙星；加替沙星较左氧氟沙星的突变体耐药突变窗增宽幅度小. 结论 加替沙星防止肺炎克雷伯菌发生耐药突变作用强于左氧氟沙星.
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒中AmpC酶基因型的检测
目的 探讨台州地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株质粒介导的AmpC酶基因型流行状况.方法 应用VITEK-60型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌,按NCCLS推荐的确证试验测定β-内酰胺酶(ESBLs);采用头孢西丁纸片扩散法筛选疑产AmpC酶阳性菌株,并通过酶粗提物头孢西丁三维试验、接合试验和PCR测序等实验分析该菌株的基因型及基因表型.结果 299株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLS检出率为19.73%(59/299),AmpC酶纸片扩散法筛选阳性率为12.04%(36/299),且36株AmpC酶筛选阳性菌株均为ESBLs阳性株;该菌株中有15株经三维试验证实为AmpC酶阳性,阳性率5.02%(15/299);15株产AmpC菌经接合试验得到15株接合子,经PCR及测序证实与原菌株表型基本一致.质粒型AmpC基因中13株为CIT型,2株为DHA型.结论 台州地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中已出现质粒携带的AmpC基因,基因型以CIT型为主,其次是DHA型.AmpC基因可能与编码ESBLs的基因存在于同一质粒上,编码的AmpC酶的质粒可在细菌间传递.
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噬菌体PF23生物学特性及其对小鼠肺炎克雷伯菌全身感染疗效观察
目的 了解肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体PF23的生物学特性,观察其对小鼠全身感染的疗效. 方法 电镜观察噬菌体PF23的形态,一步生长曲线以及对温度和pH的敏感性;提取噬菌体基因组,酶切法鉴定其核酸类型,并初步估算其基因组大小;建立小鼠全身感染模型,观察PF23的治疗效果. 结果 PF23的噬菌斑为有晕清晰透明圆斑,直径约2 mm;电镜观察PF23具有尾噬菌体目,长尾病毒科病毒的形态特征;其在＜50℃的温度下及pH 4～9范围内稳定性好.一步生长曲线显示其潜伏期约为11 min,裂解量约为41 PFU/细胞.其基因组核酸不能被双链DNA限制性内切酶KpnI、EcoRI和HindⅢ切开,但能被BamHI切开,且酶片段大小合计＞27 kb.用PF23治疗由其宿主菌所致全身感染小鼠,小鼠的生存期均＞2 d,7d存活率为37.5％;未治疗对照组小鼠1d内均死亡. 结论 肺炎克雷伯菌的噬菌体PF23潜伏期短,有较好的热稳定性和酸碱稳定性,治疗小鼠肺炎克雷伯菌全身感染效果显著,值得进一步研究.
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黄芩对肺炎克雷伯菌抑制作用及其机制研究
目的 观察黄芩对肺炎克雷伯菌的抑制作用,分析其抗菌机制,为寻找治疗肺炎克雷伯菌感染新途径提供实验依据. 方法 制备黄芩药液,以多重耐药肺炎克雷伯菌为试验菌株,采用试管法测定黄芩液对细菌的低抑菌浓度(MIC)和小杀菌浓度(MBC);通过细菌生长曲线和生物膜形成情况评价黄芩液对细菌生长的影响.不同浓度黄芩液作用后,取培养液上清进行电导率和碱性磷酸酶活性测定,分析其对细菌细胞膜通透性的影响;采用细菌沉淀荧光法进行核酸DNA和RNA含量及SDS-PAGE蛋白谱带定量分析;提取DNA拓扑异构酶,进行相关生物学活性测定,分析其对细菌合成的影响. 结果 黄芩液对肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为(32±2.2) mg/ml和(64±3.6)mg/ml.不同浓度黄芩液均可抑制肺炎克雷伯菌生长和细胞生物膜形成,使细胞膜通透性增加.黄芩液作用24 h后肺炎克雷伯菌菌体蛋白、DNA和RNA减少.黄芩能抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ活性,且呈浓度依赖. 结论 黄芩可通过抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成抑制其生长,通过增加细胞膜通透性和抑制细菌DNA拓扑异构酶活性,进而抑制细菌核酸和蛋白合成,发挥抑制细菌繁殖和侵袭作用.
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肺炎克雷伯菌短尾噬菌体LH-01药代动力学研究
目的 探讨噬菌体LH-01在小鼠体内的药代动力学及其影响因素. 方法 观察LH-01在小鼠体内的代谢过程和LH-01中和抗体产生规律.建立小鼠败血症感染模型,使用高剂量和低剂量LH-01进行治疗,观察小鼠健康评分(0～5),同时检测小鼠外周血和主要脏器内活菌数和噬菌体滴度变化规律. 结果 噬菌体LH 01在小鼠体内具有较低的清除率,活性噬菌体可在小鼠体内持续存在数天,10d后完全消失.2周时外周血LH-01中和抗体效价为1∶8,5周时高为1∶1 024.用高剂量组(1010 PFU/ml)和低价量(104 PFU/ml)的噬菌体LH-01尾静脉注射治疗小鼠败血症,两组组小鼠健康评分终差异无统计学意义(P＞0.05),终生存率均为100％,而对照组为0％.治疗组小鼠外周血和脏器(肝脏、脾脏和肺脏)中的菌落数显著少于对照组菌落数(P＜0.01),尤以脾脏中菌落数减少显著.LH-01治疗中具有自我放大效应,高剂量和低剂量治疗组小鼠外周血、肝脏和肺脏中的噬菌体滴度与噬菌体对照组相比均显著升高(P＜0.01),尤以外周血增加为明显. 结论 LH-01具有杀菌效率高、自我增殖能力强、活性维持时间长、中和抗体产生晚等良好的药代动力学特性,可试用于多重耐药肺炎克雷伯菌感染的治疗.
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血流感染高致病性肺炎克雷伯菌毒力因子及分子分型特点分析
目的 研究血流感染高致病性肺炎克雷伯菌的毒力基因和基因分型特点. 方法 采用PCR方法检测临床分离株血流感染高致病性肺炎克雷伯菌的高毒力基因,并进行荚膜血清型和ST分型;采用微量肉汤稀释法通过BDPhoenix全自动细菌鉴定/药敏系统对分离菌株进行药敏试验;应用加克拉维酸复合药(头孢他啶/克拉维酸或头孢噻肟/克拉维酸)与单药(头孢噻肟或头孢他啶)的药敏纸片组合进行肺炎克雷伯菌产ESBLs的表型确证试验. 结果 115株血流感染肺炎克雷伯菌临床分离株分为高毒力肺炎克雷伯菌(Hvkp,占43.48％,50/115)和非Hvkp(non-HvKP,占56.52％,65/115).与non-HvKP相比,HvKP更容易表现为高黏液性表型(44.00％ VS 6.15％,P＜0.01),且普遍携带rmpA(98.00％ VS 4.61％,P＜0.01)、rmpA2(50.00％ VS 3.08％,P＜0.01)、wcag(24.00％ VS 2.15％,P＜0.05)毒力基因.HvKP常为K1、K2荚膜血清型,non-HvKP常为K-nontypable血清型.本组血流感染肺炎克雷伯菌主要流行ST型别为ST23、ST65、ST37,其中Hvkp流行型为ST23、ST65和ST86.Hvkp对常用抗生素的敏感性好于non-HvKP,其中发现产ESBLs耐药hvKP菌株4株. 结论 血液感染高毒力肺炎克雷伯菌易表现为高黏液性表型且普遍携带rmpA毒力基因,因此应注意检测肺炎克雷伯菌黏液性状、荚膜血清型、毒力基因以及ST分型,以利于hvkp感染的识别.
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肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体PhF168的生物学特性其对重症败血症小鼠疗效的初步研究
目的 明确肺炎克雷伯菌噬菌体PhF168的生物学特性及其对小鼠重症败血症的疗效. 方法 电镜观察PhF168的形态,调查其噬菌谱并研究其一步生长曲线、温度和酸碱稳定性等生物学特性;提取PhF168的基因组,酶切鉴定其核酸类型,并初步估算其基因组的大小;建立小鼠重症败血症感染模型,观察PhF168治疗效果. 结果 PhF168可在宿主菌F168上形成直径3～5 mm、完全透明并带有较宽晕环的噬菌斑,为裂解性噬菌体.电镜下其颗粒呈有尾噬菌体目长尾噬菌体科的形态特征.PhF168的基因组为dsDNA,＞40 kb,含有EcoRⅠ和BamH Ⅰ限制性内切酶切位点.PhF168在宿主菌F168中的潜伏期为15 min,裂解量为(64±5)PFU/细胞,在pH 4～9和＜50℃下具良好稳定性.用PhF168治疗由其宿主菌F168感染所致的重症败血症小鼠,所有小鼠的生存期均在3d以上,7d存活率达40％.未治疗对照组小鼠1d内全部死亡. 结论 PhF168杀菌作用高效,具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,治疗宿主菌引起的小鼠重症败血症疗效显著,可作为治疗细菌感染的噬菌体候选株.
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19株新分离噬菌体可裂解肺炎克雷伯菌临床株的ERIC-PCR指纹图谱分析
目的 测定19株新分离噬菌体对30株肺炎克雷伯菌临床株的噬菌谱;对噬菌体可感染菌侏进行同源性分析以进一步评价其噬菌谱. 方法 利用滴斑法测定19株新分离噬菌体的噬菌谱:采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对噬菌体感染的菌株进行同源性分析. 结果 19株新分离噬菌体的噬菌谱可覆盖67％的被调查菌株(20/30).其中以噬菌体P13感染的菌株多,占33％(10/30),但这些菌株的ERIC-PCR分型仅归属于2种类型:Ⅰ型和Ⅵ型;噬菌体P27感染20％(6/30)的菌株,这些菌株的ERIC-PCR分型归属于4种类型:Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅷ型. 结论 根据肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指纹图谱分型信息,以噬菌体P27的噬菌谱较宽,可感染4种类型亲缘关系较远的肺炎克雷伯菌临床株.
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性和耐药质粒谱分析
目的 研究大肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella peumoniae)临床分离株耐药性及其质粒谱变化.方法 对福建医科大学2所附属医院分离的E.coli和K.peumoniae共53株行药敏试验.检出产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的菌株用碱变性法提取质粒,采用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析质粒谱.结果 产ESBLs菌株对多数青霉素和头孢菌素类抗生素耐药.对碳青霉烯类和酶抑制剂敏感(P<0.05).不产ESBLs E.coli菌对喹诺酮类的敏感性高于产酶菌株(P<0.01).受检菌株对丁胺卡那霉素的敏感性较高.产ESBLs菌株60.0%检出质粒,其中50%携带0.9 kb质粒.对环丙沙星耐药的E.coli,50%携带4.2 kb质粒;4株对丁胺卡那霉素耐药的E.coli中,2株携带9.4kb质粒.结论 E.coli和K.peumoniae产ESBLs主要由质粒介导.0.9 kb质粒可能与产ESBLs有关;4.2 kb的质粒可能与环丙沙星耐药有关;9.4 kb质粒可能与丁胺卡那霉素耐药有关.
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肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组初步研究
目的 研究肺炎克雷伯菌噬菌体LH-02的生物学特性及基因组性质. 方法 观察LH-02的噬菌斑形态和电镜下形态;调查LH-02的噬菌谱,并观察其一步生长曲线以及理化稳定性;提取噬菌体基因组进行酶切鉴定. 结果 LH-02在宿主菌KF29菌苔上形成直径2～3 mm的透明噬菌斑,外周有宽2～3mm的半透明晕环;电镜观察确定其为有尾噬菌体目,短尾噬菌体科;一步生长曲线显示LH-02感染KF29的潜伏期短(约15 min),裂解量大(约217 PFU/细胞);LH-02在一个较宽的pH范围内(5～10)和较高的温度(50℃)范围内活性稳定;LH-02的核酸可被Kpn Ⅰ,EcoRⅠ,HindⅢ降解,但不能被BamH降解. 结论 LH-02为裂解性噬菌体,基因组为双链DNA,其潜伏期短,裂解量大,稳定性好,有望成为生物抗菌剂.
