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7株泛耐药克雷伯菌的耐药特征及其耐药基因
从浙江丽水市中心医院分离到无重复泛耐药克雷伯菌7株:5株肺炎克雷伯菌(K1-K5)、1株臭鼻克雷伯菌(K6)、1株解鸟氨酸克雷伯菌(K7).菌株鉴定及药敏:取患者痰液标本在血平板上,37℃,18～24 h生长分离单个菌落.采用Vitek2 -compact鉴定仪经GNI卡鉴定为克雷伯菌.取M-H平板上37℃,18 h生长的单个菌落,采用鉴定仪配套的GN13卡鉴定菌株药敏.结果所有菌株对亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢吡肟等碳青霉烯类、头孢类抗生素耐药,且均对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明、氨曲南、呋喃妥因耐药;除解鸟氨酸克雷伯菌(K7)外,其他菌株同时对左氧氟沙星、环丙沙星等喹诺酮类抗生素耐药.
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浙江省产超广谱β-内酰胺酶菌株的TEM型耐药基因的检测
超广谱TEM型β-内酰胺酶菌株在各国的流行状况各不相同,我国尚无TEM型β-内酰胺酶流行状况的报告.我们对浙江省临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌进行了TEM型β-内酰胺酶编码基因研究.
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浙江省产超广谱β-内酰胺酶菌株SHV型β-内酰胺酶分布
随着三代头孢菌素如头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和单环酰胺类抗生素在临床上的广泛使用,超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)在革兰阴性杆菌中产生率不断增加,ESBLs种类也不断增加,至2000年6月,已发现近100种ESBLs亚型[1],其中TEM型有67种,SHV型有24种,非TEM非SHV型有20多种.TEM和SHV型分别由广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1编码基因中1～5个位点发生点突变而来.各国各地区流行的ESBLs亚型各不相同[2].我们对浙江省各地区临床分离的表型鉴定为产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌SHV型β-内酰胺酶编码基因进行克隆、序列分析和亚型鉴定,结果如下.
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小鼠肺炎克雷伯菌感染对血清肿瘤坏死因子-α和胸腺细胞凋亡的影响
目的研究在肺炎克雷伯菌脓毒血症时,血清肿瘤坏死因子(TNF-α)水平的动态变化及与胸腺细胞凋亡的关系. 方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)动态检测感染24 h内血清TNF-α的含量,同时用电镜观察胸腺细胞凋亡的形态和TUNEL法染色观察胸腺细胞凋亡量. 结果小鼠腹腔注射肺炎克雷伯菌后TNF-α呈单峰样显著增加,峰值出现在感染后6 h,为10.09ng(P＜0.01).胸腺细胞凋亡在感染后逐渐增高,至24 h达高峰45.74%(P＜0.01). 结论肺炎克雷伯菌感染可激活多种炎性介质和诱导胸腺细胞凋亡,胸腺细胞的凋亡不完全受TNF-α控制.
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肺炎克雷伯菌DHA-1型质粒AmpC酶全编码基因克隆、表达及序列分析
目的以我院临床分离的肺炎克雷伯菌KP1为研究对象,对其所产生的质粒AmpC酶编码基因的序列进行研究. 方法采用聚合酶链反应(PCR),用DHA-1型AmpC酶引物扩增KP1接合子中AmpC酶全编码基因,并克隆到pUC118载体中进行表达,对PCR产物进行测序,分析其基因型别. 结果肺炎克雷伯菌KP1菌株的转移接合子所含有的质粒AmpC酶为DHA型,编码基因序列与GenBank中DHA-1编码基因序列的同源性为100%. 结论哈尔滨地区临床分离肺炎克雷伯菌有可转移性DHA-1型AmpC酶的存在.
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产气肠杆菌中发现碳青霉烯酶KPC-2型
肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase,KPC),属A类β-内酰胺酶.2010年3月25日我们从一家三等甲等医院老年患者的痰液中分离到1株碳青霉烯类耐药的产气肠杆菌(标本编号:20100323BAA049,经gyrA和parC基因扩增与测序,GenBank比对确认).为了解该菌株的β-内酰胺类耐药机制,我们采用E-test法检测了该菌对26种抗菌药物敏感性,并进行了A类、B类、C类、D类等4类41种β-内酰胺酶基因检测,用改良的三维试验法检测AmpC酶、ESBLs和金属β-内酰胺酶活性,用改良Hodge试验法检测碳青霉烯酶活性.
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高毒力肺炎克雷伯菌的致病机制研究进展
高毒力肺炎克雷伯菌( hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)主要感染健康人群并导致严重感染,包括肝脓肿、脑膜炎、坏死性筋膜炎、眼内炎和严重的肺炎等。研究发现hvKP的毒力强于普通肺炎克雷伯菌,表现为产生较多的荚膜多糖、携带magA、rmpA和活性铁摄取系统等毒力因子。 hvKP在宿主体内存活能力和抗中性粒细胞吞噬能力较强,导致感染的扩散和转移。本文对hvKP的毒力因子、hvKP的定植与感染以及机体对hvKP免疫力作一综述。
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Solexa测序法研究肺炎克雷伯菌质粒基因组的耐药基因
目的 通过Solexa高通量测序法研究肺炎克雷伯菌的质粒与耐药性的关系.方法 菌株为7年临床分离的206株肺炎克雷伯菌.提取所有菌的全部质粒DNA,Solexa高通量测序获得大规模的短序列.SOAP软件对质粒基因进行分析拼接,分析结果与相关数据库进行比对.MAQ软件分析质粒基因组包含的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)多样性及单核苷酸多态性(SNP)情况.结果 肺炎克雷伯菌质粒基因组中已知的直接与耐药相关的基因就有13种.质粒基因组中存在多个ABC主动外排转运系统.发现4种编码β-内酰胺酶的ORF,其中SHV型ESBLs分布广.系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组中SHV型ESBLs的SNPs位点,发现存在着大量的非同义替换SNPs位点.结论 发现质粒中SHV型ESBLs基因可能受到选择压力,存在着大量的非同义替换SNPs位点.肺炎克雷伯菌质粒存在外排药物耐药方式,从而形成低水平的非特异多重耐药.
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运用变性高效液相色谱对肺炎克雷伯菌产ESBL进行基因分型
目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的肺炎克雷伯菌临床分离株TEM型质粒进行基因分型,试图建立一种方便快捷的用于ESBL分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出TEM型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLC技术进行分析,分析提示,异常的样本通过测序确定其基因突变的类型,后通过比对确定其基因型.结果共分析了101例肺炎克雷伯菌临床分离株,全部样本均扩增出TEM型质粒的编码序列,经过DHPLC分析,52例(51.4%)样本表现为单一的洗脱峰,其形态与TEM-1标准菌株的峰型相一致,测序确定它们的碱基序列亦相一致,不存在变异,为TEM-1型;49例(48.6%)样本表现为异常的洗脱峰,它们均为双峰,形态一致,但异源双链峰的高度有差异,测序结果表明它们均存在四种相同的基因突变,在NCBI网站比对后确定为TEM-116;测序结果还提示,部分样本中TEM-1和TEM-116混合存在,其比例的不同表现为DHPLC时异源双链峰高度的差异;文献检索表明,本次确定的TEM-116为一新的基因亚型,为国内首次报道.结论DHPLC具有简便快捷、高通量和自动化的特点,重复性好,不仅可对已知突变作出即时诊断,还可发现新的基因亚型,不失为一种较好的ESBL分子诊断方法及其流行病学监测手段.
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碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌KPC酶检测与分析
大肠埃希菌是医院内感染和社区获得性感染的重要病原菌,其耐药性十分严重.我们在我院分离的一株碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌E902774的耐药机制研究中存在A类碳青霉烯酶KPC(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)-2酶.
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产超广谱β-内酰胺酶和质粒AmpC酶肺炎克雷伯菌的耐药性及基因型检测
通过PCR基因测序分析两种酶的基因类型,用接合转移试验了解肺炎克雷伯菌耐药基因转移方式,并用纸片扩散试验和微量稀释法测定细菌对17种抗生素的敏感性,现报道如下.
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应用脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌染色体多态性
目的利用脉冲凝胶电泳(PFGE)技术探讨肺炎克雷伯菌3个亚种临床分离株核型特征. 方法用XbaⅠ酶切各试验菌株染色体DNA,经脉冲凝胶电泳分离酶切片段. 结果 PFGE法将28株细菌分为15个型和亚型,较准确地显示各菌株染色体多态性,并筛选出亚种间的差异DNA片段. 结论脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌基因型准确、可靠,是用于流行病学监测的有效方法.
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等温核酸扩增技术检测KPC耐药方法的建立及初步评价
碳青霉烯类抗生素是治疗重症感染有效的抗生素之一。近10年来，对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌在世界各地的不断暴发威胁着人类的生命健康。产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制，其中报道较多的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（ Klebsiella pneumoniae carbapenema-ses，KPC）。而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时、准确、快速地检出产KPC酶细菌对预防、控制耐药菌株流行具有重要意义。碳青霉烯酶表型检测方法均较费时；PCR扩增是常见的分子生物学检测方法，检测时间大大缩短，但对模板DNA质量、仪器设备和场所要求较高。等温核酸扩增技术（ nucleic acid sequence-based amplifica-tion，NASBA）具有快速、灵敏、特异的优点。本研究以RNA为靶序列，建立了 NASBA 快速检测细菌KPC耐药的方法。
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金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌血流感染小鼠模型的建立及评价
目的 建立临床常见的细菌性血流感染早期诊断小鼠模型,为血流感染早期标志物的寻找和验证提供稳定可靠的实验模型.方法 选择金黄色葡萄球菌ATCC25923和肺炎克雷伯菌ATCC700603为实验菌株,将不同浓度的细菌悬液通过尾静脉注入小鼠体内,按Karber法计算半数致死量(LD50),以1/2LD50浓度注射小鼠,通过其体征、体重变化,白细胞(WBC)、血小板(PLT)、白细胞介素-6(IL-6)等指标变化,及血培养、PCR和HE染色结果等综合评价模型,验证造模效果.结果 金黄色葡萄球菌的LD50约8.1×108 CFU/ml,肺炎克雷伯菌的LD50约1.11×109 CFU/ml.小鼠感染24 h后体重明显下降.正常小鼠WBC为(1.42±0.66)×109/L,注射菌液3 h后开始升高,6 h后明显升高后下降,48 h后WBC再次升高,168 h后仍无明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).PLT在感染后24 h内明显下降(P<0.05).IL-6含量在肺炎克雷伯菌感染后升高较早,且升高幅度较金黄色葡萄球菌明显.感染后48 h内小鼠全血培养结果均为阳性,PCR结果证实了血流感染病原菌为金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌.HE染色结果表明感染后肝和肺存在炎细胞浸润.结论 成功建立了金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的小鼠血流感染模型,为血流感染的早期诊断和不同病原菌感染的鉴别诊断等研究提供了可靠的动物模型.
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2010—2016年丽水地区肺炎克雷伯菌blaKPC基因的分子流行病学研究
目的 分析丽水地区blaKPC基因分布特征,探讨肺炎克雷伯菌blaKPC基因的分子流行病学变迁规律.方法 收集丽水市中心医院2010—2016年从临床分离的所有非重复产KPC菌株,以梅里埃VITEK 2 Compact系统鉴定菌种,MLST法分析菌株ST型,复制起始子分析法鉴定质粒类型,PCR法扩增检测转座子结构,并以二代测序技术测定质粒DNA序列进而验证blaKPC基因定位,后从菌株、质粒、转座子三个水平分析本地区blaKPC基因的流行规律.结果 共收集blaKPC基因阳性菌株125株,其中肺炎克雷伯菌111株,占88.8％,且以ST11型为主(103株).肺炎克雷伯菌中,IncF质粒阳性占48.6％,主要整合缺失型Tn1721/Tn4401嵌合体(48/54株);而未分型质粒占50.5％,主要整合野生型嵌合体(54/56株).其中,94.4％的IncF质粒阳性菌分离自2011—2014年,而后急剧减少;而76.8％的未分型质粒阳性菌分离自2014—2016年,且逐年上升.结论 ST11型肺炎克雷伯菌是丽水地区blaKPC基因的主要宿主,且携带含缺失型嵌合体的IncF质粒和野生型嵌合体的未分型质粒的菌株在2014年前后交叉流行,现以后者为主.
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儿科肺炎克雷伯菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因流行现状
目的 了解质粒介导的喹诺酮耐药基因(plasmid-mediated quinolone resistance genes , PMQR)在儿科临床分离肺炎克雷伯菌中的流行情况与分布特点.方法 收集首都儿科研究所附属儿童医院临床分离的肺炎克雷伯菌,E-test法及琼脂稀释法测定菌株对不同抗生素的低抑菌浓度(MIC);PCR法检测质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-Ⅰb-cr和qepA;PCR扩增后测序检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)相关基因及染色体喹诺酮耐药决定基因gyrA及parC的突变情况;质粒接合实验检测耐药基因是否在菌株间转移.结果 131株肺炎克雷伯菌中,喹诺酮类药物耐药率为9.92%;PMQR基因检出率为30.5%(40/131),其中90%为产ESBLs菌株,各种基因检出率qnrB基因6.87%,qnrS基因22.9%,aac(6′)-Ⅰb-cr基因4.58%,未检出qnrA及qepA基因;40株PMQR阳性菌株中,2株存在gyrA和parC编码氨基酸序列改变;23株PMQR阳性菌株通过接合试验传递成功.相对于受体菌,接合子对环丙沙星的MIC提高了2~32倍.结论 质粒介导喹诺酮类药物耐药基因在儿科肺炎克雷伯菌中有高水平的携带率,阳性菌株多为产ESBLs株,耐药基因可在菌株间水平传播.
关键词： 肺炎克雷伯菌 质粒介导喹诺酮耐药基因 超广谱β-内酰胺酶 -
β-内酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低
目的 研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的分子机制.方法 临床分离到2株碳青霉烯敏感性降低的Kp Z2554和Z2110,经脉冲场凝胶电泳(PFGE)证实非同一克隆株.对2株细菌进行药物低抑菌浓度测定(MIC)、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳(IEF)、特异性PCR扩增和DNA序列分析、外膜蛋白分析以及羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制试验等.结果 Kp Z2554和Z2110对亚胺培南和美罗培南的MIC为1～8 μg/ml,前者对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素高度耐药,后者对上述抗生素的耐药程度稍弱于前者,但对头孢西丁的MIC大于512 μg/ml.IEF、PCR扩增和DNA序列分析证实Kp Z2554产TEM-1(等电点5.4)和CTX-M-14(等电点7.9)2种β-内酰胺酶,Kp Z2110产TEM-1、CTX-M-14和DHA-1(等电点7.8)3种酶.SDS-PAGE分析显示2株细菌均有相对分子质量(Mr)为39×103蛋白条带(OmpK36)的缺失.外膜蛋白基因(ompK35和ompK36)序列分析发现,Kp Z2554和Z2110的ompK35基因的个别位点存在点突变,但氨基酸序列不变.CCCP抑制试验显示CCCP不能提高Kp Z2554和Z2110对碳青霉烯类抗生素的敏感性.结论 β-内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白的缺失可引起Kp对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低.
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广州地区产ESBL肺炎克雷伯菌SHV型质粒的分子流行病学调查
目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术调查广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌各种亚型的流行分布情况,试图建立一种方便快捷的分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法 对73份产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌进行SHV质粒基因扩增,分别采用变性高效液相色谱(DHPLC)和测序法对扩增产物进行分析,以明确基因类型,并建立各个已知SHV基因亚型的特征性DHPLC图谱库.结果 73株产ESBL的肺炎克雷伯菌中68株确定为SHV基因型,其中62株为已知基因型,分别为SHV-1225株,SHV-1a 14株,SHV-17株,SHV-2a 8株,SHV-28 5株,SHV-2 2株,SHV-26和SHV-33各1株;6株为新的SHV基因型,其中5株获得命名;非SHV型菌株5株,分别为LEN-4型1株,OKP型4株.经过DHPLC分析,全部样本均表现为异常的洗脱峰,各种亚型的异常洗脱峰的形态迥异,其敏感性达100%(68/68),特异性为93.2%(68/73).SHV型质粒基因的突变集中在nt92、nt324～nt402及nt703～nt786这3个区段.结论 SHV-12是广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌主要的基因亚型,高比例基因变异的检出预示本地区即将或已经面临肺炎克雷伯菌新耐药机制的抵抗和流行,因此必须加强对产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测,及时调整抗菌策略;DHPLC可作为一种快速敏感的筛查方法用于产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测.
关键词： 变性高效液相色谱 肺炎克雷伯菌 SHV型 β-内酰胺酶 基因分型 -
肺炎克雷伯菌临床菌株β-内酰胺酶基因型及其表达诱导与抑制机制
目的：了解肺炎克雷伯菌临床菌株常见β-内酰胺酶基因型及其携带模式、抗生素诱导及组氨酸激酶抑制剂抑制β-内酰胺酶基因表达的初步机制。方法采用微量试管稀释法及E-test检测肺炎克雷伯菌临床菌株对β-内酰胺类抗生素的敏感性。采用PCR和测序法检测β-内酰胺类抗生素耐药肺炎克雷伯菌株携带的主要β-内酰胺酶基因型，纸片扩散确证试验检测其β-内酰胺酶活性。采用实时荧光定量RT-PCR了解头孢噻肟诱导β-内酰胺酶基因表达以及组氨酸激酶抑制剂氯氰碘柳胺抑制头孢噻肟诱导β-内酰胺酶基因表达的作用。结果118株β-内酰胺类抗生素耐药肺炎克雷伯菌均表达β-内酰胺酶，其中90．7％（107/118）菌株可检出KPC-2、SHV-11、TEM-1、CTX-M-14和/或OXA-1基因，其中TEM-1（71．0％）和SHV-11（64．5％）基因检出率明显高于其他3种β-内酰胺酶基因（ P＜0．05）。68．2％（73/107）菌株携带两种以上β-内酰胺酶基因型，其中 TEM-1＋SHV-11（30．8％，33/107）为优势β-内酰胺酶基因型携带模式。除KPC-2 mRNA外，1/4 MIC头孢噻肟能使肺炎克雷伯菌TEM-1、SHV-11、CTX-M-14、OXA-1 mRNAs水平显著升高（ P＜0．05），该诱导作用可被100μmol/L氯氰碘柳胺所抑制（P＜0．05）。结论 TEM-1和SHV-11是本地区肺炎克雷伯菌临床菌株所携带的主要β-内酰胺酶基因型，TEM-1＋SHV-11为β-内酰胺酶基因型优势携带模式。亚致死量头孢噻肟可诱导肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因表达上调，组氨酸激酶抑制剂氯氰碘柳胺具有抑制头孢噻肟诱导肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因表达上调的作用。
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肺炎克雷伯菌肺炎对大鼠胸腺细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨肺炎克雷伯菌肺炎对大鼠胸腺细胞凋亡的影响及可能的作用机制.方法 48只Sprague-Dawley大鼠随机(随机数字法)分为对照组和感染组,每组24只.采用气管穿刺注入感染法制作大鼠肺炎克雷伯菌肺炎模型.分别于接种后的第2,4,6天分批处死动物,分别采用TUNEL法检测大鼠胸腺细胞凋亡及免疫组化法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Fas的表达.结果 与同时间点对照组相比,感染组胸腺细胞凋亡增加,凋亡指数和胸腺细胞Cleaved Caspase-3和Fas表达水平升高,Bcl-2表达水平下降.感染组随着接种时间的延长凋亡指数和胸腺细胞Cleaved Caspase-3表达水平持续增加,胸腺细胞Fas表达水平在第4天达到高峰,胸腺细胞Bcl-2表达水平持续下降,而对照组上述各指标无明显动态变化.结论 肺炎克雷伯菌肺炎可诱导胸腺细胞凋亡增加,其机制可能与Bcl-2表达减少和Fas表达增多有关.不同凋亡调控途径在肺炎不同时期对凋亡的影响亦有所不同,Fas的作用在肺炎第4天后开始减弱而Bel-2的作用继续增强.
