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耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶与膜孔蛋白编码基因以及KPC-ISKpn6连锁检测
目的 探讨耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的耐药机制.方法 对南京地区两家三甲综合性医院的耐碳青霉烯抗菌药物肺炎克雷伯菌临床分离株,采用PCR方法对其40种β-内酰胺酶基因、膜孔蛋白编码基因及KPC-ISKpn6连锁进行检测,PCR阳性产物进行测序,测序结果BLAST对比分析.结果 24株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的A类β-内酰胺酶编码基因TEM-1及SHV的阳性检出率为100％ (24/24)、KPC-2的阳性检出率为95.8％ (23/24)、LAP-2的阳性检出率为45.8％ (11/24),C类β-内酰胺酶编码基因DHA的阳性检出率为4.2％ (1/24),KPC-ISKpn6连锁检测阳性率为95.8％ (23/24),膜孔蛋白编码基因ompK35与ompK36的突变率分别为95.8％ (23/24)及100％(24/24).结论 本组肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶TEM-1、SHV、KPC-2、LAP-2的携带率较高,其中KPC-2的高携带率及膜孔蛋白编码基因ompK35、ompK36的高突变率是本组肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制；插入序列ISKpn6可能参与了KPC-2基因的介导.
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同一标本分离的2株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制相关性分析
目的 对从同一标本中分离的碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌和摩根摩根菌进行耐药机制相关性分析.方法 琼脂稀释法进行药物敏感试验;特异性PCR扩增和序列分析检测介导耐碳青霉烯类药物的相关基因;接合试验、质粒提取和耐药基因周围序列分析耐药的可传递性、耐药质粒的同源性及耐药基因的遗传背景;提取外膜蛋白分析菌株外膜蛋白的改变.结果 2株分离菌均产碳青霉烯酶并扩增出介导碳青霉烯类耐药的KPC-2型基因;质粒接合试验成功传递了对碳青霉烯类药物的耐药性,耐药基因被携带在2个大小不同但耐药基因周围序列完全相同的质粒上;其中摩根摩根菌耐药株缺失了相对分子质量约为38×103的外膜蛋白同时出现36×103的外膜蛋白而肺炎克雷伯菌则缺失了外膜蛋白OMPK36.结论 2株分离菌均携带KPC-2基因.该基因由2个大小不同的质粒携带,同一复合转座子介导了KPC-2基因在2株细菌的不同质粒上转移.同时外膜蛋白缺失参与了对碳青霉烯类抗生素耐药.
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肺炎克雷伯菌中发现新的qnrB31和qnrB32基因亚型
近来的研究发现，由质粒介导的qnr各类基因、aac(6′)-Ⅰ b-cr基因、qepA基因、mdfa基因的变异是引起喹诺酮类耐药的主要原因。这些基因缺乏分子或转座子介导，极易在同种或不同种细菌间传播。自从2006年Jacoby GA等在肺炎克雷伯菌上首先发现qnrB1基因以来，陆续有新的qnrB亚型发现。
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肺炎克雷伯菌随机扩增多态性DNA法基因分型及意义
应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对临床分离的199株肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)进行基因分型,旨在为该菌医院感染的分子流行病学分析提供科学依据.
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产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中整合子与多重耐药的研究
目的探讨整合子介导的耐药机制在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌多重耐药中的作用.方法5株产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离自2002年1月-2004年5月间我院呼吸科住院的患者,采用E-test试验条进行药敏试验、电转化试验,筛选、分离耐药质粒.PCR扩增Ⅰ型整合子基因盒插入序列,分子克隆和序列分析.结果所有产酶菌株通过电转化试验可将头孢西丁耐药性传递给受体菌,5个产AmpC酶耐药质粒中,有4个检出整合酶序列,其中3个携带2种抗药性基因盒,包括氨基糖苷乙酰转移酶基因aacA4;氨基糖苷腺苷转移酶基因aadA5;二氢叶酸还原酶基因dfrA17;氯霉素外排蛋白编码基因cmL44.结论整合子介导的抗药性基因盒参与了产质粒AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌多重耐药的形成,应引起高度重视.
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社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌流行情况及危险因素初步分析
目的：了解我院社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率、危险因素、基因型分布及流行情况,评价针对产 ESBLs 细菌感染对常用抗生素的敏感性。方法收集四川省人民医院2013年1月至2014年12月42例社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行 ESBLs 确证试验；琼脂稀释法测定产 ESBLs 株对13种抗菌药物的敏感性；采用 PCR 法确定产 ESBLs 株基因分布情况；利用多位点序列分型(MLST)了解产 ESBLs 株的流行情况；多因素 Logistic 回归分析产 ESBLs 株患者的临床资料,以确定感染的危险因素。结果42例社区获得性血流感染大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 ESBLs 率分别为56.3%、20.0%；20株产 ESBLs 菌株的药敏结果显示对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、呋喃妥因和拉氧头孢均敏感；对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦和磷霉素耐药率低,分别为95%、90%、85%；对头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢吡肟耐药率较高,分别为100%、80%、80%、75%；20株产 ESBLs 菌株基因扩增结果显示有7株仅携带1种 CTM 基因,13株同时携带两种基因主要为 TEM+CTM-M-14、TEM+CTM-15；18株产 ESBLs 大肠埃希菌共发现10种 ST 型,以 ST131型菌株多；其次是 ST10和 ST38。恶性肿瘤可能是本研究的危险因素。结论本地区社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌流行情况严峻,恶性肿瘤可能是大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌产 ESBLs 的危险因素；产 ESBLs 菌株基因型主要为 TEM+CTM-M-14,主要流行克隆为 ST131型。碳青霉烯类及酶抑制复合剂是治疗社区获得性血流感染产 ESBLs 大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的理想药物。本次研究的标本数量较少,有待扩大菌株数量做进一步研究。
关键词： 社区获得性血流感染 超广谱 β-内酰胺酶 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 危险因素 -
泛耐药肺炎克雷伯菌株的医院内流行特性的研究
目的 了解华山医院泛耐药肺炎克雷伯菌株及其流行的特点.方法 收集2006年8月-2009年12月对CLSI推荐常规检测药物均耐药的肺炎克雷们菌临床分离株,共57株.所有菌株都进行药物敏感试验、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)初筛及表型确证试验、改良Hodge试验、等电聚焦电泳,聚合酶链反应及其产物测序、接合试验、肠杆菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)和多位点序列分型(MLST).结果 所有菌株都携带blaKPC-2、blaCTX-M-14、blaSHV12和blaTEM-1及qnrB和aac(6')-I b-cr基因.57株细菌中ST423型5株,MIST ST11型52株.ST423型散发,而ST11型呈医院内流行.57株细菌都对替加环素耐药,对多黏菌素、米诺环素和多西环素部分敏感.结论 本次泛耐药肺炎克雷们流行主要为ST11型菌株;不同的肺炎克雷伯菌株,播散能力不同;检出泛耐药肺炎克雷伯菌时应增加检测药物的种类.
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产ESBL肺炎克雷伯菌中16S rRNA甲基化酶的分布与相关耐药性的研究
目的 调查我院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株16S rRNA甲基化酶基因的分布以及与耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集我院临床2010年3月至9月分离出69株非重复产ESBL肺炎克雷伯菌,采用PCR法检测16S rRNA 甲基化酶基因,并对阳性菌株进行ESBL基因及整合子基因分析,通过DNA直接测序确定.质粒接合试验和质粒消除试验确定16S rRNA甲基化酶基因的传播途径,利用ERIC-PCR技术进行基因分型.结果 69株产ESBL肺炎克雷伯菌中有rmtB阳性菌株20株(28.9％),其中2株同时携带有rmtB和armA.在20株产16SrRNA甲基化酶菌株中,均携带有CTX-M基因,测序显示14株CTX-M-14基因,6株CTX-M-15基因；14株携带有TEM-1基因；8株携带有SHV基因,测序显示5株SHV-12基因,3株SHV-11基因；3株携带有OXA-10基因；3株携带有VBE-1基因.另有12株携带有int1阳性,含有5种不同的耐药基因盒,分别携带drfA25、drfA1、drfA12、aadA1、aadA2、sat和blaVEB-1基因.ERIC-PCR法显示20株16SrRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌主要分为5型,A型为优势流行克隆株.质粒接合和消除试验发现A型克隆株KP5和KP16 rmtB均位于一质粒上并通过接合传播.结论 本院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株中存在16S rRNA甲基化酶基因rmtB的普遍流行,导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.rmtB可通过水平基因传播和克隆传播的两种方式进行播散,并且存在同时产ESBLs、16S rRNA甲基化酶和Ⅰ类整合子的肺炎克雷伯菌的传播.
关键词： 肺炎克雷伯菌 16S rRNA甲基化酶 整合子类 抗药性 细菌 -
从耐药肺炎克雷伯菌中检出aac(6′)-Ib基因新亚型
为深入了解一组分离自浙江省杭州地区和湖州地区耐药肺炎克雷伯菌之氨基糖苷类药物耐药的遗传学背景,我们同时检测了47株耐药肺炎克雷伯菌的15种氨基糖苷类修饰酶和6种16S rRNA甲基化酶基因.现报道如下.
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肺炎克雷伯临床菌株新基因组岛KpGI-2的鉴定
目的 研究肺炎克雷伯临床耐药菌株新基因组岛KpGI-2的结构和功能.方法 采用PCR方法自一株肺炎克雷伯耐药菌株HS04160扩增得到新的插入序列KpGI-2,通过测序以及生物信息学方法分析其序列结构并推测其生物学功能,采用细菌生长试验证实其生物学功能.结果 phe55 tRNA基因位点处PCR扩增得到的6.4 kb的插入序列KpGI-2,序列分析发现其GC含量为38.03%,明显低于肺炎克雷伯菌株基因组平均的GC含量(57.5%).KpGI-2中含有163 bp的重复序列,可以确定为一个新的基因组岛.KpGI-2携带有5个orf,其中orf5与沙门菌属中的Fic(fllamentation induced by cAMP)蛋白具有高度相似性.肺炎克雷伯临床菌株普遍携带有一个高度保守的fic基因以及一个相对保守的fic基因,携带有KpGI-2的临床菌株HS04160丢失了相对保守的fic基因.通过细菌生长试验分析发现orf5以及KpGI-2在cAMP诱导下对细胞生长具有调节作用,KPGI-2的功能可能与细菌生长的调节相关.结论 KpGI-2是位于肺炎克雷伯临床菌株基因组岛插入热点phe55 tRNA基因位点上的一个新基因组岛,其携带的基因与细胞生长相关.
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质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌儿童分离株耐药基因研究
目的 研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌临床儿童分离株的耐药特点及分子流行病学特征.方法 收集温州医学院附属第二医院2010年7月-2011年6月从儿童标本中分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌12株,所有菌株为非重复菌株,菌种鉴定采用全自动微生物分析仪.改良的Hodge试验筛选产碳青霉烯酶阳性菌株,采用PCR法检测KPC、IMP、bla(s)、VIM、SPM和整合酶基因,测序确定基因型.对菌株进行质粒结合试验、质粒消除试验检测质粒的转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析耐药菌株的同源性.结果 12株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑的敏感率分别为8.3％、41.7％、58.3％、8.3％、8.3％、33.3％；12株菌均携带有KPC-2基因,且同时携带有TEM-1和SHV型β-内酰胺酶基因,其中SHV-11-like和SHV-1 2-like各6株；11株携带CTX-M型基因,其中4株为CTX-M-14-like基因,6株CTX-M-15-like基因；2株携带有OXA-10型基因,1株携带有PER-1基因.未检出NDM-1、GIM、SPM、SIM、VIM型碳青霉烯酶基因.12株均为Ⅰ类整合酶基因(int1)阳性.2株通过接合试验把质粒传递给受体菌EC600.所有接合子blaTEM-1基因阳性、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因阳性及对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素和头孢噻肟耐药,接合子ESBL基因型与供菌一致.2株菌经质粒消除后对亚胺培南的MIC值均有较大程度降低,消除后KPC-2基因扩增为阴性.12株KPC-2基因阳性菌株经PFGE分成5个基因型,主要为B型和C型.结论 KPC-2型碳青霉烯酶基因已经在儿童肺炎克雷伯菌中播散,常伴随携带多种类型的ESBL基因和Ⅰ类整合酶基因,部分耐药基因可通过质粒播散.
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1株分离自骨髓炎患者的泛耐药肺炎克雷伯菌的特性研究
肺炎克雷伯菌（ Klebsiella pneumoni-ae， KPn）广泛存在于自然界中，是院内感染的重要病原菌，可引起肺炎、尿路感染、败血症等。骨髓炎是一种复杂的临床感染性疾病，葡萄菌属是其常见的病原菌，肺炎克雷伯菌引起骨髓炎的相关资料较少，仅在免疫力低下、新生儿中有几例报道。本实验室自平素体健成年男性骨髓炎患者的骨髓标本中分离出一株肺炎克雷伯菌FKA78，其表现出泛耐药特性，即除了对替加环素敏感外，对临床各类抗菌药物都表现出高水平耐药，而目前国内外关于肺炎克雷伯耐药菌的研究大多数局限于对氨基糖苷类药物敏感的产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型菌株。
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肺炎克雷伯菌耐药遗传元件样本和指标聚类分析初探
我们从新生儿中分离到1组(19株)厄他培南等碳青霉烯类药物耐药的多重耐药肺炎克雷伯菌( multidrugresistant Klebsiella pneumoniae,MDRKPN),对该组菌株进行了β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等药物的耐药相关基因和多药外排泵基因,以及毒力基因、可移动遗传元件的遗传标记检测,并对检测结果作了样本和指标聚类分析,以探讨菌株的亲缘性和耐药基因与可移动遗传元件相互关系.
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肺炎克雷伯菌多黏菌素耐药机制研究
目的 探讨肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药机制.方法 对临床分离的3株多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌(FK1149、FK1920和FK1934)和3株体外诱导多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌(FK660R、FK713R和FK729R),通过PCR检测多黏菌素耐药相关基因,包括pmrAB、phoPQ、mgrB、crrAB、mcr-1和mcr-2;采用PROVEAN平台预测耐药相关蛋白质的生物功能改变情况;采用实时荧光定量PCR检测pmrH、pmrC、mgrB和phoP基因的相对表达量;SDS-PAGE银染试验检测3株临床分离的多黏菌素耐药菌株中是否存在脂多糖(LPS)缺失现象;同时通过接合转移试验检测是否存在耐药性转移的可移动性元件.结果 本研究检测到多黏菌素耐药株中存在PmrA(G53V)、PmrB(T157P和R256G)、MgrB(F44C)和CrrB(E189K)等多种有义突变,在FK713R和FK729R中分别检测到ISkpn14和IS5-like插入序列;所有耐药菌株中均未检测到mcr基因;与对照菌株相比,所有临床多黏菌素耐药菌株和诱导多黏菌素耐药菌株中pmrH和pmrC基因的表达量均增加,phoP和mgrB的表达水平也发生了变化;临床耐药株FK1149中存在LPS部分缺失.结论 本研究中,pmrAB或mgrB基因突变引起的LPS修饰是肺炎克雷伯菌对多黏菌素耐药的主要机制;首次在临床分离的肺炎克雷伯菌中检测到可能与多黏菌素耐药相关的PmrA(G53V)、MgrB(F44C)和CrrB(E189K)突变.
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ISEcp1-like插入序列与CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的水平播散
20世纪90年代后,中国多个地区不断发现产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-ESBL)肠杆菌科细菌的流行.近年,在4组CTX-M-ESBL(CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9和CTX-M-25)基因上游均发现存在ISEcp1-like插入序列,其对CTX-M-19、CTX-M-2以及氨基糖苷类耐药基因rmtC的转移能力亦得到证实.目前CTX-M-ESBL在我国临床菌株中的传播与ISEcp1-like插入序列的关系尚不清楚.本文旨在探讨ISEcp1-like序列与CTX-M-ESBL在肺炎克雷伯菌临床株中传播的关系进行研究.
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阴沟肠杆菌B8提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用
阴沟肠杆菌B8分离自水稻叶片.临床分离菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)87株,MSSA(不耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)38株,MRSCON(耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌)16株,MSSCON(不耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌)5株,大肠杆菌10株,铜绿假单胞菌25株,阴沟肠杆菌14株,不动杆菌26株,肺炎克雷伯菌8株,共229株.阴沟杆菌O29和O29M作标准菌株.
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超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究
按质粒所携带编码基因同源性的不同，将超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)分为4类，即TEM型、SHV型、TEM/SHV混合型和非TEM/非SHV型(包括PER、TOHO、CTX-M、OXA型等)。本文报告绍兴地区产ESBLs细菌基因分型的初步结果。 临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ESBLs的细菌42株(其中大肠埃希菌26株，肺炎克雷伯菌16株)。用PCR进行酶基因分型。PCR扩增引物，根据TEM-1和SHV-1编码基因序列设计，TEM引物序列分别为：5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′和5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′；SHV引物为5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′和5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。待测菌株用碱裂解法提取质粒DNA。PCR反应体积为100μl，含1×PCR反应缓冲液，3.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dNTPs,500μmol/L引物，1.6U Taq酶(Promega)，10～100ng质粒DNA模板。
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肺炎克雷伯菌多重耐药机制的研究
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoni-ae,Kpn)是引起医院内感染的常见病原菌之一.用PCR法检测9种氨基糖苷类修饰酶基因、9种β-内酰胺酶编码基因及Ⅰ类整合酶基因并对整合子进行分析,采用纸片扩散法选出58株多重耐药的Kpn,测定对亚胺培南等17种抗菌药物的敏感性.
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大蜡螟感染模型在肺炎克雷伯菌毒力研究中的应用
目的 评价肝脓肿相关肺炎克雷伯菌的大蜡螟感染模型,建立肺炎克雷伯菌毒力检测的新方法.方法 收集无锡市第二人民医院2016年1月至2017年12月分离肝脓肿相关肺炎克雷伯菌12株,痰液、尿液中分离的20株肺炎克雷伯菌作为经典非高毒力肺炎克雷伯菌(经典组);所有菌株进行黏液丝试验,PCR检测肺炎克雷伯菌常见的高毒力的荚膜血清型(K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57),大蜡螟毒力试验测定同一时间段不同血清荚膜型的80％致死量(80％lethal dose,LD80)以及在同一浓度下达到80％幼虫死亡的时间(80％lethal time,LT80).结果 肝脓肿组荚膜血清型主要为K1、K2、K5、K20、K57,分别占41.7％(5/12)、8.3％(1/12)、8.3％(1/12)、8.3％(1/12)、33.4％(4/12);经典组未检出高毒力荚膜血清型.肝脓肿组黏液丝试验阳性率为75％(9/12),经典组的黏液丝试验的阳性率为10％(2/20).大蜡螟毒力试验显示在浓度为1×105 CFU/ml至1×108 CFU/ml时,不同的菌株对大蜡螟幼虫的致死率呈现浓度依赖性,接种12 h后,K1、K57组的死亡幼虫数量显著高于K2、K5、K20组及经典组;接种96 h肝脓肿组的LD80分别为:1×106 CFU/ml(K1、K57);1×107 CFU/ml(K2、K5、K20).结论 我院分离的肝脓肿相关肺炎克雷伯菌均为高毒力菌株,大蜡螟模型菌液接种后12 h可进行肺炎克雷伯菌毒力的检测.
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产IMP-4和KPC-2碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌PMQR基因检测及分子流行病学研究
产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌是近些年来导致医院内感染常见的条件致病菌之一，其耐药特征、产生碳青霉烯酶的基因型、质粒介导喹诺酮耐药基因（ PMQR）的分布及流行的克隆株等会随地域的差异而不同。我们研究发现本地区24株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中均携带 KPC-2基因，还有5株携带IMP-4基因，且24株产酶菌株中均携带PMQR，包括 qnrS112株， qnrA111株， qnrB411株，其中3株同时携带有包括qnrS1、qnrA1、qnrB4基因，1株同时携带qnrS1、qnrA1、qnrB4、acc （6′）-cr 基因；另外17株携带有acc（6′）-Ib基因，其中9株为acc（6′）-Ib-cr基因，7株为acc（6′）-Ib-suzhou基因，1株为acc（6′）-Ib基因野生型。不携带碳青霉烯类酶基因肺炎克雷伯菌的携带1种PMQR基因以上的阳性率（23．7％）显著低于携带碳青霉烯类酶基因菌株（91．7％），差异有统计学意义（χ2＝62．00，P＜0．01）。
