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慢病毒介导SOX9基因转染骨髓间充质细胞中的基因表达
目的:构建携带小鼠SOX9基因的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质细胞中的表达.方法:从含有小鼠SOX9基因的质粒提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增目的基因.连接目的基因与经Age-Ⅰ酶切线性化的慢病毒载体,转化感受态的大肠杆菌对质粒进行扩增,筛出阳性转化子,经293T细胞包装,收集病毒后,通过基因测序和限制性核酸内切酶酶切的方法对质粒进行鉴定.Lenti-SOX9-EGFP体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率.同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达.结果:成功构建了携带SOX9基因慢病毒载体,Lenti-SOX9-EGFP能高效转染小鼠骨髓间充质细胞.RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞表达目的基因产物.结论:利用慢病毒介导SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质细胞,而且SOX9基因在小鼠骨髓间充质细胞中得到表达,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础.
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慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复
目的：明确在体内Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞对于关节软骨损伤修复的作用。方法：以慢病毒介导的Sox9基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），体外检测软骨特异性分子，将新西兰大白兔24只48个膝关节随机分为3组，动物麻醉后，双侧股骨滑车处的关节面上用直径4 mm的钻头钻孔，深度3 mm，穿透软骨下骨，造成全层关节软骨损伤，将转染后的细胞植入体内用以修复全层关节软骨损伤，实验组植入BMSCs-（Lenti-Sox9-EGFP）-藻酸钙复合物，实验对照组植入BMSCs-藻酸钙复合物，空白对照组只钻孔。术后6、12周分别进行光镜、电镜观察，以及HE、免疫组织化学染色检测软骨的修复程度。结果：经Sox9基因转染后的细胞在3 d时，Sox9基因表达高，随后下降。转染后3 d，Ⅱ型胶原开始表达，到14 d时达到高。表明Sox9过表达启动了兔骨髓间充质干细胞的软骨分化。组织学观察显示，实验组术后6周缺损处有透明软骨样组织填充，术后12周缺损处软骨和软骨下骨修复良好。两对照组，缺损处由纤维组织填充。免疫组织化学显示，修复组织内Ⅱ型胶原，免疫组化染色结果阳性强于两对照组。组织学评分结果显示实验组软骨损伤修复各时间点效果明显优于两对照组，差异有统计学意义。结论：Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进软骨损伤的修复。
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腺病毒介导的Sox9基因对椎间盘退变动物模型的疗效
目的:探讨腺病毒介导的Sox9基因对兔腰椎间盘退变模型的疗效.方法:采用新西兰大白兔的纤维环损伤法制作腰椎间盘退变模型,24周后,用注射法将腺病毒介导的Sox9基因注射到退变的椎间盘组织观察退变椎间盘组织的变化,行磁共振扫描拍片观察椎间盘变化情况,同时,取椎间盘用精确定量RT-PCR观察Ⅱ型胶原(Col2al)mRNA的变化.结果:核磁共振扫描拍片证实椎间盘退变有所恢复,精确定量RT-PCR法证实Sox9基因在转录水平上调了Col2al.结论:腺病毒介导的Sox9基因对兔椎间盘退变模型有明显治疗作用.
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SOX9与NM23基因在前列腺癌中的表达
目的：探讨SOX9、NM23基因在前列腺癌中的表达。方法选取16例前列腺癌患者与24例前列腺良性增生患者，取其病理组织采用实时荧光定量PCR测定其mRNA表达量。结果前列腺癌组患者NM23、SOX9 mRNA表达量与前列腺增生组患者比较明显更高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论通过对NM23、SOX9 mRNA表达量进行测定可为前列腺癌临床诊断提供可靠依据。
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SOX9基因在软骨发育过程中的表达谱分析及其质粒转染鼠骨髓基质细胞的实验研究
目的 检测并分析SOX9基因在软骨发育过程中的表达规律;构建其质粒并转染至培养的骨髓源基质细胞(BMSCs)中,通过细胞培养观察SOX9基因对BMSCs生长特性的影响,为可能的骨关节炎(OA)基因治疗提供理论基础.方法 用基因芯片技术建立妊娠胎鼠肢芽软骨发育过程的基因表达谱,分析SOX9基因在软骨发育过程中的表达规律;用噻唑蓝(MTT)法、免疫组织化学、苏木素-伊红(HE)染色、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测SOX9基因转染MSCs的效果及产物的表达.结果 SOX9基因在软骨发育过程中的软骨形成关键期表达显著上调;pDC316-SOX-9质粒转染骨髓基质细胞后可促进骨髓基质细胞的增殖,细胞有向软骨细胞分化趋势.结论 SOX9能够促进软骨形成,SOX9基因质粒转染的MSCs可望在软骨组织工程临床治疗中得到更广泛的运用.
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大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox9基因真核表达载体的克隆构建
目的:Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因,是前软骨细胞浓聚所必需的因子,其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化,以延长软骨发育成熟过程,延迟软骨发育,抑制软骨细胞凋亡,有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构.从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因,并构建其真核表达载体.方法:实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成.①实验材料:出生＜24h纯系清洁级新生SD大白鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:参考游洪波等方法,采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞,以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞总RNA,以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长,插入pGEM(R)-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒.结果:免疫组织化学证实,显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞.从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带,测吸光度值为0.263 5,A 260/A 280为1.8741,说明提取的总RNA完整性较好,纯度高,符合RT-PCR的要求.PCR产物经电泳可得到约2000 bp的特异性条带,与预期大小一致.经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒,成功地构建了Sox9质粒.结论:成功地分离纯化了骨骺干细胞,克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体,为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.
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sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达
背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。
目的：构建 sox9基因慢病毒载体以及 LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9和LMP1基因的表达情况。
方法：双酶切从 GeneArt 提供的含 sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。
结果与结论：测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 sox9基因的 Lenti-SOX9-GFP 慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带 LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。 -
慢病毒介导SOX9基因转染小鼠脂肪干细胞的实验研究
目的 构建携带SOX9基因的慢病毒载体,转染小鼠脂肪干细胞,观察SOX9基因在脂肪干细胞中的表达.方法 将实验分为3组,体外培养、分化小鼠ADSCs,行免疫荧光鉴定后,使用RT-PCR的方法获取小鼠SOX9基因编码区片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产Pwpxl-MOD2-SOX9,将四质粒Pwpxl-MOD2-SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染包装细胞293T,获得目的基因SOX9基因的重组病毒(实验组A);同时转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照(实验组B);未转染组为实验组C.收集病毒后,通过基因测序和限制性核酸内切酶酶切的方法对质粒进行鉴定.将包装好的慢病毒Pwpxl-MOD2-SOX9体外转染脂肪干细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率.同时,利用RT-PCR和Western blot检测小鼠SOX9基因的表达.结果 成功分离、培养大鼠的脂肪干细胞;酶切、PCR及测序鉴定证实,慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插人片段为基因SOX9,包装产生的病毒能较为高效转染小鼠脂肪干细胞.RT-PCR和Western blot检测显示,经SOX9基因转染的小鼠脂肪干细胞表达目的基因产物.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染脂肪干细胞后能够稳定表达SOX9,这为慢病毒及SOX9基因在软骨组织工程学中的进一步研究奠定了基础.
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Sox9基因在马蹄内翻足大鼠模型足踝软骨组织表达的实验研究
目的:研究Sox9基因在软骨组织表达异常是否与马蹄内翻足发病相关.方法:制作先天性马蹄内翻足(idiopathic congenital talipes equinovarus,ICTEV)大鼠模型,取其足踝软骨组织,用RT-PCR及免疫组化方法对Sox9基因表达量和部位与对照组进行对比分析.结果:Sox9基因在ICTEV大鼠模型足踝软骨组织的表达无论是在mRNA还是蛋白水平均比对照组高.结论:Sox9基因在ICTEV大鼠模型足踝的软骨组织表达升高可能与马蹄内翻足发病相关.
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SOX9基因下调JAK2/STAT3信号诱导肺癌细胞凋亡及降低免疫逃逸相关因子表达的研究
目的:探讨SOX9基因对肺癌细胞凋亡、免疫逃逸相关因子HIF-1α和VEGF表达及JAK2/STAT3信号通路的影响.方法:以脂质体Lip-2000为载体,将针对SOX9特异性靶点的siRNA转染肺腺癌A549细胞,Western blot检测SOX9的蛋白表达;CCK8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;DCFH-DA检测ROS水平;Western blot检测免疫逃逸相关因子HIF-1α、VEGF及JAK2/STAT3信号通路p-JAK2、p-STAT3和下游相关基因survivin的蛋白表达.结果:转染SOX9的siRNA的肺癌细胞SOX9的表达明显降低;与阴性对照组比较,si-SOX9组细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,ROS水平显著升高,HIF-1α、VEGF、p-JAK2、p-STAT3和survivin的蛋白表达均显著降低.结论:siRNA抑制SOX9基因可降低肺癌细胞活力,诱导细胞凋亡,降低免疫逃逸相关因子HIF-1α和VEGF表达,机制可能与提高细胞ROS水平和下调JAK2/STAT3信号通路有关.
关键词： 肺癌 SOX9基因 凋亡 JAK2/STAT3信号通路 免疫逃逸 -
转录因子SOX9与肿瘤发生的关联
SOX9是与性别决定密切相关的转录因子,属于SOX基因家族的一员,可维持从胚胎期开始机体多种生命活动的正常运转.SOX9表达异常可引起一系列生理紊乱,并与肿瘤的发生密切相关.本文对SOX9在不同生理病理条件下的表达情况,与microRNA的相互作用以及可能参与的潜在的多种调节通路进行综述,以期为SOX9在疾病特别是肿瘤发生发展中的作用研究提供新的信息.
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Sox9诱导人脐血干细胞向软骨细胞分化的实验研究
目的：探讨Sox9基因对脐血干细胞向软骨细胞分化的影响。方法体外分离培养人脐血干细胞，采用脂质体转染Sox9载体质粒，观察转染后细胞形态的变化，免疫组化染色观察collagenⅡ、aggrecan的表达，RT-PCR检测collagenⅠ、collagenⅡ、aggrecan的mRNA水平变化，Western blot检测collagenⅡ的表达变化。结果 Sox9对脐血干细胞形态无明显影响，与传统方法诱导组相比，Sox9转染后可明显促进脐血干细胞向软骨细胞分化。结论 Sox9对脐血干细胞的软骨分化有很强的调控作用，脐血干细胞可作为组织工程软骨一种良好的种子细胞。
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骨髓间充质干细胞对大鼠退变椎间盘的修复作用
目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠退变椎间盘的修复作用.方法 采用随机数字表法将2015年10月至2016年12月利用腰椎间盘可控轴向加压装置构建出来的40只退变椎间盘大鼠分为对照组(未接受任何治疗)、Sox9转染MSCs组(制备Sox9基因慢病毒载体转染MSCs用于注射)、RADA-16+ MSCs组(制备荷载多肽粉末RADA-16的MSCs用于注射)、RADA-16+ Sox9转染MSCs组(制备荷载RADA-16和Sox9转染的MSCs用于注射)各10只,分别向L3/4、L4/5、L5/6椎间隙注射制备的上述MSCs混合溶液.处死大鼠,取椎间盘制备病理切片,采用免疫组化染色法检测髓核组织中Ⅱ型胶原的表达水平(灰度值分级).对治疗前后不同时间段影像学指标(MRI、X线)、Ⅱ型胶原表达水平结果进行比较和分析.结果 术前四组髓核矢状径指数、根袖直径、神经根鞘袖和硬膜囊的夹角、病变间隙、邻近节段椎间隙高度变化、Ⅱ型胶原灰度值分级比较,差异无统计学意义(P均＞0.05);术后1、2、3个月各指标比较表明,疗效由高至低分别为RADA-16+ Sox9转染MSCs组、RADA-16+ MSCs组、Sox9转染MSCs组、对照组,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 RADA-16+ Sox9转染MSCs修复退变椎间盘效果理想.
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SRY调控性腺分化研究的进展
人类性腺的分化是由基因所决定的.在胚胎的未分化性腺分化为睾丸或卵巢时,性别就决定了.这个过程是一个复杂而精细的过程.位于Y染色体上SRY基因表达,引发了一个复杂的遗传过程,导致了睾丸的分化.然而,仅有少数46,XY性反转的患者检出SRY基因的突变.其他参与性腺分化的基因有待发现.近的研究工作表明,睾丸的分化受到胰岛素受体家族基因的调控,正常情况下SRY需通过两个不同的核运输途径使足够剂量的SRY蛋白进入细胞核调控性腺分化过程.
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椎间盘退变中影响Sox9基因的相关因素
随着分子生物学的发展和对椎间盘退变的生物学机制的深入研究,人们已经越来越不满足于传统的椎间盘退变治疗方法,如卧床休息、理疗、药物治疗和手术治疗等.这些传统方法仅能短期缓解椎间盘退变给患者带来的痛苦,并不能从根本上终止退变进程.
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腺病毒介导的Sox9基因对兔退变腰椎间盘的治疗作用
目的:应用MRI和免疫组织化学方法观察腺病毒介导的Sox9基因对兔退变腰椎间盘的治疗作用.方法:28只新西兰大白兔随机挑选7只作为正常对照组(不建立模型),其余21只利用纤维环损伤法制作腰椎间盘退变模型后随机分为模型对照组、AdGFP治疗组和AdSox9治疗组,每组7只.30周后行磁共振扫描观察椎间盘信号值变化情况,用免疫组织化学法观察椎间盘组织Ⅱ型胶原(Col2al)表达的标记指数.结果:3个模型组与正常对照组比较,椎间盘Col2al表达的标记指数及磁共振信号值间差异均有统计学意义(P＜0.001),AdSox9治疗组与其他2个模型组比较,差异亦有统计学意义(P＜0.001).结论:腺病毒介导的Sox9基因对腰椎间盘退变有治疗作用.
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哺乳动物性别决定基因的研究进展
目的 了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能.方法 查阅本领域国内外文献并进行综述.结果 SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定.结论 性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义.
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腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2对兔退变椎间盘组织Sox9基因的影响
目的 观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2(AdvBMP-2)转染到兔椎间盘髓核细胞后,对椎间盘细胞中Sox9基因的影响.方法 纯种成年新西兰大白兔35只,采用纤维环损伤法制作腰椎间盘退变模型,24周后行2次手术,其中25只对腰椎间盘髓核组织注射AdvBMP-2,每只注射2个椎间盘作为实验组,注射量为每个腰椎间盘20μl(100×105 pfu);同时每只取2个未做注射的腰椎间盘作为自身空白对照组.其余10只兔每只注射2个腰椎间盘各20μl磷酸盐缓冲液(PBS)作为实验对照组,全组共120个椎间盘.2次术后1～12周的不同时间段分别取出各组椎间盘组织,采用精确定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定椎间盘组织中Sox9 mRNA的含量.结果 2次术后1周,实验组与自身空白对照组Sox9 mRNA含量值经配对t检验,差异有统计学意义(t=3.828,P＜0.05).2次术后2周,3组结果经方差分析,差异有统计学意义(F=16.971,P＜0.01);各组间再行两两q检验,实验组与自身空白对照组间,差异有统计学意义(q=6.985,P＜0.01);实验组与实验对照组间,差异有统计学意义(q=7.094,P＜0.01);实验对照组与自身空白对照组间,差异无统计学意义(q=0.647,P＞0.05).实验组与自身空白对照组间配对t检验,差异有统计学意义(t=4.976,P＜0.01).2次术后4周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,差异有统计学意义(t=7.952,P＜0.01).2次术后8周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,差异有统计学意义(t=6.986,P＜0.01).2次术后12周,3组结果经方差分析,差异有统计学意义(F=9.97,P＜0.05).各组问行两两q检验,实验组与自身空白对照组间,差异有统计学意义(q=6.010,P＜0.01);实验组与实验对照组间,差异有统计学意义(q=6.214,P＜0.01);自身空白对照组与实验对照组,差异无统计学意义(q=0.614,P＞0.05).实验组与自身空白对照组间配对t检验,差异有统计学意义(t=5.075,P＜0.01).结论 AdvBMP-2转染兔退变椎间盘髓核细胞后,可使退变髓核组织中Sox9的含量在一定的时间内增加,BMP-2可能通过调节Sox9基因的表达对退变的椎间盘具有修复功能.
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Sox9基因对兔腰椎间盘退变的作用
目的 观察腺病毒介导的Sox9基因(AdSox9)对兔腰椎间盘退变模型的疗效.方法 25只新西兰大白兔用针刺法制作腰椎间盘退变模型,24周后,将AdSox9注射到退变椎间盘组织中,6周后用MRI观察椎间盘变化,免疫组织化学法观察椎间盘组织Ⅱ型胶原(Col2al)的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察Col2al mRNA的变化.结果 MRI示:治疗后L2～3、L3～4、L4～5的椎间盘信号值分别为:580.43±76.43、612.74±56.73、605.87±76.53,模型对照组为:238.43±43.65、217.65±38.95、236.98±76.53;Col2al表达的标记指数:治疗后L2～3、L3～4、L4～5的椎间盘分别为:42.48±5.53、45.34±15.43、42.47±25.45,模型对照组为:11.68±10.08、12.68±13.75、13.38±26.53;Col2al mRNA的表达:治疗后L2～3、L3～4、L4～5的椎间盘分别为6570.43±174.53、7653.75±158.93、6905.83±119.23,模型对照组为:1256.76±89.76、1217.65±18.65、1132.97±47.65.3种方法均示,治疗组与模型对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 AdSox9对退变椎间盘动物模型有治疗作用.
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男性先天性尿道下裂易感基因的研究进展
尿道下裂是一种多基因遗传性疾病.近年随着分子生物学理论和技术的革新,国内外学者试图从分子生物学水平揭示尿道下裂的发生机制.通过对易感基因,尤其选择起核心调节作用基因的研究,对于在尿道下裂患儿中进行变异筛查及阐明尿道下裂发生的遗传学基础具有重要的意义.以往尿道下裂易感基因的研究热点,主要集中在男性性别分化基因及雄激素受体相关基因两个方向[1].由于临床上发现尿道下裂常伴发于性别分化异常,因此不少学者认为尿道下裂是性别发育畸形中一种不同程度的表现,推测性别分化与尿道下裂的发生有一定关系[2].目前研究与男性性别分化有关的基因中,较肯定的有SRY基因、SOX9基因、WT1基因等[3-4].
