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肺纤方提取物干预肺纤维化模型大鼠微血管内皮细胞黏附及游走迁移作用研究
目的:通过观察肺纤方干预肺间质纤维化大鼠肺微血管内皮细胞体外培养的影响,探讨肺纤方抗肺间质纤维化微血管内皮细胞黏附及游走的机制.方法:从肺纤维化模型组大鼠分离培养肺微血管内皮细胞.将其等量分为空白对照组,氯沙坦(10μg/mL)组,泼尼松(5μ g/mL)组,肺纤方大、中、小剂量(100、60、20μ∥mL)组.WST-1法检测肺微血管内皮细胞的生长黏附率.Transwell法检测肺微血管内皮细胞的迁移细胞进行计数.结果:与空白对照组、泼尼松组比较,肺纤方大、中剂量和氯沙坦可以显著抑制肺微血管内皮细胞的黏附率,作用48h尤为明显(P＜0.01).与空白对照组、泼尼松组比较,肺纤方大、中剂量和氯沙坦可抑制内皮细胞的迁移(P＜0.01).结论:肺纤方可以显著抑制肺间质纤维化大鼠肺微血管内皮细胞的黏附和游走迁移,从而具有抗肺间质纤维化作用.
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Ⅰ型Na+/H+交换器在LPS引起的大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的作用
目的 探索Ⅰ型Na+/H+交换器(NHE1)在脂多糖(LPS)引起的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)损伤中的作用.方法 培养大鼠PMVECs.MTT比色试验检测细胞活力;比色法测试上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)浓度;BECEF-AM荧光探针染色细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内酸碱度,检测NHE1的活性;PT-PCR技术检测NHE1的mRNA表达.结果 LPS不仅使细胞活力降低35%(P＜0.05),使上清液中LDH和MDA分别升高3倍和2.5倍(P＜0.05),而且使NHE1的活性增强,mRNA表达增多(P＜0.05).但是NHE1的抑制剂--环己阿米洛利(HMA)能显著抑制LPS引起的这些变化(P＜0.05).结论 NHE1的活性增强和表达增多是LPS引起大鼠PMVECs损伤的重要机制.
关键词： Ⅰ型Na+/H+交换器 脂多糖 肺微血管内皮细胞 环己阿米洛利 -
脂多糖对大鼠肺微血管内皮细胞形态及酶学的影响
肺微血管内皮主要由肺微血管内皮细胞和基膜组成,与ARDS、脓毒症、免疫反应、肿瘤转移和多器官功能障碍的发生密切相关.本实验主要观察脂多糖(LPS)对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)形态及血管紧张素转换酶(ACE)、乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响.
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大鼠肺微血管内皮细胞磷酸二酯酶mRNA表达与活性检测
目的 检测大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)内磷酸二酯酶(PDE)同功酶mRNA表达及基础酶活性,明确PMVECs存在的PDE亚型及体外活性. 方法 采用植块法分离培养PMVECs,RT-PCR法测定PDE mRNA表达,以高效液相色谱(PHLC)检测环核苷酸在酶反应前后的含量变化,计算PDE活性. 结果 检测结果 显示,PMVECs中含有PDE1A、1C、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、10A、11A共17种PDE mRNA,而PDE1B mRNA 未见表达,酶量在5～20μl范围内与PDE活性存在良好的线性关系. 结论 PMVECs中存在17种PDE基因表达,并有较高的基础酶活性.
关键词： 肺微血管内皮细胞 磷酸二酯酶 反转录-聚合酶链反应 高效液相色谱 大鼠 -
肺微血管内皮细胞通透性调控的信号转导机制
肺微血管内皮细胞通透性增加是急性呼吸窘迫综合征等疾病的病理基础,多种信号转导系统参与其通透性调控,如细胞内Ca2+、蛋白激酶C、环磷酸腺苷、丝裂原激活蛋白激酶、小G蛋白.这些信号转导系统的激活和调控机制各异,并且相互关联组成复杂的信号网络.肺微血管内皮细胞中信号转导的相互作用将是研究方向之一.
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脓毒症糖尿病大鼠肺脏血管内皮细胞损伤及DDAH2/NOS/NO系统变化
目的 探讨糖尿病脓毒症大鼠肺微血管内皮细胞损伤及一氧化氮系统在其发生机制中的作用.方法 中国医科大学动物实验中心,清洁级Wistar大鼠64只随机(随机数字法)分为A、B、C、D四组,(健康对照组,n=16、糖尿病组,n=16、单纯脓毒症组,n=16、糖尿病发生脓毒症组,n=16).糖尿病模型,一次性腹腔注射链脲左菌素60 mg/kg,48 h后随机测定尾静脉末梢血糖≥16.67 mmol/L,为模型成功,饲养4周后下一步试验.脓毒症模型:一次性尾静脉注射大肠杆菌内毒素10 mg/kg体质量.测定全血Tie-2mRNA表达,测定肺脏组织对伊文思蓝渗透性及肺脏干湿质量比、血清及肺组织NO含量,real-time PCR测定肺组织诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、DDAH2 mRNA水平.数据采用单因素方差分析,并用LSD法进行组间两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 糖尿病脓毒症组较单纯脓毒症组全血Tie-2mRNA表达增多(19.72±0.70) vs.(3.99-±0.92),P=0.00,肺干湿质量比更为降低(0.19±0.01) vs.(0.22±0.01),P =0.000,肺脏对EBD通透性增加更为严重(3.76±0.77) vs.(1.74±0.24),P=0.000,血清—氧化氮水平增高水平D组低于C组,(123.13 ±4.24) vs.(188.30±5.18),P=0.000.在肺组织中表达,两组均显示出高NO水平(53.62 ±6.70),(23.63±3.92) vs.(10.37±1.29),P=0.00,且D组近2倍高于C组(P=0.00)A、B、C组eNOS表达各组之间差异无统计学意义,D组低于A组,(0.07 ±0.02) vs.(0.38 ±0.05),P=0.017; iNOS表达C、D组均高于A组,(80.23±2.49),(32.48 ±5.37) vs.(1.74 ±0.23),均P=0.00；D组高于C组(P=0.00).DDAH2mRNA水平D及C组均低于A组,(0.49±0.13), (7.26±0.50) vs.(11.96±0.55),P均=0.00；D组低于C组(P=0.00).结论 糖尿病脓毒症机体表现为更为严重内皮细胞损伤,严重NO系统调节失衡是糖尿病脓毒症血管内皮损伤加重的可能机制.
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src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α
目的 探讨src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响.方法 体外培养Wistar大鼠PMVEC,按随机数字表法分组(n=4),10 mg/L LPS刺激1h、3h、6h、12h、24 h或0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS刺激24 h；蛋白激酶C抑制剂(BIM)预处理0.5h或50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后再加入10 mg/L LPS孵育24 h,酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α量(ng/L).采用SPSS10.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P＜ 0.05为差异具有统计学意义.结果 0.1、1、10 mg/L LPS刺激PMVEC 24 h后的,TNF-α分泌量分别为(253.70±23.55)、(327.88±37.25)、(403.20±36.22) ng/L,均高于未刺激组(82.28±22.56) ng/L(均P =0.000)；10 mg/L LPS刺激PMVEC后,TNF-α分泌量于1h升高(170.11±49.22) ng/L,6h达峰值(404.82±13.78) ng/L,刺激24 h后仍维持高水平(395.67±36.23) ng/L,分别与未刺激组(84.60±23.61) ng,/L比较:P=0.001,0.000,0.000；BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激,TNF-α分泌量(200.44±27.39) ng/L较LPS单独刺激(402.28±31.07) ng/L显著较少(P=0.000)；与LPS单独刺激比较(407.28±32.64) ng/L,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后,LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应(195.20±13.28)ng/L也显著下降(P=0.000).结论 下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应,从而减轻PMVEC的炎症反应.
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RhoA/mDia1参与LPS诱导肺微血管内皮细胞表达p-ERM
目的 探讨脂多糖(LPS)是否影响大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)磷酸化埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(p-ERM)的表达及与RhoA/mDia1的关系.方法 于安徽医科大学第一附属医院呼吸内科实验室,取购自安徽省实验动物中心的健康雄性、体质量100～120 g、SPF级SD大鼠的肺脏,体外培养PMVEC,随机(随机数字法)分为量效组、时效组和干预组(1μg/mLRhoA抑制剂(C3 transferase)与PMVEC预孵育240 min再加入10 μg/mL的LPS继续孵育30min),Western印迹检测ERM、p-ERM及mDia1表达量.多组变量间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验方法分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 PMVEC中均表达ERM、p-ERM及mDia1.量效组p-ERM和mDia1表达随LPS浓度(0、0.1、1、10 μg/mL)增加而升高:p-ERM为(0.520±0.101)、(0.657±0.092)、(0.891 ±0.167)、(1.227±0.106),0μ/mL组与0.1μg/mL组比较,P＞0.05,其余P＜0.01;mDia1为(0.200±0.102)、(0.430±0.121)、(0.603±0.154)、(0.887±0.204),0.1μg/mL组与1μg/mL组比较,P＞0.05;其余P＜0.05.时效组p-ERM表达量于15 min开始上升(0.670±0.149),30 min出现高峰(1.175±0.103),之后下降,60 min (0.959±0.189),90 min (0.842±0.129),120 min仍持续较高水平(0.767±0.097),表达量均高于对照组(0.471±0.157),差异具有统计学意义(15 min组与120min组比较、60 min组与90 min组比较及90 min组与120 min组比较,P＞0.05;其余P＜0.05);mDia1表达量于15 min开始上升(0.779±0.035),30 min达高峰(0.889±0.036),之后下降,60min (0.648±0.019),90 min (0.582 ±0.068),120 min仍持续较高水平(0.526±0.059),均高于对照组(0.284±0.118),差异有统计学意义(均P＜0.01).C3 transferase能显著下调LPS诱导的p-ERM的表达[对照组:(0.339±0.069);C3+ LPS组:(0.438±0.07);C3组:(0.352±0.071);LPS组:(0.634±0.191);C3 +LPS组与LPS组比较,P＜0.01],mDia1也被C3transferase抑制[对照组:(0.449 ±0.122);C3+ LPS组:(0.380±0.148);C3组:(0.404±0.164);LPS组:(0.622±0.174);C3+ LPS组与LPS组比较P=0.00].结论 LPS诱导大鼠PMVEC内p-ERM表达增加,C3 transferase抑制RhoA/mDia1信号通路后使其表达下调.
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Sonic hedgehog信号通路参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞表达RACK1
目的 探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是否影响大鼠肺微血管内皮细胞(rat puhnonary microvascular endothelial cells,RPMVEC)表达活化的蛋白激酶C受体1(protein kinase C receptor 1,RACK1)及Sonic hedgehog(SHH)信号通路对其表达的影响.方法 取健康雄性、体质量100～120 g、SPF级SD大鼠,于安徽医科大学第一附属医院呼吸内科实验室,体外培养RPMVEC,免疫细胞化学法检测RACK1蛋白在RPMVEC表达,随机分为:LPS和SAG干预实验:(1)LPS量效组,0.1、1、10 mg/L LPS与RPMVEC孵育8 h;LPS时效组,10 mg/L LPS与RPMVEC孵育0、2、4、8、12、24h.(2)SAG量效组,0.1、1、10μmol/L RPMVEC孵育8 h;SAG时效组,1 μ mol/L SAG与RPMVEC孵育0、2、4、8、12、24h.(3) LPS+SAG干预组,10 mg/L LPS预孵育1h后加入1μmol/L SAG继续孵育8 h;设空白组、LPS组和SAG组为对照.所有干预结束后Western blot法检测RACK1蛋白表达及RT-PCR法检测GLI-1 mRNA表达,多组变量间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用f检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫细胞化学染色法显示RPMVEC表达RACK1.(1)LPS量效组(0、0.1、1、10 mg/L):RACK1蛋白表达量随LPS浓度增加而升高,组间比较:P＜0.05;GLI-1 mRNA表达量为(1.109±0.063)、(1.039±0.135)、(0.813±0.066)、(0.770±0.105),1 mg/L组与10 mg/L组比较P＞0.05,其余组间比较P＜0.05;LPS时效组:LPS作用RPMVEC诱导RACK1蛋白自2h表达上调(0.370±0.010),12h达高(1.296±0.048),组间比较差异有统计学意义(F=1 272.204,P＜0.05);而GLI-1 mRNA表达自2h开始下调(0.929±0.007),组间比较差异有统计学意义(F=306.609,P＜0.05).(2) SAG量效组(0、0.1、1、10μmol/L):RACK1蛋白表达量未见明显变化,组间比较P＞0.05,GLI-1 mRNA表达量为(1.109±0.063)、(1.169±0.052)、(3.468±0.128)、(3.434±0.054),0μmol/L组与0.1μmol/L组比较,1μmol/L组与10μmol/L组比较P＞0.05,其余组间比较P＜0.05.SAG时效组:SAG作用RPMVEC诱导RACK1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);GLI-1 mRNA表达自2h上调(3.027±0.065),组间比较差异有统计学意义(F=132.841,P＜0.05).(3)LPS+SAG干预组:LPS+SAG作用RPMVEC表达RACK1蛋白量较LPS组下调(0.831±0.040 vs.1.189±0.149,P＜0.05),GLI-1 mRNA较LPS组上调(2.720±0.129 vs.0.796±0.082,P＜0.05).结论 RACK1表达增加参与LPS刺激RPMVEC过程,激活的SHH信号通路可下调LPS诱导RACK1表达.
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脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在氧化应激介导大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的调控作用
目的：探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1）在过氧化氢（H2O2）介导的大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）氧化应激中的调控作用。方法分离培养大鼠PMVECs并分成4组：对照组（未加H2O2）及各剂量H2O2组（终浓度分别为50、100、200μmol/L的H2O2）。在H2O2刺激细胞24 h后检测细胞增殖活性、细胞内活性氧水平及APE1蛋白表达，同时检测100μmol/ml的H2O2刺激细胞24、48、72 h后APE1蛋白表达并比较。另外利用慢病毒载体转染构建APE1过表达PMVECs，将其分成对照组（未加H2O2），H2O2组（终浓度为100μmol/L的H2O2），H2O2+空载体转染组（100μmol/L的H2O2刺激慢病毒空载体转染的细胞）及H2O2+APE1转染组（终浓度为100μmol/L的H2O2刺激APE1过表达细胞），并在24 h检测细胞活性氧水平及细胞增值情况。结果不同剂量组H2O2刺激细胞24 h后，四组间细胞增殖活性、活性氧的水平和APE1蛋白表达相对值差异均有统计学意义（F=80.238、445.608、547.566，P均<0.001）。在100μmol/L的H2O2刺激细胞0、24、48和72 h后，APE1蛋白表达相对值的比较有统计学意义（F=422.324，P<0.001），且随时间增加APE1表达也逐渐下降[（0.781±0.043）、（0.611±0.026）、（0.407±0.014）、（0.272±0.013），P均<0.05]。在转染慢病毒载体后，H2O2组活性氧水平明显高于对照组[（86.4±1.2）vs.（56.4±0.9），P<0.05]；而H2O2+APE1转染组细胞活性氧水平较H2O2组显著下降[（66.8±1.0）vs.（86.4±1.2），P<0.05]，细胞增殖活性明显增加[（0.209±0.001）vs.（0.153±0.001），P<0.05]。结论 H2O2刺激可导致APE1蛋白表达下降，而上调APE1表达可增加细胞增殖活性，并抑制活性氧的产生。因此，APE1可能具有减轻H2O2介导的大鼠PMVECs氧化应激反应的作用。
关键词： 过氧化氢 氧化性应激 活性氧类 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1 肺微血管内皮细胞 -
脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在脂多糖介导肺微血管内皮细胞氧化反应中的调控作用
目的 探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1 (APE1)在脂多糖介导肺微血管内皮细胞(PMVECs)氧化反应中的调控作用.方法 将体外培养人PMVECs分成4组:对照组(未加脂多糖的培养细胞)及各剂量脂多糖组(分别予以0.1、1、10μg/ml剂量脂多糖刺激培养细胞).分别在脂多糖刺激6、12、24 h检测细胞内活性氧及一氧化氮的水平并进行比较.同时利用携带目的基因慢病毒载体转染PMVECs,将其分成对照组,脂多糖组,GFP组及APE1组.对照组为未加脂多糖的培养细胞,脂多糖组为1μg/ml剂量脂多糖刺激的培养细胞,GFP组为1μg/ml的脂多糖刺激培养慢病毒空载体转染的细胞,APE1组为1μg/ml的脂多糖刺激培养携带APE1基因慢病毒转染的细胞.在12 h检测细胞内活性氧、一氧化氮的水平以及细胞APE1的表达情况. 结果 与对照组比较,各剂量组脂多糖刺激6、12、24 h后一氧化氮及活性氧分泌明显上升(P均＜0.05),且同一剂量组随着时间的推移,一氧化氮及活性氧分泌的比较,差异均具有统计学意义(P均＜0.05).在转染PMVECs12 h后,脂多糖组APE1的表达明显低于对照组,而APE1组细胞APE1的表达较脂多糖组显著提高(P均＜0.05).与对照组相比,脂多糖组能够诱导PMVECs的一氧化氮及活性氧生成显著增加,而APE1组能够一定程度抑制一氧化氮及活性氧的产生(P均＜0.05). 结论 APE1可通过抑制一氧化氮及活性氧的分泌从而减轻脂多糖介导PMVECs的氧化应激反应.
关键词： 脂多糖类 一氧化氮 活性氧类 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1 肺微血管内皮细胞 -
脂多糖诱导肺微血管内皮细胞炎性损伤机制的探讨
目的 探讨脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞( PMVECs)炎性反应及可能的机制.方法 分离培养SD大鼠肺微血管内皮细胞,将其分为对照组和LPS (0.01、0.1、1、10 mg/L)干预组.酶联免疫吸附法检测细胞间黏附分子-1( ICAM-1),放射免疫法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-8 (IL-8)的水平,实时荧光定量PCR检测TLR-4 mRNA的表达；蛋白质免疫印迹法检测核转录因子-κB (NF-κB)抑制蛋白IκB-α和NF-κB p65蛋白水平以及免疫细胞化学染色(NF-κB p65)观察NF-κB的活性变化.结果 与对照组比较,LPS组分泌的细胞因子显著增加并呈剂量依赖性；以10 mg/L的LPS刺激PMVECs,3种细胞因子于2、6和12 h均升高；ICAM-1、TNF-α于2h达分泌高峰,IL-8于12 h达分泌高峰；2 h TLR-4 mRNA表达明显增高达峰值,并持续12 h(分别为4.34±1.42、3.62+1.45和3.32±1.36),均高于对照组(1.00±0.00),差异有统计学意义(均P＜0.05)；LPS刺激0.5、2、6和12 h后,NF-κB的活性显著增加,表现为抑制蛋白IκB-α迅速降解,p65蛋白同步释出并转入细胞核内.结论 LPS刺激PMVECs释放细胞因子,其效应并呈剂量依赖性,可能是通过激活TLR-4-NF-κB信号通路诱导了PMVECs的炎性损伤.
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脂多糖直接诱导对肺微血管内皮细胞核因子κB的影响
脓毒综合征过程中肺是易受累的靶器官,主要表现是急性肺损伤(ALI),严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),它实际上是机体过度炎症反应导致肺微血管内皮和肺泡上皮广泛破坏所引起的综合征[1].核因子κB(NF-κB)是有关炎症病理过程中许多炎性介质表达调控的关键性转录因子,在启动、放大和延续炎症反应过程中起中枢性调节作用[2].我们依据细菌脂多糖(LPS)对血管内皮细胞的直接激活机制,以肺微血管内皮细胞(PMVECs)为对象,在有血清存在的前提下,从核调控因子NF-κB着手,观察LPS对PMVECs的直接激活作用,进一步探索这种直接途径在肺损伤中的作用方式及机制.
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TNF-α对大鼠肺微血管内皮细胞SSeCKS表达的影响及甲强龙的干预作用
目的 研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)表达的影响及甲基强的松龙(甲强龙)对TNF-α所致大鼠PMVEC单层通透性损伤和SSeCKS表达的干预作用,探讨SSeCKS是否具有调控PMVEC单层通透性的作用.方法 根据TNF-α刺激时间与浓度的差异,将培养的大鼠PMVEC随机分为TNF-α时间刺激组与浓度刺激组,前组以5000 U/ml的TNF-α分别与PMVEC作用0.5、1.5、3、6、12 h;后组分别以200、1000、5000 U/ml的TNF-α与PMVEC作用3 h.药物干预:分别以5000 U/ml的TNF-α和0.2 mg/ml的甲强龙+5000 U/ml的TNF-α与PMVEC作用1.5 h.以正常PMVEC SSeCKS的表达作为对照,运用RT-PCR法及Western-blot法检测SSeCKS mRNA及蛋白的表达变化.用针头式滤器检测TNF-α(5000 U/ml)组及甲强龙(0.2 mg/ml)+TNF-α(5000 U/ml)组作用1.5 h后大鼠PMVEC单层通透系数(Kf),以正常PMVEC单层通透性作对照.结果 正常情况下大鼠PMVEC呈低表达SSeCKSc,5000 U/ml的TNF-α作用PMVEC后,SSeCKS mRNA及蛋白的表达自0.5 h开始增高,3 h达到高峰,随后渐行性下降但维持较高表达水平至12 h,以上各时间点mRNA及蛋白的表达均明显高于正常对照组.200、1000、5000 U/ml的TNF-α作用PMVEC后,SSeCKS mRNA及蛋白的表达依次递增,均明显高于正常对照组.甲强龙+TNF-α组SSeCKS的蛋白表达明显低于TNF-α组.而甲强龙+TNF-α组PMVEC单层通透系数(Kf)也明显低于TNF-α组.结论 TNF-α以时间及浓度依赖的方式上调大鼠PMVEC中SSeCKS的mRNA及蛋白表达.甲强龙在抑制TNF-α所致大鼠PMVEC单层通透性增加的同时,降低SSeCKS蛋白高表达水平.提示SSeCKS参与TNF-α诱导大鼠PMVEC单层通透性损伤,可能具有调控PMVEC单层通透性的作用.
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豚鼠哮喘模型单个核细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究
目的:观察哮喘豚鼠模型嗜酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率,探讨肺微血管内皮细胞在哮喘模型发病中的功能变化及炎症细胞与其粘附的分子基础.方法:复制豚鼠哮喘模型;分离、培养和鉴定肺微血管内皮细胞;转染核因子(NF)-κB反义寡核苷酸;分别用对照组血清和模型组血清孵育;分离外周血淋巴细胞和嗜酸细胞;采用RT-PCR法测定内皮细胞和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及嗜酸细胞趋化因子(eotaxin)mRNA的表达强度,EMSA法测定内皮细胞NF-κB、活化蛋白(AP-1)的DNA结合活性.结果:(1)肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下,与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组嗜酸细胞的粘附率显著升高,内皮细胞与嗜酸细胞两者的激活,在嗜酸细胞粘附中起明显的协同作用;(2)肺微血管内皮细胞经模型组血清刺激后,VCAM-1和eotaxin mRNA表达量显著增多,NF-κB、AP-1的DNA结合活性也显著升高.结论:肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活,使粘附分子、趋化因子及核转录因子的合成和分泌增多,从而显著提高其与炎症细胞的粘附率,核转录因子NF-κB和AP-1对内皮细胞合成炎症因子可能起调控作用.淋巴细胞与嗜酸细胞的粘附机制不尽相同.
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人羊膜匀浆上清液对脂多糖致伤的大鼠肺微血管内皮细胞增殖及分泌炎症因子的影响
目的：：探讨人羊膜匀浆上清液(hAHS)对脂多糖(LPS)致伤的大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)增殖及其分泌促炎因子的影响。方法：用新鲜人羊膜制备 hAHS,用考马斯亮蓝法和 ELISA 法分别测定 hAHS中总蛋白和表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-4(IL-4)、IL-10、血管生成素-1(Ang-1)、人β-防御素2(HBD2)的含量。MTT 法检测不同体积分数 hAHS(0、10%、15%、20%、25%)作用于 RPMVECs后细胞增殖活性的变化,确定 hAHS 促进 RPMVECs 增殖的佳浓度。根据共培养条件不同,将 RPMVECs随机分为4组：N组(10%FBS+DMEM/F12),A组(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS),B组(10%FBS+DMEM/F12+LPS)和 C组(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS)。各组细胞在干预后0、12、24、48、72 h用 MTT法测定吸光度值(A值),并分别于培养6、8、10、12、24 h时用 ELISA法测定RPMVECs培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-8的含量。结果：hAHS中总蛋白浓度为(725.125±12.625)mg/L,其中 EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的浓度分别为(504.785±4.665)、(4.426±0.138)、(0.185±0.006)、(25.650±4.104)、(13.733±2.197)、(15.561±0.496)和(4.763±0.714)ng/L。hAHS 的体积分数在10%~20%时均具有促进 RPMVECs增殖的作用且以15%hAHS培养后第7、9天的增殖率佳,而25%hAHS在第7、9、11天使 RPMVECs增殖率小于0%hAHS组(P<0.05)。A组48和72 h细胞增殖活性较 N组显著增加,B组24、48和72 h的增殖活性较 N 组显著降低；C组24、48和72h的增殖活性较 B组显著升高(P<0.05)。ELISA结果显示,B组各时间点的IL-6和TNF-α的含量以及8、10、12和24 h的IL-8含量均显著高于N组(P<0.05)；C组10和12 h的IL-6含量,8、10、12和24 h的IL-8含量及各时间点的TNF-α含量均显著低于B组(P<0.05)。结论：hAHS含有促进组织修复、调节免疫反应、降低血管通透性及杀伤致病微生物的多种生长因子、细胞因子,对 LPS致伤的 RPMVECs增殖具有促进作用,并减少致伤后炎症因子分泌。
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热打击及中暑小鼠血清对小鼠肺微血管内皮细胞黏附单核细胞能力的影响
目的：研究热打击及10%中暑小鼠血清刺激肺微血管内皮细胞(PMVECs)对 PMVECs 表达血管内皮黏附分子(VCAM-1)和细胞间黏附分子(ICAM-1)水平及其黏附单核细胞能力的影响。方法：根据二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,光镜下观察细胞形态并对其血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-Cadherin)及Ⅷ因子进行染色鉴定。将PMVECs随机分为3组,分别进行37℃正常培养(对照组)、给予42℃2 h热打击或10%中暑小鼠血清刺激,24 h后分别提取总 RNA,荧光定量PCR及 Weston blot检测 VCAM-1及 ICAM-1mRNA和蛋白的表达水平,荧光显微镜观察其对人单核细胞(THP-1细胞)的黏附能力。结果：所分离 PMVECs 纯度较高,光镜下细胞呈特征性鹅卵石形状排列,VE-Cadherin及Ⅷ因子均可染色。与对照组相比,给予42℃2 h的热打击24 h后,VCAM-1及 ICAM-1的 mRNA 及蛋白水平表达降低(P<0.05),而给予10%中暑小鼠血清刺激24 h 后VCAM-1及ICAM-1的mRNA及蛋白水平表达增加(P<0.01)。与对照组相比,热打击组黏附THP-1细胞的细胞数无明显变化,中暑小鼠血清刺激组THP-1细胞数明显增多,显示PMVECs对单核细胞的黏附能力增强。结论：单独热打击并未使小鼠PMVECs黏附分子表达增加,而给予中暑小鼠血清刺激后其黏附分子表达显著上调,从而使单核细胞易于附壁,导致或加重了中暑相关的急性肺损伤。
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应用琼脂糖微球抗体筛选原代乳鼠肺微血管内皮细胞新方法的建立
目的 建立一种简便、高效的原代乳鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)培养新方法.方法 选取小于1周龄的C57BL/6乳鼠,采用琼脂糖微球抗体筛选法分离、培养原代PMVECs.倒置显微镜观察细胞形态,采用CD31、血管性血友病因子(vWF)相关抗原免疫荧光染色以及基质胶体外成血管实验鉴定内皮细胞,采用CCK-8法绘制细胞生长曲线.结果 倒置显微镜下观察培养的原代PMVECs呈短梭形、类圆形,单层融合呈铺路石样排列.CD31相关抗原、vWF免疫荧光染色阳性,阳性率分别为91.35％±3.06％、92.99％±2.67％,证实培养的细胞为PMVECs.PMVECs接种在基质胶上8h后,有血管腔结构形成.CCK-8法绘制的生长曲线显示,琼脂糖微球抗体筛选法提取PMVECs培养2～5d后细胞处于对数生长期.结论 琼脂糖微球抗体筛选法分离、培养乳鼠原代PMVECs简便、高效,是一种值得推广的分离培养乳鼠PMVECs的新方法.
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MAPKs家族在中暑小鼠肺微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制研究
目的 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活化对热打击致小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡的影响.方法 建立重症中暑小鼠模型,采用TUNEL染色及免疫组化检测肺组织损伤情况.二次磁珠分选法分离乳鼠PMVECs,TUNEL染色检测PMVECs凋亡情况,Western blotting检测热打击恢复期(0、2、6h)MAPKs家族活化情况.通过检测单层内皮细胞跨膜电阻(TEER)及辣根过氧化物酶(HRP)值观察不同热打击温度对单层细胞通透性的影响,同时使用MAPKs家族抑制剂检测热打击对单层细胞通透性及凋亡的影响.结果 在重症中暑小鼠恢复期肺组织中可观察到PMVECs发生凋亡.TUNEL染色发现随着恢复期时间的延长,PMVECs凋亡数目增多,热打击可使PMVECs MAPKs家族活化且微血管通透性增加,给予p38活化抑制剂SB203580及ERK活化抑制剂PD98059预处理后细胞通透性增加,凋亡数目增多,而给予JNK抑制剂SP600125预处理后细胞则出现相反的变化.结论 重症中暑小鼠PMVECs可发生凋亡,p38及ERK起着抗凋亡的作用,JNK起着促凋亡的作用.
关键词： 中暑 肺微血管内皮细胞 丝裂原活性蛋白激酶类 细胞凋亡 细胞通透性 -
大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进
目的:改进大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)原代培养方法,以获取纯化的大鼠肺微血管内皮细胞.方法:应用Wistar大鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养肺微血管内皮细胞;光镜观察细胞形态;Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学法及植物凝集素BSI结合实验鉴定培养的PMVECs.结果:体外培养的原代PMVECs在光镜下呈短梭形或多角形,形成单层后呈铺路石样排列,但随着传代或培养条件的改变,细胞形态发生变化;Ⅷ因子相关抗原染色阴性,异植物凝集素BSI结合实验阳性.结论:通过改进的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,纯度高,且能够稳定地传代培养.细胞形态观察结合免疫细胞化学法是目前较为理想的PMVECs鉴定方法.
