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细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定
目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础.
关键词: 细粒棘球绦虫 重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗 构建 鉴定 -
细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析
目的 在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性.方法 对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的 基因片段后连接到表达质粒载体pET30a, 构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α.筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法 和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性.结果 构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果 一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果 表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别.结论 成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性.
关键词: 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx) 基因表达 抗原性 -
细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定
目的 构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒.方法 从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.结果 电泳及测序证实1 016bp Eg95-EgA31融合基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌.结论 成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
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pIL-12质粒DNA对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响
目的 探讨pIL-12质粒DNA免疫对细粒棘球蚴感染小鼠免疫应答的影响.方法 将pIL-12质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c鼠,免疫后8w用Eg原头节进行攻击感染,感染后18w剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD+4和CD+8T淋巴细胞亚群的百分比;用EgAg或ConA刺激培养脾细胞,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平;流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照.结果 pIL-12质粒DNA免疫组的减蚴率为44.85%,脾CD+4和CD+8T细胞亚群显著增加,IL-2、IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组.结论 pIL-12质粒DNA可诱导细粒棘球蚴感染小鼠产生一个保护性的免疫反应.
关键词: 细粒棘球绦虫 pIL-12质粒DNA 免疫应答 -
高强度聚焦超声辐照小鼠体内棘球蚴的形态变化
目的 探索高强度聚焦超声波(high intensity focused ultrasound,HIFU)对动物体内细粒棘球绦虫棘球蚴的杀伤作用.方法 用采自感染包虫病羊肝内棘球蚴的原头节接种小鼠腹腔,建立小鼠棘球蚴病模型.用HIFU照射小鼠腹腔棘球蚴,以肉眼、光镜及电镜观察HIFU杀伤棘球蚴的破坏作用,对照组予以普通超声照射.结果 HIFU对棘球蚴有明显的破坏作用,随着HIFU照射时间延长,肉眼观察见棘球蚴囊塌陷变瘪.光镜观察见囊壁撕裂、生发层细胞脱落、细胞层变薄甚至消失,角皮层变薄,但层状结构未中断.扫描电镜显示生发层细胞脱落明显,角皮层板状结构疏松;透射电镜显示生发层细胞脱落、细胞间隙增宽,角皮层未见明显破坏;对照组棘球蚴囊壁结构完整.结论 高强度聚焦超声能破坏小鼠体内棘球蚴,使棘球蚴的生发层损伤,但角皮层仍然完整.
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高强度聚焦超声波对细粒棘球绦虫原头节酶活性的影响
目的 探索高强度聚焦超声波(HIFU)对体外分离的细粒棘球绦虫原头节的酶活性的影响作用.方法 用不致原头节即刻杀伤的高强度聚焦超声剂量照射原头节,行酶组织化学染色观察酸性磷酸酶(ACP)、葡萄糖6-磷酸酶(G-6-P)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性,了解高强度聚焦超声对体外培养的原头节3种代谢酶活性的影响作用.结果 细粒棘球绦虫原头节具有酸性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脱氢酶活性.不致原头节即刻杀伤的高强度聚焦超声波作用后,辐照组原头节葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脱氢酶活性较对照组明显减弱,而酸性磷酸酶反应产物与对照组相比无明显变化.阴性对照组无酶反应产物产生.结论 高强度聚焦超声波辐照对原头节酸性磷酸酶活性无影响,而对葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脱氢酶的活性有明显的抑制,这可能是影响原头节的代谢功能,终抑制其增殖的原因之一.
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细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定
目的 构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定.方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法 扩增Eg95编码基因并鉴定.将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒.用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定.结果 经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因.重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG.结论 成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础.
关键词: 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 -
细粒棘球绦虫Eg95基因疫苗和重组抗原诱导小鼠免疫应答的比较研究
目的观察比较细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗诱导小鼠的免疫应答状况.方法实验组和对照组小鼠分别注射Eg95重组抗原(rEg95)、费氏佐剂(FCA)、pcDNA3-Eg95基因疫苗、pcDNA3质粒和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测抗体IgG和IgG2a亚类水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应.结果 rEg95免疫组小鼠在第二次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1:25,600.Eg95基因疫苗免疫的小鼠产生抗体滴度随免疫次数的增加而升高,高可达1:3,200,但是低于Eg95重组蛋白免疫小鼠产生的抗体滴度水平.pcDNA3-Eg95免疫组产生IgG2a亚类抗体水平明显高于对照组和rEg95组.在第四次免疫后,进行淋巴细胞转化试验,MTT法检测证实rEg95和pcDNA3-Eg95免疫的小鼠,其脾细胞均可在体外被特异性刺激增生.结论细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗均可诱发小鼠产生特异性免疫应答.
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细粒棘球绦虫66kDa抗原基因在成虫吸盘上的表达
目的观察细粒棘球绦虫自原头蚴向成虫的生长发育过程中66 kDa抗原基因在虫体吸盘上和其它部位表达水平的变化.方法用重组抗原的抗血清对原头蚴及成虫等不同发育时期的虫体进行免疫组化分析.结果免疫组化分析显示细粒棘球绦虫66kDa抗原位于各期虫体的皮层和皮下肌层,在虫体的表面也发现该抗原的荧光颗粒;在经培养20h后的原头蚴和成虫的吸盘上该抗原的含量显著高于虫体的其它部位,但在棘球蚴内的原头蚴吸盘上该抗原含量与虫体其它部位一致,处于较低的表达水平.结论原头蚴在向成虫的生长发育过程中当顶突和吸盘翻出时66 kDa抗原在吸盘上开始大量产出,提示该蛋白质可能与吸盘的吸附功能有关;因此该抗原有可能是一有希望的成虫疫苗候选分子.
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粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅲ.双抗体夹心ELISA法检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的现场评价
本文报道用槟榔碱驱虫法对检测粪抗原诊断家犬细粒棘球绦虫感染的应用价值进行现场比较评价的结果.73只受试犬中有16只对槟榔碱无反应.在导泻成功的57只犬中粪抗原阳性者11只阳性率19.2%.其中驱虫阴性的38只犬中粪抗原阳性者仅2只(5.3%).在10只驱出细粒棘球绦虫的家犬中8只粪抗原阳性.5只驱出泡状带绦虫的犬中粪抗原阳性者1只,但反应强度低.粪抗原的反应强度与细粒棘球绦虫的感染强度呈正相关(r=0.94).证明本法可用于家犬细粒棘球绦虫感染的调查.
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粪抗原检测法诊断犬细粒棘球绦虫感染的研究Ⅱ.粪抗原检测的敏感性、特异性及实验感染犬排出粪抗原的动态观察
用细粒棘球绦虫成虫虫体抗原及其抗体建立的双抗体夹心ELISA滴定成虫抗原的结果A450值与抗原含量呈指数曲线关系,高度相关(r=0.98).实验感染家犬粪抗原含量在2.5-8.0μg/ml之间,因此本法在检测粪抗原中具有足够的敏感性.家犬泡状带绦虫的感染引起的交叉反应是影响本法特异性的主要问题.选择适的抗体包被浓度可消除交叉反应.用细粒棘球蚴原头节感染家犬后,粪抗原呈低滴度阳性,至21天后迅速升高.实验感染泡状带绦虫的家犬观察50天粪抗原均在临界水平之下.作者推荐本法可用于家犬细粒棘球绦虫成虫感染的诊断.
关键词: 细粒棘球绦虫 犬 槟榔碱 粪抗原 双抗体夹心ELISA -
皮下埋植吡喹酮缓释剂控制家犬细粒棘球绦虫感染的实验研究
家犬皮下埋植吡喹酮缓释剂的剂量与驱虫效果相关.用50mg/kg剂量在埋植后4个月以细粒棘粒蚴原头节进行攻击可保护家犬不受感染.3只家犬埋植剂量为36.36、44.44和66.66mg/kg吡喹酮,3个月药物释放率各为76.7%、65.8%和56.1%.血液吡喹酮浓度在埋植后10天至3个月维持在0.8974~3.6849μg/ml之间.50mg/kg吡喹酮剂量对植药犬的肝肾功能无明显影响.
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棘球蚴(包虫)病预防疫苗的研制与应用
棘球蚴(包虫)病的控制是一个长期的过程.20世纪90年代以前,寄生虫病的防治手段主要是药物防治,但近年来,由于寄生虫耐药风险的增加和不理想的控制效果,以及大面积药物的使用对环境的不良影响等,寄生虫病控制的研究方向逐渐向免疫预防转移.本文从棘球绦虫疫苗研制的策略,中间宿主和终末宿主抗虫疫苗的研制,以及所面临的挑战和机遇等做一综述.在我国,EG95已经大面积接种绵羊用于囊性包虫病的控制.但泡球蚴病病原的传播是循环于犬,狐狸和狼等终末宿主和鼠类之间,终末宿主抗虫疫苗研制是泡球蚴病控制研究的方向之一.
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模型在棘球蚴病流行预测中的应用
棘球蚴病是由寄生于人或者动物体内的棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患寄生虫病.已确认的对人体致病的棘球绦虫有4种,分别为细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和伏氏棘球绦虫.棘球蚴病在世界范围内都有分布,主要流行于牧区,严重影响人群生命健康,给牧业生产带来巨大的经济损失,是一个全球性的公共卫生问题[1],因此,有效的控制棘球蚴病的传播流行十分重要.在棘球蚴病的流行预测中,模型的建立旨在通过模型对实际情况进行模拟,描述棘球蚴病的传播流行规律,从而有效的预防、控制棘球蚴病.目前,在棘球蚴病的研究中,各种模型已广泛用于对宿主分布、感染率、流行趋势以及防治措施结果等的预测,本文就此予以综述.
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包虫病治疗的药物研究进展
自从1786、1863年Batsch和Leuckart分别发现细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫以来,一种在寄生虫学和人畜共患寄生虫病史上占有重要地位的疾病"包虫病"开始进入人们的视野,成为全球性的公共卫生问题[1-3].与此同时,针对包虫病的治疗也日趋深入.一般认为,治疗以手术为主,但药物化疗作为重要的辅助手段也已越来越受到重视.尤其近几年,中西药就该病的研究和开发进展迅速,无论实验室体内外动物试验抑或临床使用都显现出乐观的前景.据此,现将这方面的相关文献加以整理并做综述如下.
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细粒棘球绦虫AgB研究进展
囊型包虫病(Cystic echinococcosis,CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一.
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细粒棘球绦虫Eg95疫苗研究进展
囊型包虫病(Cystic echinococcosis,CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病,是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一.
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棘球蚴分子生物学研究现状
能感染人类的棘球属绦虫有4种,即细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫.目前在我国仅发现2种,即细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis).前者引起囊型棘球蚴病(cystic hydatid disease),亦即囊型包虫病(cystic echinococcosis),后者引起泡型棘球蚴病(alveolar hydatid disease),俗称泡型包虫病(alveolar echinococcosis).棘球属绦虫的终宿主为狗、猫、狐等食肉类动物,成虫寄生于小肠,人和其它中间宿主被终宿主粪便中的虫卵所感染.
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青海省班玛县泡型和囊型包虫病流行现状调查分析
包虫病是由细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的幼虫寄生而引起的人兽共患寄生虫病,主要流行于我国西北地区的新疆、青海、内蒙、宁夏、西藏、四川西部、甘肃等地.青海是青藏高原的主体省份,存在包虫病的高度流行[1],其中泡型包虫病是一种严重危害人体健康可致死的寄生虫病,为了解果洛州的班玛县两型包虫病的流行分布状况,于2004年8~9月进行了调查.
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免疫胶体金渗滤法快速诊断试剂盒对包虫病患者血清的检测
囊型包虫病又称囊型棘球蚴病,是人类感染细粒棘球绦虫的幼虫(细粒棘球蚴)所致的一种慢性寄生虫病,棘球蚴可以寄生在人体的任何部位.医学影像学是目前诊断本病的可靠方法.血清抗体的检测也有一定的诊断价值.我院从1999-2003年共有24例经彩超诊断和手术证实的囊型包虫病患者,现将采用新疆兆丰生物技术工程公司生产的免疫胶体金渗滤法--快速诊断试剂盒检测这些患者血清的结果见表1: