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细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95构建及其在根癌农杆菌LBA4404中表达效率的研究
目的:构建细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,分析其在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株中的表达效率.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒;电穿孔转化At(LBA4404),抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.用IPTG分别诱导rAt 0、1、3、5、7、9、11和13h.用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质.结果:471bp Eg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95成功转入At(LBA4404).用Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达产物分子质量(Mr)约为16.5 kD,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达效率为约占LBA4404菌体总蛋白的20%.结论:成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95,且能在At(LBA4404)中表达,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组质粒pBI-Eg95 根癌农杆菌 构建 表达效率 -
pIL-12质粒DNA对细粒棘球蚴感染小鼠脾细胞凋亡的影响
目的:探讨pIL-12质粒DNA免疫对细粒棘球蚴感染小鼠脾细胞凋亡的影响.方法:将pIL-12质粒DNA肌肉注射免疫BALB/C鼠,免疫后8周用Eg原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾并分离脾细胞,用ConA刺激培养脾细胞,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率,同时设有BCG和PBS对照.结果:plL-12质粒DNA免疫组的减蚴率为44.85%,脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组.结论:plL-12质粒DNA可抑制细粒棘球蚴感染小鼠的脾细胞凋亡.
关键词： 细粒棘球绦虫 plL-12质粒DNA 凋亡 -
细粒棘球绦虫重组pCD-Eg95质粒构建及鉴定
目的:构建并鉴定细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)重组pCD-Eg95质粒.方法:从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pCDNA3.1中构建pCD-Eg95重组质粒;电穿孔转化大肠杆菌BIA21(DE3)株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定.结果:电泳及测序证实471 bpEg95基因克隆成功.经酶切及PCR证实重组质粒pCD-Eg95成功转入BL21(DE3).结论:成功构建了Eg重组pCD-Eg95质粒.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组pCD-Eg95质粒 构建 鉴定 -
高强度聚焦超声波对棘球蚴的杀伤效果
目的 探索高强度聚焦超声波(high intensity focused ultrasound,HIFU)杀伤棘球蚴(Echinococcus cysts)的效果.方法 采集感染棘球蚴的新鲜羊肝,选取囊壁较薄、触摸弹性较好、直径<50 mm的棘球蚴囊25个,采用随机区组设计的方法 分为5组,每组5个.实验组分别用100、150、200、250 W声功率HIFU对棘球蚴囊进行沿着囊壁多层面的环形照射,覆盖棘球蚴囊囊壁,层面间距为5 mm,每个层而沿囊壁环形扫描1遍,环形扫描速度为3 mm/s,扫描1次,照射时间2～10 min;对照组用普通超声照射2 min.以原头蚴的死亡率作为效应指标,同时检测囊液中乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活性.结果 HIFU照射后棘球蚴的原头蚴急性死亡率显著升高(F=38.00,P<0.01),囊液内的乳酸脱氧酶活性显著升高(F=14.75,P<0.01),碱性磷酸酶活性显著升高(F=12.00,P<0.01).结论 HIFU沿棘球蚴囊壁多层面环形照射的方法 对棘球蚴有损伤的效果.
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原头蚴体外形成棘球蚴的优化培养体系研究
目的 建立适合细粒棘球绦虫原头蚴在体外形成棘球蚴的培养体系.方法 以RPMI1640或DMEM培养基为基质,胎牛血清或绵羊血清为营养成分,人肝细胞株L02为饲养细胞设计配伍2大类、6个组培养体系;培养细粒棘球绦虫原头蚴45 d,根据各组原头蚴的头节外翻率、成囊率和囊泡大小情况,寻找适合原头蚴形成棘球蚴的体外培养体系佳配伍;在佳配伍的培养体系继续培养棘球蚴囊泡至180 d.结果 在起初的45 d期间,DMEM体系的E组(DMEM+胎牛血清+人肝细胞株L02)培养的棘球蚴生长快,20 d起原头蚴成囊率高于其他各组(P＜0.05),25 d起棘球蚴囊泡大于其他各组(P＜0.05),45 d时原头蚴成囊率达到100％;在其后的46 ～ 180 d内,棘球蚴囊泡持续增大,至80 d时肉眼可见透明囊泡,至180 d时大囊泡直径达2.2 mm.结论 添加胎牛血清及人肝细胞株L02的DMEM培养基有利于体外培养的原头蚴发育为棘球蚴囊泡.
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原头蚴成囊过程中内参基因的确定及水通道候选基因的转录表达
目的 筛选合适的内参基因以检测细粒棘球绦虫水通道蛋白(aquaporins of Echinococcus granulosus,EgAQPs)基因在原头蚴发育为棘球蚴过程中的转录表达水平.方法 通过geNorm软件分析5个候选内参基因(ND1、ATP6、elp、actin和Act Ⅱ)在原头蚴成囊过程中的稳定性,并运用RT-qPCR方法检测体外培养原头蚴及原头蚴在小鼠体内囊化形成的继发棘球蚴中EgAQPs基因转录表达量.结果 actin和Act Ⅱ、ATP6和ND1分别为检测体外培养原头蚴和原头蚴囊化形成的继发棘球蚴囊壁生发层细胞EgAQPs基因转录表达状态的理想内参基因.EgAQP3和EgAQP9在体外培养第3天的原头蚴中转录表达量高,随着培养时间的增加,转录表达量呈持续下降的趋势,且不同培养时间转录表达量的差异有统计学意义(P＜ 0.05);EgAQP4在体外培养第25天的原头蚴中转录表达量高(P＜0.05),在体外培养第3、15、35天的原头蚴中转录表达量较低,这3个时间点的差异无统计学意义(P＞0.05).EgAQP3、EgAQP4和EgAQP9在原头蚴中转录表达量高(P＜0.05),随着感染时间的延长,EgAQP3、EgAQP4和EgAQP9的转录表达水平在接种原头蚴感染小鼠后第3～7个月的继发棘球蚴囊壁生发层细胞中转录表达水平很低,差异无统计学意义(P＞0.05).EgAQP、EgAQP1、EgAQPFA-CHIP和EgAQPAnG在原头蚴和继发棘球蚴囊壁生发层细胞中的转录表达水平均很低,基本上检测不到.结论 通过geNorm软件筛选了原头蚴发育为棘球蚴过程中稳定的内参基因;原头蚴囊化的继发棘球蚴囊壁生发层细胞中EgAQPs基因的转录表达水平很低,可能与棘球蚴液形成或积累有关.
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包虫病患者血清TNF-α、LI-β和NO水平检测
包虫病是由细粒棘球绦虫的中绦期幼虫棘球蚴感染所引起的一种人兽共患寄生虫病,主要流行于西北畜牧业地区,对人畜均有严重的危害性.包虫病患者的临床表现不但反映感染的时间和程度,而且反映了宿主与寄生虫之间的相互关系.细胞因子和一氧化氮(NO)都是免疫应答和重要介质,它们与宿主的免疫状态有关密切关系.为了阐明包虫病患者血清细胞因子和NO的变化,本文检测了其血清肿瘤坏死固子α(TNF-α)、白细胞介素1β(LI-β)和NO水平,现将结果报告如下.1 对象和方法1.1 对象10例包虫病患者为本院传染科住院或门诊患者,男7例,女3例,年龄20～60岁,均来自四川甘孜州包虫病流行区或在流行区有过生活史,均有临床症状,实验室检查发现包虫皮试阳性,血清抗体ELISA检测阳性,B超肝内有囊肿,X线胸片有密度均匀、边缘清晰的圆形阴影.另外有10例本院健康志愿者作为对照.
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1例肝包虫囊肿患者的护理体会
棘球虫蚴病,又称包虫病,是由棘球绦虫的幼虫寄生人体所致.我省属该病的高发区,本病是人畜共患疾病,不仅危害家畜,且对人体健康损害也很严重.寄生于人体的有细粒棘球绦虫之幼虫和泡状棘绦虫幼虫两种,引起细粒棘球虫蚴病和泡状棘球虫蚴病,我国多见前者.在传播途径中,人和其他动物如牛、羊、狐等为中间宿主,除因吞食被虫卵污染食物而感染外,主要是与病狗密切接触,狗皮毛中附有虫卵通过污染手指把虫卵带入口中.
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2011-2013年兵团家犬驱虫前后细粒棘球绦虫感染情况调查
目的 通过开展家犬驱虫前后细粒棘球绦虫感染情况调查,了解新疆生产建设兵团(以下简称兵团)家犬细粒棘球绦虫感染分布状况,评价家犬驱虫工作实施效果,为进一步做好家犬驱虫工作提供理论依据.方法 2011年起,兵团在各包虫病流行师采用吡喹酮片开展家犬驱虫工作,每月定期驱虫一次,要求家犬登记驱虫率达85％以上.在开展家犬驱虫工作前后,每年对家犬细粒棘球绦虫感染情况进行调查,使用珠海海泰生物制药有限公司生产的犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂盒对犬粪进行检测.结果 2011-2013年,兵团调查家犬分别为12517、10495和8481只,阳性犬分别为848、102和41只,平均感染率分别为6.77％、0.97％和0.48％.结论 兵团通过开展“犬犬投药,月月驱虫”工作,家犬细粒棘球绦虫感染率明显下降,但仍处于一定感染水平,需继续加强驱虫工作力度,降低包虫病危害,保障人民群众身体健康.
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分子生物学技术在细粒棘球绦虫虫株分类研究中的应用
以往主要利用形态解剖学、生物学及生物化学方法对细粒棘球绦虫虫株进行分类鉴定,近年来分子生物学技术迅速发展,广泛应用于寄生虫分类学研究.本文拟对核酸序列分析以及AFLP、RAPD、微卫星DNA等分子生物学技术在细粒棘球绦虫虫株分类、鉴定及遗传变异中的应用概况及研究进展作一综述.
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细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫占免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察
目的 动态观察细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化.方法 疫苗分别采用口服灌胃和鼻腔内接种免疫Balb/e鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和周各剖杀4只小鼠取脾,分离脾细胞,用EgAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液的IL-2、IFN-у、TNF-α和IL-4水平,同时设有PBS对照.结果 口服免疫组的IL-2、IFN-у、TNF-α和IL-4水平分别在免疫后4～10周、2～10周,2～18周和10周升高,分别在免疫后10、10、6和10周达高水平;鼻腔内接种组的IL-2、IFN-у、TNF-α和IL-4水平分别在免疫后2～18周、2～10周、2～18周和10周升高,分别在免疫后10、8、12和10周达高水平.结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗在免疫早期(2～10周)可诱导小鼠脾细胞产生Th1和Th2.混合型细胞因子.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 细胞因子 -
细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究
目的 探讨细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化.方法 将细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径分别免疫Balb/c鼠,免疫后8周用Eg原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有BCG和PBS对照.结果 疫苗接种组的脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,口服接种组和肌肉注射组的CD4+T细胞亚群和CD4+/CD8+亚群比值显著高于皮下注射组和鼻腔内接种组.结论 CD4+T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关,疫苗口服接种和肌肉注射是两种较好的免疫途径.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 脾细胞亚群 -
细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗的构建及其表达效率研究
目的 构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,分析Eg95分子在该疫苗中的表达效率.方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95的抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pB-CG,构建重组质粒pBCG-Eg95;电穿孔法转化BCG,构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗.免疫印迹分析重组BCG-Eg95疫苗的表达产物.结果 RT-PCR成功扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-Eg95疫苗构建成功;免疫印迹分析发现重组BCG-Eg95疫苗的表达产物在相对分子质量(Mr)约为16.5×103处有明显的目的 蛋白表达条带,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别.结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为而后的开发利用奠定了理论基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 构建 表达效率 -
细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导的保护力观察
目的 探讨细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫鼠后对Eg原头节攻击感染的保护性作用.方法 '将细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径分别免疫Balb/C鼠,免疫后8W用Eg 原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平,同时设有BCG和PBS对照.结果 疫苗接种组的减蚴率为18.20%～92.46%,血清IgG、IgG2a、IgG2b水平明显升高,IgG1、IgG3和IgE显著降低.结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗口服灌胃和肌肉注射是两种较好的接种途径,IgG、IgG2a和IgG2b在疫苗诱导的保护力中起重要作用.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 保护力 -
细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合蛋白诱导小鼠免疫应答
目的 研究细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bh)-Eg95-EgA31融合蛋白免疫小鼠后诱导的免疫应答.方法 56只SPF级雌性Balb/c小鼠随机均分7组,分别为重组Bh-Eg95-EgA31皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、口服灌胃纽(D组)、空载体对照组(E组)、Bb对照组(F组)和Bb培养用液体培养基(MRS)对照组(G组).免疫后8周各组鼠用50个Eg原头节攻击,攻击25周后,处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊衙抑制率;ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE和脾细胞上清液IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平;MTT法测定脾细胞增殖反应;流式细胞仪检测脾CD4~+和CD8~+T细胞百分比和脾细胞凋亡发生率.结果 重组Bb-Eg95-EgA31免疫组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平升高,IgG3和IgE降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水甲降低;脾T淋巴细胞明显增殖;脾CD4~+和CD8~+T细胞显著增加;脾细胞凋亡发生率显著降低.结论 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-E-gA31融合蛋白能诱导小鼠产生有效的保护性免疫应答.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组Bb-Eg95-EgA31 融合蛋白 免疫应答 -
肝包虫病452例诊治分析
目的提高肝包虫病的诊断和治疗水平.方法对452例肝包虫病的临床资料进行回顾性分析.结果术前确诊449例(99.3%),误诊3例(0.7%),包虫破裂33例(7.3%).包虫囊液皮试(Casoni试验)、B超、X线及放射性核素肝扫描有诊断价值.452例内囊均采用穿刺摘除,336例(74.3%)外囊腔缝合闭锁,79例(17.5%)外囊部分切除敞开,37例(8.2%)外囊腔闭式引流.治愈451例(99.8%),死亡1例(0.2%).结论诊断肝包虫病的定位方法首选B超,包虫囊液皮试有诊断价值.内囊穿刺摘除、外囊腔缝合闭锁及部分切除敞开,手术操作简单,疗效满意,并发症少.
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寄生虫感染与肝纤维化
多种寄生虫可侵犯宿主的肝脏,引起肝胆疾病,包括吸虫、原虫、线虫和绦虫.这些寄生虫在肝内移行和寄生造成的长期慢性炎症刺激,可引起肝细胞的坏死、再生,进而发生局灶性的纤维化.轻度的损伤康复后,其不成熟的胶原纤维可被酶降解消除.持续或严重的损伤则导致纤维化乃至肝硬化.常见的可致人或动物肝纤维化的寄生虫有:日本血吸虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫、肝毛细线虫、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫幼虫、溶组织内阿米巴等.
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细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠免疫应答的动态观察
目的:观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后其免疫应答的动态变化.方法:将疫苗分别采用口服灌胃和鼻腔内接种免疫BALB/c鼠,分别于免疫后2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周用ELISA法测定免疫小鼠血清中IgG及其亚类和lgE水平.用MTT法测定脾淋巴细胞的增殖,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平,用流式细胞术(FCM)检测脾CD4~+ 和CD8~+T细胞百分率.结果:口服免疫小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、2、6、6、8和10周达到峰值.脾淋巴细胞悬液中IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4、2、4和6周达到峰值.脾淋巴细胞增殖在免疫后6周达到峰值;脾CD4~+T细胞在免疫后6 周达到峰值,脾CD8~+T细胞无明显变化.鼻腔内接种免疫小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后10、6、10、8、8和10周达到峰值.脾淋巴细胞悬液中IL-12、TFN-γ、TNF-P和IL-10水平分别在免疫后2、2、4和8周达到峰值.脾淋巴细胞增殖在免疫后6周达到峰值;脾CD4~+T细胞在免疫后6周达到峰值,脾CD8~+T细胞无明显变化.口服免疫和鼻腔内接种是两种较好的免疫途径,且前者优于后者.结论:细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组Bb-Eg95-EgA31疫苗 免疫应答 -
细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状
囊型棘球蚴病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一.Eg95是一种有效的疫苗候选分子,其疫苗种类有重组抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组酵母、重组牛痘病毒疫苗、重组BCG疫苗、转基因苜蓿疫苗和重组双歧杆菌疫苗等.
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额敏县158例肝包虫手术患者调查
棘球蚴病俗称包虫病,是因棘球绦虫的幼虫寄生于人体组织而引起的人兽共患性寄生虫病,分布于全世界广大的畜牧地区,在人与动物之间传播.在我国多流行于西北和西南牧区.目前已确认的棘球绦虫有4种,即细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫及少节棘球绦虫.在我国主要为细粒棘球蚴病和泡型棘球蚴病.据调查,人肝包虫的感染率在3.1~31.5%,忠病率在0.5~5.0%[1]仅新疆每年因患包虫病接受手术者达2000人次以上.已成为农牧民因病致贫和因病反贫的主要原因.严重危害人类的健康.现将我县2004年至2009年158例肝包虫手术患者作如下分析:
