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刃天青还原法检测细粒棘球绦虫原头蚴总数
目的 建立刃天青还原法体外检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法.方法 根据刃天青在活细胞线粒体酶作用下被还原成强荧光物质的原理,将体外培养的原头蚴,用2 mg/mL刃天青染色10h后,用荧光分光光度计(激发光波长在560 nm,发射长590 nm)测定荧光值,并利用激光扫描共聚焦显微镜形态观察,通过统计学方法建立活原头蚴总数与对应的荧光值之间的数学模型,用于存活原头蚴总数的检测.结果 激光扫描共聚焦显微镜观察发现,死亡的原头蚴经刃天青染色没有荧光,活的原头蚴经刃天青染色发出红色荧光.活原头蚴总数与对应的荧光值呈线性关系,建立直线方程y=0.019x+6.453,在检验中将测得的荧光值(y)带入该公式即可获得活原头蚴总数,此数学模型相关系数r=0.994,P＜0.01,说明每个浓度下活原头蚴总数与每个浓度对应的荧光值之间的相关系数r极显著.结论 本研究建立了刃天青还原法体外快速检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法,该方法可应用于抗包虫病药物体外筛选,具有避免人为误差、降低人力消耗等优点.
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细粒棘球绦虫在人体内棘球蚴原头节、囊壁蛋白质表达谱分析
目的 初步掌握流行于青海省细粒棘球绦虫幼虫棘球蚴(原头节、囊壁)在中间宿主人体内蛋白质表达情况.方法 利用SDS-PAGE和western-blot分析棘球蚴原头节和囊壁蛋白质表达谱,进一步利用2DE和MALDI-TOF质谱分析技术对原头节和囊壁蛋白质构成情况进行全面的研究分析.结果 在原头蚴、囊壁组织的双向电泳图中,各蛋白点通过MAL-DI-TOF-MS检测,原头蚴和囊壁分别有40个蛋白质点和8个蛋白质点得以初步鉴定,包括有:(1)细胞骨架蛋白:肌动蛋白、原肌球蛋白.(2)代谢相关酶类:苹果酸脱氢酶;磷酸丙糖异构酶;脯氨酸氧化酶;谷胱甘肽-S-转移酶;类胡萝卜脱氢酶;肽基脯氨酰顺反异构酶;(3)物质转运相关蛋白:载脂蛋白A-I;(4)应激反应蛋白(HSP70,HSP20相关蛋白).结论 初步鉴定了寄生人体细粒棘球蚴原头蚴、囊壁组织中的部分蛋白质点,其中,原头蚴中共有40个蛋白点,囊壁中有8个蛋白点.这些蛋白可能与细粒棘球蚴运动、生长、发育、代谢调控等方面有关.
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细粒棘球绦虫p38蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
目的 制备细粒棘球绦虫(Eg)p38蛋白的多克隆抗体,为进一步研究Egp38蛋白的功能提供检测抗体.方法 将Egp38蛋白基因序列克隆至原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21株,IPTG诱导蛋白表达,以Ni亲和层析纯化Egp38蛋白,免疫家兔,收集免疫血清,ELISA 测定抗体效价,Western blotting检测所制备抗体与Eg虫体天然Egp38蛋白的反应性.结果 经0.2 mmol/L IPTG诱导,表达出约46 kDa的Egp38重组蛋白,制备获得效价在2.56×105以上的多克隆抗体,该抗体能够与Egp38重组蛋白和Eg蚴虫体内的Egp38蛋白发生特异性反应.结论 成功制备获得兔抗Egp38多克隆抗体,为研究Egp38在Eg与宿主间的交互作用中的功能和作为药物靶标等研究奠定基础.
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微泡造影剂对高强度聚焦超声杀伤离体棘球蚴的增强作用
目的 比较超声造影剂(ultrasound contrast agent,UCA)协同高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)与单纯HIFU辐照对离体细粒棘球蚴包囊的杀伤效果的不同,探索UCA增强HIFU杀伤棘球蚴的方法.方法 采集新鲜包囊按直径大小随机分为6个区组,每组25个,每5个包囊为1试验组随机接受以下试验:普通B超照射的空白对照,0.1 mL UCA处理,单纯HIFU辐照,0.1 mL UCA+HIFU辐照,0.2 mL UCA+HIFU辐照.HIFU辐照后观察分析包囊灰度变化,光镜观察原头蚴形态变化并计数其死亡率.结果 HIFU辐照功率一定时,加入UCA能增加HIFU辐照包囊灰度变化和原头蚴的死亡率,并且该效果随UCA剂量的增加而加强.结论 UCA能增强HIFU对离体细粒棘球蚴杀伤效率,提高对原头蚴的杀伤效果.
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细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建
目的 构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达.方法 从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性.通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coli BL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白.用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平.结果 测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒.SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带.结论 成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.
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EgM9免疫犬产生抗体变化规律的观察
目的 用重组表达蛋白EgM 9免疫实验犬,观察免疫犬的抗体变化及EgM9的免疫效果.方法 用100μg EgM9及5mg的GST并辅以佐剂QuilA分别免疫实验犬,定期收集血清,以间接ELISA法检测血清中IgG及其亚类、IgM、IgA与 IgE;感染45d后剖检实验犬,统计犬体内虫体数量.结果 免疫组和对照组血清IgG与IgA差异显著(P<0.05);而IgG1与IgG2免疫组和对照组差异极显著(P<0.01);IgM与IgE免疫组和对照组无显著差异(P >0.05);相对于对照组,免疫组的保护率达86%.结论 用重组蛋白EgM9免疫犬后能产生很高的抗体水平,可以抑制细粒棘球绦虫的发育,EgM9或许有望作为一种有效的候选疫苗成分用于包虫病的防治.
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细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后脾T淋巴细胞亚群的动态观察
目的 动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后诱导的脾T淋巴细胞亚群的变化.方法 热絮凝法提取转基因苜蓿疫苗叶蛋白,将其浓度配制成20μg/μL,132只BALB/c小鼠随机分为3组,用100μL(约含1μg融合抗原)灌胃接种和10μL(约含0.1μg融合抗原)滴鼻接种分别免疫小鼠,每3 d 1次,连续免疫2个月,同时设非转基因苜蓿叶蛋白滴鼻免疫对照组.在末次免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周各组随机剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,流式细胞仪(FCM)检测脾CD_4~+和CD_8~+T淋巴细胞亚群的百分比.结果 灌胃接种组小鼠脾CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群分别在免疫后6～10周和4～12周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰,百分比分别为0.294±0.002和0.168±0.027;滴鼻接种组小鼠脾CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群分别在免疫后4～6周和4～10周升高,分别在免疫后6周和8周达高峰,百分比分别为0.318±0.051和0.197±0.008.结论 CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群在细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导的保护性免疫机制中起重要作用.
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细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29基因的表达、纯化及免疫原性初步分析
目的 对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)诊断抗原P-29 (diagnostic antigen P-29)重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫原性.方法 从重组质粒EgP-29/pGEM-T中获取诊断抗原P-29基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白,经Western-blot、ELISA分析重组蛋白的免疫原性.结果 成功构建原核重组表达载体EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出浓度较高的重组蛋白.ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体IgG,Western-blotting鉴定该抗体能识别重组抗原及天然抗原原头蚴.结论 重组蛋白具有良好的免疫原性.
关键词： 细粒棘球绦虫 诊断抗原P-29基因 蛋白表达 纯化 免疫原性 -
免疫组化法检测EgM蛋白免疫犬的肠系膜淋巴结抗体靶位点的探索
目的 检测EgM蛋白免疫后的犬肠系膜淋巴结和感染细粒棘球绦虫后的犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG抗体.方法 用免疫组织化学方法检测仅EgM免疫犬肠系膜淋巴结、EgM蛋白免疫后感染原头蚴的犬肠系膜淋巴结、感染细粒棘球绦虫(原头蚴)的犬肠系膜淋巴结上的IgG.用细粒棘球绦虫虫体分泌表达的重组蛋白EgM制备的高免特异性抗体可引起免疫犬的特异性抗体反应.结果 在EgM免疫犬和感染原头蚴的犬的肠系膜淋巴结检测出IgG.结论 用EgM蛋白免疫犬后可以在其肠系膜淋巴结产生特异性抗体.
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青南高原细粒棘球绦虫mtDNA基因多态性分析
目的 与方法为了全面掌握青南高原细粒棘球绦虫的种内变异,我们首次应用mtDNA的coxI基因,nad I基因和atp6基因检测了55个细粒棘球绦虫分离株(37个人体分离株,18个动物分离株)的基因多态性.结果 研究结果显示,所检测的55个细粒棘球绦虫分离株与GenBank中检索到的普通羊株(G1型)基因同源性达到90%以上,均为普通羊株(G1型).将mtDNA相加(共1 327bp)后得到了13个基因型,均被GenBank收录.结论 1)55个细粒棘球绦虫分离株均为普通羊株(G1型);2)结果所得的13个基因型中,既有世界上广泛分布的,也有本研究首次报道的,充分说明青南地区细粒棘球绦虫具有广泛性和普遍性的流行病学特征,青南高原特殊地理环境和气候条件导致细粒棘球绦虫的特殊的核苷酸变异.
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细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建
目的 分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗.方法 分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列.先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95.再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95.电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌.结果 双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因EG95序列和AG85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫EG95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功.结论 构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗.
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细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定
目的 克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase TPx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达,纯化融合蛋白抗原,免疫小鼠制备抗血清.方法 从包囊中分离原头蚴, 抽提总RNA,采用RT-PCR的方法 扩增EgTPx基因,克隆到原核表达载体pET-41b中,转化大肠杆菌BL21,经过IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,通过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化获得重组蛋白并免疫小鼠,制备抗血清.Western blot鉴定抗血清的特异性,ELISA测定抗体的效价.结果 用PCR方法扩增获得的EgTPx基因长度为582 bp,经酶切鉴定和序列测定,插入到原核表达载体的基因片段为EgTPx基因,SDS-PAGE结果显示表达融合蛋白相对分子质量约为54 kDa,鼠抗EgTPx抗体能与融合蛋白和天然原头蚴抗原发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶256 000.结论 成功地制备了鼠抗EgTPx抗体,并能够特异识别原核表达的融合蛋白EgTPx和天然原头蚴抗原,为研制有效的包虫病疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶 融合蛋白 抗血清 -
高强度聚焦超声波辐照细粒棘球蚴包囊的热效应
目的 通过检测高强度聚焦超声波(HIFU)照射棘球蚴包囊后囊液、囊壁、包囊周围肝组织温度和原头蚴死亡率,了解HIFU处理后不同部位的升温效应,探索HIFU杀伤棘球蚴的方法和效果.方法 采集感染细粒棘球绦虫的新鲜羊肝,选取囊壁较薄,触摸弹性较好,直径介于10mm到45mm之间的包囊42个.采用随机区组设计的方法分组,对照组用普通超声照射,实验组用200W声功率HIFU直线扫描的方法照射,照射时间分别为2 min,4min,6min,8min,10min.照射后立即测定囊液、囊壁、距包囊5mm部位肝组织的温度.抽取囊液、涂片,经台盼兰染色后计数原头蚴的死亡率.结果 HIFU照射后,棘球蚴囊壁、囊液、包囊周围肝组织的温度均有升高,其中囊壁的温度升高为明显,且与囊液、包囊周围肝组织之间有显著差异;囊液中的原头蚴死亡率增加.结论 HIFU照射使棘球蚴包囊的囊壁产生明显的升温效应,HIFU照射对原头蚴有杀伤作用.
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抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体的制备及鉴定
目的建立能分泌与细粒棘球绦虫(简称包虫)成虫特异结合的抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株.方法用包虫成虫抗原免疫BALB/c小鼠后,获取免疫的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合.结果 ELISA方法筛选出1株能持续稳定分泌抗包虫成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1F5E3C9E9D5杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以与包虫成虫、棘球蚴结合,与囊液抗原呈边缘性阳性反应,而与泡球蚴EM2抗原呈阴性反应.冻存1个月后复苏,仍能稳定分泌.经免疫组织化学检测发现,该单克隆抗体与棘球蚴的生发层,棘球蚴原头节虫体呈阳性反应.结论 1F5E3C9E9D5是一株稳定的杂交瘤细胞株,所分泌的抗细粒棘球绦虫成虫单克隆抗体在粪抗原的检测方面有应用前景.
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吡喹酮长效缓释棒控制家犬细粒棘球绦虫感染的现场研究
目的为确定吡喹酮驱虫棒在包虫病现场控制家犬细粒棘球绦虫感染的效果.方法以吡喹酮1.6～2.5g/犬剂量,给家犬皮下埋植.植前测定犬粪抗原.植后测定实验组和对照组犬粪抗原并同时做槟榔碱导泻的方法进行预防效果评价.结果Ⅰ号药棒埋植后8个月,粪抗原阳性率从埋药前的19.5%下降至4.6%.槟榔碱导泻结果,实验组的成虫感染率比对照组低5倍以上,差异显著.Ⅱ号药棒埋植前犬群粪抗原阳性率为41.3%,埋植1年后实验组粪抗原阳性率为0.9%,对照组为36.4%.结论Ⅰ号药棒可以保护未感染犬不发生感染,但不能完全驱除已感染并寄生的成虫.Ⅱ号药棒实际上可以完全控制家犬细粒棘球绦虫的感染.这种药棒可以做为包虫病预防措施的主要手段,在流行地区推广使用.
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细粒棘球蚴DNA聚合酶链反应定量分析研究
细粒棘球蚴DNA基因的研究，旨在通过对核酸序列结构的规律，判定细粒棘球绦虫遗传变异，不同虫株对中间宿主在感染性和致病性等方面存在差异，同时也与包虫病的流行防治直接相关。细粒棘球蚴生物学的研究，主要以酶切图谱，核酸杂交和基因重组等实验技术，对DNA核酸序列的分析已取得了重组进展。本实验应用PCR技术与计算机GVA-P6基因量分析系统结合，对细粒棘球蚴DNA的部分核苷酸作观察。
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两种棘球绦虫的水通道蛋白基因克隆及功能特性的比较
目的 探索棘球绦虫水通道蛋白(aquaporin,AQP)在棘球蚴、泡球蚴囊液形成中的作用,为阐明棘球蚴、泡球蚴囊液的形成过程以及筛选棘球蚴病新的药物治疗靶点提供理论依据.方法 利用RT-PCR扩增棘球蚴、泡球蚴AQPs基因,构建AQPs体外转录载体,并在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中进行异源表达,以验证其水通道功能.利用生物信息学方法分析两种棘球绦虫水通道蛋白跨膜结构域特点及差异,并对棘球绦虫和人AQPs进行多序列比对,分析棘球绦虫AQPs序列结构与人AQPs的差异.结果 通过RT-PCR成功克隆了棘球蚴Eg AQP4和Eg AQP9、泡球蚴Em AQP4和Em AQP9四个基因,注射了这些基因cRNA的卵母细胞与注射DEPC水的对照组卵母细胞的体积变化率(V/V0)差别无统计学意义(F=1.143,P＞0.05),透水系数差别亦无统计学意义(F=1.416,P＞0.05),这四个AQPs基因在非洲爪蟾卵母细胞中未表现出水通道的功能.跨膜结构域预测及多序列比对结果表明,与经典的水通道蛋白相比,Eg AQP4和Em AQP4虽然N和C末端均位于胞质侧,但跨膜结构域数目为4个,NPA基序替换为NPM和NPT;而Eg AQP9和Em AQP9虽然具有2个保守的NPA基序,但跨膜结构域数目为5个,N末端位于胞外侧、C末端位于胞质侧.棘球绦虫AQPs蛋白结构存在的这些差异,可能与其在卵母细胞中未表现水通道蛋白的功能有关.结论 两种棘球绦虫基因组中都存在编码AQPs的基因,但这些AQPs基因的功能验证试验未见到水通道功能.该结果可能正好说明了囊液的水分子既不能通过AQPs进入生发层细胞而致使细胞肿胀坏死,也不能以AQPs为通道从生发层细胞转移出囊壁,致使囊液累积、棘球蚴包囊或泡球蚴囊泡体积长大.
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细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测
目的 以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性.方法 运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树和二级结构、三级结构等方面进行分析后,将EgGAPDH基因亚克隆于表达载体pET30a(+),转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,表达、纯化重组蛋白,并利用底物3-磷酸甘油醛测定重组蛋白EgGAPDH的酶催化活性.结果 EgGAPDH cDNA序列长度为1 011 bp,编码一个336个氨基酸的蛋白.该GAPDH蛋白理论相对分子质量为36 128.3 Da,等电点为8.44,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域,富含6种类型的特定功能位点.成功构建的原核表达载体pET30a(+)-EgGAPDH在E.coli BL21(DE3)中高效表达,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清,制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活检测显示其具有高效酶活性.结论 EgGAPDH基因可在原核系统中获得有酶催化活性的高效表达,为进一步研究其在糖代谢中的功能奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 甘油醛3-磷酸脱氢酶 生物信息学 原核表达 酶活性检测 -
细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞亚群的变化.方法 将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群的百分比,同时设有空载体、Bb和MRS对照.结果 以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群显著增加,鼻腔内接种和口服免疫组的的CD_4~+T细胞亚群和CD_4~+/CD_8~+比值显著高于皮下和肌肉注射组.结论 CD_4~+和CD_8~+T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用.疫苗鼻腔内接种和口服免疫是两种较好的免疫途径.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组Bb-Eg95-EgA31疫苗 脾细胞亚群 -
细粒棘球绦虫基因型的微卫星分析
目的 利用细粒棘球绦虫微卫星序列为分型标记,建立高效、快速、简便的鉴定细粒棘球绦虫基因型技术.方法 采用FAM和HEX两种不同荧光染料分别标记细粒棘球绦虫的Sca、Emsk、C106 微卫星序列引物,利用荧光PCR-基因扫描技术鉴定新疆不同地区CE病人细粒棘球绦虫分离株的基因型.结果 44例CE病人的66个分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定均为细粒棘球绦虫,其中43例病人的65个细粒棘球绦虫分离株标本为G1基因型;1例病人的1个细粒棘球绦虫分离株标本为G6基因型.结论 微卫星标记能够从基因水平快速、精确地鉴定新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型,对细粒棘球绦虫的流行病学和致病性研究有重要价值.
