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  • 胡椒碱抑制C57BL/6小鼠胆囊结石的形成

    作者:王海梅;安国顺;李月廷;吴京涛;巴图乌拉;刘绍辉;王海;倪菊华

    1 材料与方法1.1 动物模型C57BL/6小鼠30只,雄性,10周龄,由北京大学医学部实验动物中心提供.分笼饲养,控制光照12h(06:00AM~18:00PM),普通饲料饲养2w后,随机分为3组(每组各10只).对照组:每日喂普通颗粒饲料,同时给予等量空白液灌胃;结石组:每日喂饲15%脂肪、1%胆固醇、0.5%胆酸饲料,同时给予等量空白液灌胃;胡椒碱组:每日喂饲15%脂肪、1%胆固醇、0.5%胆酸饲料,同时给予胡椒碱30mg/kg灌胃.

  • 淡色库蚊氨肽酶N基因在不同龄期幼虫的表达谱分析

    作者:郭秀霞;杨培培;程鹏;王海防;刘丽娟;张崇星;王怀位;公茂庆

    目的 对淡色库蚊不同龄期幼虫中肠氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)的表达水平进行分析.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆淡色库蚊APN基因的全长cDNA序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在不同龄期幼虫中肠的表达情况.结果 克隆获得淡色库蚊APN基因,该基因全长1 383 bp,编码460个氨基酸,与GenBank收录的致倦库蚊(XM001862270.1)序列的同源性为100%.qRT-PCR表明CpAPN基因在各个龄期均有表达,其中在4龄期的表达量高,3龄期低,1、2和4龄期的表达量差异无统计学意义(F=2.465,P=0.250),与3龄期幼虫的差异有统计学意义(F=49.191,P=O.000),分别为其表达量的3.5、3.7和4.0倍.结论 CpAPN基因在淡色库蚊不同龄期幼虫中的表达水平存在差异,为进一步探讨淡色库蚊APN的功能奠定了基础.

  • 胡椒碱抑制兔胆结石形成的作用和机制

    作者:李月廷;祝学光

    目的观察胡椒碱对新西兰兔胆囊结石形成的预防作用和机制.方法(1)动物模型:新西兰兔30只,随机分成:对照组(10只),喂普通饮食;结石组(10只),喂含1.2 g/d胆固醇的成石饮食4周,胡椒碱组(10只),同时喂饲含1.2 g/d胆固醇和0.045 g/d的胡椒碱饮食4周.(2)氨肽酶N(APN)表达:利用RT-PCR方法,检测肝APN mRNA水平的变化.(3)APN活性:用化学法检测.结果结石组6只(6/10)出现胆囊结石,9只(9/10)出现胆固醇结晶,胡椒碱组和对照组无结石及结晶出现;结石组APN mRNA IOD比值(对照组0.65±0.18,结石组1.08±0.35,胡椒碱组0.87±0.44),APN活性(对照组6.1±2.53 U/L、结石组23.64±10.36 U/L,胡椒碱组8.31±6.47 U/L)明显高于对照组和胡椒碱组.结论以上结果表明胡椒碱主要通过降低肝APN的表达及胆汁APN酶的活性,抑制APN的促成石作用而预防胆固醇结石的形成.

  • 特异启动子调控的MDR1和MnSOD基因对骨髓的选择性保护作用

    作者:梁利波;马业伟;周小山;杨军;李艳春;王争;周兰萍;章扬培;赵清正

    目的探讨特异保护骨髓细胞免受抗癌药物及射线损害的新途径.方法构建了由APN骨髓特异性启动子调控的耐药、耐辐射基因的逆转录病毒载体,导入骨髓母细胞及癌细胞中,用细胞存活实验对耐药耐辐射性能进行观察.分离小鼠骨髓细胞,经转染基因后,再输回到预先用射线处理以破坏骨髓系统的同种受体小鼠体内.经化疗药物或射线处理后,不同时间采血,计算白细胞数,观察在药物或射线照射后导入耐药或耐辐射基因对造血细胞的保护作用.结果导入MDR1基因的KG1a细胞对秋水仙素、足叶乙甙、长春新碱、阿霉素及紫杉醇与对照组相比,各提高了10.6, 10.4,11.2,4.2和14.2倍.导入由APN启动子驱动的MnSOD基因,使KG1a细胞比对照组对射线( 10 Gy)的耐受性提高3.7倍.相反,导入以上两个基因后,肝癌细胞BEL 7402的化、放疗耐受性未见明显变化.体内实验表明,转染了MDR1和MnSOD基因的小鼠血液中,白细胞数量明显高于对照组( P< 0.01).结论体外由APN骨髓启动子调控的MDR1和MnSOD基因能特异性地保护骨髓细胞,而对肿瘤细胞无明显影响.体内,在用药物或射线处理动物时能重建造血功能.此研究为肿瘤患者在接受化、放疗时特异性保护骨髓系统,提供了新的思路和依据.

  • 测定尿蛋白肌酐比、氨肽酶N监测肾损伤的临床意义

    作者:林华;胡盈莹;胡望平;叶桂云;张忠源;游学华

    目的 探讨尿总蛋白、亮氨酸氨肽酶,(LAP,氨肽酶N)测定在糖尿病早期肾损伤的临床应用价值.方法 尿总蛋白用总蛋白肌酐比(TPCR)表示,以200mg/gC为诊断界线.对61例正常组和113例糖尿病患者组(及另外81例糖尿病患者)的尿液进行TPCR、LAP测定.结果 ①比较正常组与糖尿病组.②以早期肾损伤界线( 200mg/gC)组比较二组:糖尿病组113例TPCR≤200mg/gcr与≥200mg/gcr两组,③81例TPCR的两组.TPCR差异非常显著(P <0.001)、LAP差异非常显著、显著,(P<0.001,P<0.05).计算糖尿病TPCR≥200mg/gC 即早期肾损伤组与治疗控制良好组比:TPCR20.5 ~28.9、LAP1.8 ~ 2.06.结论 尿液TPCR是糖尿病早期肾损伤重要的诊断指标.LAP可作为早期肾损伤一项辅助指标,LAP高于总蛋白,差异非常显著、显著(P <0.05,P <0.001).

  • 绿原酸诱导肺癌细胞凋亡及其机制研究

    作者:田伟;豆亚伟;王宏涛;朱建飞;戴云罗;向晖

    目的 研究绿原酸对人肺癌A549细胞凋亡的作用及其机制,为临床应用提供依据.方法 四氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的绿原酸对A549细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;采用间接荧光标记法测定细胞内活性氧水平的变化;分光光度法检测绿原酸对表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,EGFR-TPK)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和氨肽酶N(aminopeptidase,APN)活性的变化.结果 MTT法检测显示,绿原酸在24h、48 h和72 h时均可抑制A549细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性关系趋势;绿原酸作用48 h后,细胞凋亡率呈现明显增高的趋势,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);在100.μg/ml质量浓度的绿原酸作用下使细胞内活性氧(ROS)百分率达到了(42.32±3.3)%,与对照组相比比较差异有显著性(P<0.01);绿原酸对APN、EGFR-TPK和MMP-2半数抑制浓度(IC50)分别为(8.12±0.78)、(29.43±2.76)和(1.54±0.13)μg/ml,显示出了较好的抑制效果.结论 绿原酸可以抑制A549的增殖和转移,促进细胞凋亡,其凋亡机制可能与细胞内活性氧组分的增多及APN、EGFR-TPK和MMP-2活性降低有关.

  • 荜拔油不皂化物抑制C57BL/6小鼠胆囊结石的形成

    作者:安国顺;王海梅;巴图乌拉;吴京涛;刘绍辉;倪菊华;李月廷

    目的:观察荜拔油不皂化物对实验性C57BL/6小鼠胆囊结石形成的抑制作用.方法:C57BL/6鼠30只,每组10只,模型周期4周,对照组喂饲普通饮食;模型组喂含1%的胆固醇饮食;用药组喂含1%的胆固醇饮食和荜拔油不皂化物(30mg/kg体重)灌胃.结果:模型组9只出现胆囊结石,10只出现胆固醇结晶;荜拔油不皂化物组1只出现胆囊结石和结晶;对照组无结石和结晶形成.与模型组相比,荜拔油不皂化物组和对照组的肝氨肽酶N(APN)mRNA及胆囊胆汁胆固醇饱和指数(CSI)明显降低.结论:荜拔油不皂化物明显抑制高胆固醇饮食诱发的小鼠胆囊结石的形成,可能通过降低肝脏APN mRNA水平及胆囊胆汁胆固醇饱和指数发挥作用.

  • 芹菜素对肺癌细胞氨肽酶N抑制作用机制的研究

    作者:周云峰;罗飞;付欢欢;肖江卫;廖娟

    目的:探讨芹菜素对肺癌细胞氨肽酶N活性的影响及其对肺癌细胞A549生长抑制作用的机制。方法采用酶抑制动力学方法,观察芹菜素对氨肽酶N的抑制作用和延滞时间;进行肺癌细胞A549和肺正常细胞MRC-5生长的抑制试验;通过锌离子螯合实验和分子对接研究芹菜素与氨肽酶N的相互作用机制。结果芹菜素能够对肺癌细胞A549的生长产生抑制作用,对正常细胞MRC-5具有较低的毒性,且是一种可逆的竞争型氨肽酶N抑制剂[半数抑制浓度(IC50)为(71.22±2.43)μmol/L];锌离子螯合实验和分子模拟结果表明,芹菜素能够优先结合到氨肽酶N的活性中心锌离子附近,并与催化基团His383和Glu350形成氢键。结论芹菜素是一种竞争性的氨肽酶N抑制剂,能够特异性地对肺癌细胞A549的生长起到抑制作用。

  • 木犀草素对脑胶质瘤细胞氨肽酶N活性影响

    作者:高春艳;聂珍贵;王俊亚;刘杨

    目的 探讨木犀草素对脑胶质瘤细胞氨肽酶N活性影响机制.方法 本研究采用酶抑制动力学方法,研究了木犀草素对氨肽酶N的抑制作用、抑制类型和抑制动力学常数,并进行了脑胶质瘤U87细胞的凋亡生长抑制试验.结果 木犀草素能够诱导了脑胶质瘤U87细胞的凋亡,并呈现一定的剂量依赖性,当浓度≥10 μmol时,与阳性对照bestafin相比差异有统计意义(P<0.05),求得半细胞凋亡率IC50为(61.23±2.13) μmol;此外木犀草素是一种可逆的竞争型氨肽酶N抑制剂,半抑制率IC50为(70.85±2.05) μmol,抑制常数Ki为(24.83±0.14) μmol;失活动力学时间进程分析表明,木犀草素能快速与氨肽酶N发生作用并迅速降低酶的活性.结论 木犀草素是一个竞争性的氨肽酶N抑制剂,使氨肽酶N的活性降低,对诱导了脑胶质瘤U87细胞的凋亡起到重要作用.

  • 小分子拟肽类氨肽酶N抑制剂的合成及初步活性

    作者:涂国刚;李少华;黄惠明;李刚;熊芳;朱华伟;徐文方

    目的 设计合成小分子拟肽类衍生物并测定其抑制氨肽酶N(APN)的活性,研究它与酶的相互作用关系.方法 通过模拟APN水解底物的过渡态.以D-丙氨酸为原料,经缩合反应合成小分子拟肽类衍生物;采用体外抑酶试验测定目标化合物抑制APN的活性.结果 合成了12个未见文献报道的小分子拟肽类APN抑制剂.结构经红外光谱、核磁共振氢谱及质谱确证.结论 目标化合物对APN有中等程度的抑制活性,可作为先导化合物开展进一步研究.

  • Bestatin衍生物的立体选择性合成及活性研究

    作者:牟佳佳;张涛;徐文方

    目的 立体选择性地合成Bestatin衍生物.方法 利用普通的硅胶加压柱联合L-氨基酸甲酯盐酸盐作为手性衍生化试剂将具有同一结构式的4个外消旋混合物进行了分离.结果 成功地合成并分离了Bestatin衍生物12个,体外抑酶活性表明12a、13a、15a等化合物有较高的抑制氨肽酶N(APN)的活性.结论 该实验的方法能立体选择性地合成Bestatin的衍生物,但化合物的绝对构型还有待确定.

  • 抗癌作用新靶点及其抑制剂的研究进展

    作者:李乾斌;徐文方;张震

    针对靶点分子或某种发生发展机制来设计抗肿瘤药物的研究工作已取得了相当大的成就.这类药物的特异性强,疗效显著,因此,针对这些新靶点进行药物设计可以使抗肿瘤药物的研究产生一次新的革命.本综述旨在讨论目前抗肿瘤药物研究的潜在的新靶点以及它们相应的抑制剂或拮抗剂.

  • 氨肽酶N在结直肠癌中的表达及其临床意义

    作者:陈亚;崔淑香;孟庆大;张俊峰;潘荣辉

    目的:检测结直肠癌中氨肽酶N(APN)的表达,并通过分析其与血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的关系,探讨APN在结直肠癌发生、发展过程中的作用及其临床意义.方法:应用免疫组织化学技术,检测40例结直肠癌组织及40例癌旁正常直肠组织中APN、VEGF和bFGF的表达,并结合临床病例特征进行分析.结果:40例结肠癌组织中APN的阳性率达52.5%(21/40),15例转移淋巴组织中达66.67%(10/15),在结直肠癌组织和转移淋巴结组织中的阳性表达率均明显高于癌旁正常直肠组织,差异有统计学意义(P<0.05).APN、VEGF与bFGF在结直肠癌中的阳性表达均与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度无关(P>0.05),而与肿瘤的分期和有无转移显著相关(P<0.05).结直肠癌组织中APN与VEGF、bFGF的表达间均呈显著正相关性(P<0.05).结论:APN在结直肠癌组织中呈高表达,与VEGF、bFGF可能具有协同作用,共同参与调节结直肠癌的发展,对于评估结直肠癌的生物学行为和预测患者的预后可能具有重要价值.

  • 槐定碱对神经胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及相关信号通路的影响

    作者:赵树鹏;靳彩玲;高国军;赵新利;金保哲;周文科

    目的:探讨槐定碱对神经胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的抑制作用以及U87细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ(DNA TOP Ⅰ)、EGFR-酪氨酸激酶(EGFR-TK)、基质金属蛋白酶2(MMP2)和氨肽酶N(APN)活性的影响.方法:将不同浓度槐定碱加入到神经胶质瘤U87细胞株中,利用MTT法测定槐定碱对U87细胞和人脑正常星型胶质HEB细胞生长的抑制作用,酶标仪法检测槐定碱对细胞凋亡蛋白caspase-3活性,采用Transwell小室法分析U87细胞的侵袭能力;采用非放射性NF-κB EMSA试剂盒测定U87细胞中NF-κB表达.结果:随着槐定碱浓度的增加(5、10、25、50、100μmol/L),神经胶质瘤U87细胞生长抑制率不断的增加,但HEB细胞的生长并未受到明显的抑制[(11.23±1.18)% vs (2.43 ±0.29)%、(22.48±3.21)% vs (3.65±0.42)%、(43.21 ±4.09)% vs (4.03±0.55)%、(57.31±5.09)%vs (5.21 ±0.43)%、(77.98±6.98)% vs (7.22±0.78)%,均P<O.05];与空白组比较,槐定碱存在下的U87细胞侵袭能力明显降低[(87.43±7.33)%、(65.12±6.16)%、(50.63±4.56)%、(35.32±4.04)%、(23.46±2.32)% vs(120.32 ±9.32),均P<0.05].槐定碱对DNA TOP Ⅰ、EGFR-TK、APN和MMP-2的半抑制率IC50分别为(22.43 ±2.21)、(31.25 ±3.09)、(6.32±0.32)和(8.23±0.63) μmol/L,但U87细胞中凋亡蛋白caspase-3活性呈增强趋势;槐定碱能够下调NF-κB信号的表达.结论:低毒性的槐定碱可能通过降低DNA TOP Ⅰ、EGFR-TK、APN和MMP-2活性,并下凋NF-κB信号通路和激活凋亡caspase-3酶联反应的方式,对神经胶质瘤U87细胞的侵袭、增殖和信号通路产生抑制作用.

  • 计算机辅助氨肽酶N抑制剂的设计、合成及初步活性考察

    作者:牟佳佳;徐文方;王强;何永志;邓雁如

    以L-精氨酸为结构母体,设计了63个衍生物,用Sybyl/FlexX软件将衍生物与氨肽酶N(APN)的活性中心对接,得出预测评分值.然后合成了16个分值较高、合成可行性好且未见文献报道的L-精氨酸衍生物,并经1H NMR和MS确证结构.体外抑酶试验和抗肿瘤细胞增殖试验结果显示,化合物A22活性与阳性对照bestatin相当,与APN的对接试验显示两者对接良好.因此,化合物A22可作为先导化合物开发新型L-精氨酸衍生物类APN抑制剂.

  • Bestatin下调卵巢癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制作用

    作者:陆恬;葛彦;居颂文;蒋林华;张弛;孙雪薇;居颂光

    目的 探讨氨肽酶N抑制剂Bestatin对肿瘤患者外周血CD4+CD25+Treg的生物学效应及机理.方法 将Bestatin 加入PHA刺激新鲜分离的卵巢癌患者外周血Treg细胞的体外培养体系,采用流式细胞术分析Foxp3和CTLA-4的表达.进而分析Bestatin对Treg细胞抑制CD4+CD25T细胞活化增殖的影响.结果 Bestatin可抑制Treg细胞表达Foxp3和CTLA-4,并促进Treg细胞和CD4+CD25T细胞的体外共培养体系中T细胞的增殖.结论 抑制氨肽酶N可下调Treg细胞的免疫抑制作用,对肿瘤治疗具有潜在应用价值.

    关键词: 氨肽酶N CD13 bestatin Treg
  • 人氨肽酶N基因克隆和原核表达

    作者:涂向东;谢飞;吴玉水;兰风华;朱忠勇

    目的:构建人氨肽酶N(APN)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(APN-GST),并进行原核表达. 方法:根据人APN mRNA序列设计合成特异性引物,从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增人APN基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T,转化宿主菌BL21(DE3)细胞,异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白.包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化. 结果:重组质粒测序和酶切结果显示:APN基因已正确插入pGEX-4T,重组蛋白及纯化产物SDS-PAGE在135000处有一条明显的蛋白表达条带. 结论:人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化.

  • 血清亮氨酸氨肽酶在肝胆疾病与肿瘤诊断中意义

    作者:胡望平;胡盈莹;黄艳芳;周长邵;孙艳;林金兰

    目的探讨血清亮氨酸氨肽酶(LAP)在肝胆疾病与肿瘤诊断中的应用价值.方法对822例临床标本采用亮氨酸对硝基酚胺法测定LAP活力.结果肝胆系统疾病患者血清LAP活力为64.3±39.2u/L,与胃肠系统、血液、脑部和泌尿系统疾病均存在显著性差异.肿瘤患者LAP活力与其它疾病LAP活力存在着显著性差异(P<0.001);肝胆胰肿瘤组为66.1±35.66u/L,明显高于胃肠血液肿瘤组35.55±24.33u/L,P<0.02有显著性差异.结论血清亮氨酸氨肽酶与胆汁郁积的病理有关.血清亮氨酸氨肽酶活力可作为诊断肝胆系统疾病、肿瘤的一个新的辅助指标.

  • 淡色库蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息学分析

    作者:郭秀霞;程鹏;杨培培;王海防;刘丽娟;张崇星;王怀位;公茂庆

    目的 克隆淡色库蚊Bt毒素受体氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)基因,并对基因及编码蛋白进行生物信息学分析.方法 提取淡色库蚊RNA,通过RT-PCR扩增氨肽酶N基因的全长cDNA序列,纯化PCR产物连接至pMD19-T载体,阳性重组质粒经PCR鉴定后进行基因测序.生物信息学分析APN基因的序列同源性及编码蛋白的结构特征.结果 该基因cDNA序列全长为1 383 bp(含终止密码子),编码460个氨基酸,与致倦库蚊XM_001862270.1序列的同源性为100%.预测蛋白质分子量为52.9 kDa,等电点为4.98.前21个氨基酸为N-末端的信号肽,存在2个N-糖基化位点(93 NLT95和169 NVS171).具有肽酶家族M1的序列特征、锌结合位点HEXXH和谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN.结论 成功克隆了淡色库蚊氨肽酶N基因并对APN蛋白进行生物信息学分析,为进一步探讨淡色库蚊APN的功能及Bt毒素作用机制奠定了基础.

  • 荷叶提取物黄酮对兔胆囊结石形成的影响

    作者:叶德强;丁佑铭;周明全;胡中立;沈阳

    目的探讨黄酮对新西兰兔胆囊胆固醇结石形成的影响及其机制.方法(1)动物模型:45只雄性新西兰兔随机分成对照组(15只)、结石组(15只)和黄酮组(15只),对照组喂普通颗粒饲料,结石组喂含1.2%高胆固醇饲料,黄酮组则饲喂含1.2%胆固醇和0.4%黄酮的饲料,饲养时间各为4周.(2)氨肽酶N(APN)表达:利用RT-PCR方法,检测肝脏APN mRNA水平的变化.(3)血脂检测:放射免疫法检测血清总胆固醇(TG)、甘油三脂(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A(ApoA)和载脂蛋白B(ApoB).(4)血清亮氨酸氨肽酶(LAP)检测:放射免疫法检测.结果结石组中10只(10/15)出现胆囊结石,12只(12/15)出现胆固醇结晶,黄酮组1只(1/15)和对照组2只(2/15)出现胆囊结石;结石组APN mRNAIOD比值(1.16±0.12)明显高于对照组(0.72±0.24)和黄酮组(0.86±0.38)(P<0.05);结石组血清TG、TC、LDL-C、ApoB较对照组和黄酮组明显升高(P<0.01),结石组血清HDL-C较对照组和黄酮组降低,但无显著性差异(P>0.05),结石组血清ApoA较对照组和黄酮组明显降低(P<0.01);LAP结石组明显较对照组和黄酮组升高(P<0.01).黄酮组各项指标较对照组均无明显差异(P>0.05).结论荷叶黄酮可降低肝脏APN的表达和血清LAP,改变血脂水平,从而有助于预防胆囊胆固醇结石的形成.

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