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循环应用低剂量环磷酰胺联合过继免疫治疗的抗黑色素瘤作用
目的:观察循环应用低剂量环磷酰胺(CTX)对荷瘤鼠调节性T细胞(Tregs)的影响,及联合细胞毒性T细胞(CTLs)过继免疫治疗的实际抗瘤效果并探讨其中可能的机制.方法:通过皮下接种瘤细胞制备黑色素瘤荷瘤鼠模型;腹腔注射CTX,每隔7天给药一次,共3次;应用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的变化.体外培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DCs),制备肿瘤抗原特异性的CTLs.在腹腔注射CTX后4天,鼠尾静脉注射CTLs,每隔7天治疗一次,共3次.绘制各组肿瘤生长曲线.结果:随着荷瘤时间的延长,荷瘤鼠CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例逐渐升高.循环应用CTX 能够延长对Tregs的抑制,维持其在相对较低水平.循环CTX+CTLs疫苗治疗组的抑瘤作用为明显(P＜0.05);治疗组中未见免疫性白斑等自身免疫病及明显化疗毒副反应.结论:循环应用低剂量CTX能够规律有效地调控Tregs,显著提高CTLs过继免疫治疗的疗效.
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大鼠骨髓间充质干细胞对T细胞免疫活性的影响
目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对脾脏T细胞的免疫调节作用.方法:从大鼠骨髓中分离培养间充质干细胞,通过瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态,并用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测其细胞表面特征分子表达情况.MTT法测定经刀豆蛋白A(ConA)刺激后,不同数量MSCs对T细胞增殖能力的影响;ELISA法检测MSCs对T细胞分泌IFN-γ和IL-4水平的影响.FCM检测MSCs对脾脏T细胞凋亡水平的影响.MTT法测定MSCs对细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,CTL)杀伤活性的影响.结果:经不同数量MSCs作用后,脾脏T细胞增殖水平明显低于阳性对照组(P＜0.01),而且MSCs比例越高,其抑制作用越强(P＜0.01).经MSCs作用后,T细胞分泌IFN-γ的水平明显降低,而分泌IL-4的水平明显升高,且这种作用随MSCs比例的增加而增强(P＜0.01).MSCs能够抑制在体外培养过程中T细胞的自发凋亡.与MSCs共培养后,T细胞对L1210细胞的杀伤活性和单独培养组相比明显下降(P＜0.05).结论:MSCs能够抑制T细胞增殖反应和CTL活性,该作用可能与MSCs改变T细胞分泌细胞因子水平有关,但与诱导T细胞凋亡无关.
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CD8+T细胞活化与分化的分子机制
CD8+ T细胞识别由MHCⅠ分子递呈的抗原肽,由于大多数有核细胞都表达MHCⅠ分子,因此CD8+ T细胞在清除被病毒、胞内菌、寄生虫等感染的细胞或突变的肿瘤细胞中发挥着重要作用.识别病原微生物等抗原后,CD8+ T细胞活化并分化形成多种类型的效应和记忆细胞,不仅能及时清除被感染的细胞,也能形成长期保护.各亚群CD8+ T细胞的表面分子、功能和定位不同,细胞存活的时间、再次感染时的增殖能力和效应功能也有所差别.本文主要讨论CD8+ T细胞如何受到多条信号通路和转录因子调控,活化和分化成不同类型的效应和记忆细胞,并对临床应用T细胞抵御肿瘤和病原微生物的进展作一简单概述.
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慢性乙型肝炎外周血细胞毒性T细胞亚群(Tc1/Tc2)失衡的研究
目的 研究细胞毒性T细胞亚群(Tc1/Tc2)在慢性乙型肝炎(CHB)和乙型肝炎肝硬化(LC)发病机制中的作用.方法 用流式细胞仪测定Tc细胞亚群特异性的细胞表面双标志物Tc1(CDS/CCR5)、Tc2(CD8/CD30)的方法,测检了75例CHB、40例LC患者和20例正常人(NC)外周血Tc1、Tc2水平.结果 CHB和LC患者外周血水平Tc1明显高于NC组(P<0.01);LC组Tc2小于CHB和NC组(P<0.05);重型CHB患者Tc1、Tc2均明显低于其它CHB患者(P<0.01);CHB和LC组Tc1/Tc2明显高于NC组(P<0.01).结论 CHB患者Tc细胞亚群(Tc1/Tc2)与正常人存在着差异,Tc细胞亚群失衡可能在CHB、LC患者病情的进展以及预后中起着重要作用.
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HIV-1CN与IL-2基因共表达核酸疫苗诱导产生CTL的观察
目的观察HIV-1CN gp120基因与IL-2基因共表达核酸疫苗质粒pGPIL-2诱导产生CTL.方法脂质体介导共表达中国流行株HIV-1 Gag-gp120基因与IL-2基因的核酸疫苗质粒pGPIL-2转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光法鉴定其表达.取pGPIL-2免疫鼠脾细胞,检测pGPIL-2诱导的细胞毒性T细胞杀伤活性.结果 pGPIL-2可有效地诱导CTL的产生,并可杀伤HIV-1CN嵌合基因转染的靶细胞.结论为进一步设计中国流行株HIV-1核酸疫苗提供了重要实验依据.
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转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞特异性杀伤淋巴瘤的体外实验
目的探讨转基因树突状细胞激活细胞毒性T细胞产生抗淋巴瘤的特异性细胞免疫反应.方法采用人骨髓来源的髓系前体细胞,在人细胞因子IL-4、GM-CSF和TNF-α诱导下,在体外生成大量树突状细胞.将制备好的含有IgVH1核酸质粒,用脂质体法转染树突状细胞.转染成功的树突状细胞与外周血T淋巴细胞共培养,激活特异性CTL细胞,与阳性表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞反应,用3H-TdR掺入法观察CTLS对瘤细胞的特异性杀伤效应.结果树突状细胞能够用脂质体方法转染IgVH1核酸质粒,并且有效递呈给外周血T细胞,对表达IgVH1的人淋巴瘤Namalwa细胞产生特异性免疫杀伤活性,与对照组相比差异有显著意义(P<0.01).结论体外诱导扩增的DC能够转染IgVH1核酸质粒,体外激活T淋巴细胞,产生特异性细胞毒效应.
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024 穿孔素研究进展
穿孔素是细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。近来的研究表明，穿孔素不仅是重要的效应分子，而且是重要的免疫调节分子，在抗肿瘤免疫、抗病毒免疫和自身免疫中起着重要的调节作用。本文着重就穿孔素在免疫调节中的研究进展做一简要综述。
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细胞毒性T细胞在白血病中的研究进展
T细胞免疫在急性白血病的抗肿瘤免疫中起重要作用,细胞毒性T细胞(CTL)被活化至少需要两个信号, T辅助细胞的活化必须由抗原提呈细胞提呈MHC-II类抗原,而后者还必须有表面的B7 分子与T辅助细胞上的CD28分子相结合才能完成;急性白血病人体内可能存在可被IL-2诱导的CTL的前体细胞;CTL对白血病细胞的作用途径以MHC 限制性途径为主.
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HIV疫苗研究进展与挑战
本文介绍了人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗研究的新进展、临床研究与临床前开发情况以及面临的挑战.
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EB病毒LMP2A特异性CTL的体外诱导及分析
用EBV-LMP2A重组痘苗病毒(rVV-LMP2A)转染人树突状细胞(DC),转染后的DC分别在第1、7、14天刺激相同MHC背景的T细胞,在IL-2作用下诱导LMP2A特异性CTL.用LDH释放法检测CTL杀伤活性;流式细胞术(FACS)检测CTL诱导分化过程中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+等细胞的分群变化;RT-PCR检测细胞分化过程中FasL mRNA表达;生物活性法检测功能性细胞因子IFN-γ的分泌.结果显示本法诱导的CTL对靶细胞有特异性杀伤活性,第2次和第3次DC刺激后杀伤活性有所上升;在CTL诱导分化的第7、14、21天细胞分群以CD4+、CD8+细胞为主;RT-PCR证实所诱导的细胞内有FasL mRNA的表达;随细胞培养天数的增加IFN-γ分泌增加,在第14天达到较高水平.研究表明重组痘苗病毒载体rVV-LMP2A转染的DC刺激T细胞可诱导出EBV-LMP2A特异性CTL.
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不同T细胞亚群及与其他免疫细胞协同作用参与子宫内膜异位病灶的形成和发展
子宫内膜异位症(简称:内异症)是育龄期妇女常见的妇科疾病,虽然内异症的发病机制至今尚未完全阐明,但越来越多的证据表明免疫因素在内异症的发病中具有重要作用.内异症患者盆腹腔异常的免疫微环境是子宫内膜得以异位种植生长的关键因素.T细胞在细胞免疫反应中居于核心地位,不同T细胞亚群则发挥着不同的免疫效应功能,它们与其他免疫细胞如单核巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等协同作用,共同参与内异症的发生发展.
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MHC-Ⅰpep四聚体技术检测人类巨细胞病毒特异性细胞免疫功能的新进展
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属疱疹病毒β亚科,人群的感染率为80%～90%.大量研究表明,机体感染HCMV的后果主要决定于机体的免疫功能,尤其是特异性T细胞的功能对HCMV感染的控制和恢复起主要作用.
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肝移植患者在严重细菌感染状态下细胞毒性T细胞功能的研究
目的 探讨肝移植患者在严重细菌感染状态下细胞毒性T细胞(CTL)应答效应,为控制肝移植后细菌感染提供指导.方法 共收集52例肝移植术后患者,分为感染组和非感染组,分离外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞,EB病毒转染的B淋巴母细胞为靶细胞,有CD3单克隆抗体诱导,用乳酸脱氢酶(LDH)法测定CTL应答效应.结果 52例肝移植患者在围手术期(1个月)内共有27例发生细菌感染,其中23例感染控制,4例患者死亡；25例患者未发生感染.感染者和非感染者CTL杀伤率分别为11.2％和63.4％,差异有统计学意义,24例存活的感染者在感染状态下和感染控制后CTL应答分别为13.8％和57.9％,差异有统计学意义.结论 肝移植患者在严重细菌感染状态下存在CTL功能显著降低,在不产生排斥反应的情况下,适当提高CTL免疫应答有利于细菌感染的控制.
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MGBA负载脐带血DC诱导特异性CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用
目的:观察乳腺珠蛋白(mammaglobinA,MGBA)负载脐带血来源树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导产生的细胞毒性T细胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)对乳腺癌细胞的体外杀伤效果.方法:采集健康剖宫产女性志愿者的脐带血,分离脐带血单个核细胞并诱导DC生成,用MGBA致敏DC与自体淋巴细胞共培养诱导CTL.采用流式细胞术测定DC的表型(CD83、CD86、HLA-DR)变化,ELISA法测定IL-10、IL-12分泌水平,CCK-8法测定CTL对乳腺癌细胞的杀伤活性.结果:成功培养出形态典型、功能成熟的DC,MGBA负载DC诱导的MGBA特异性CTL对乳腺癌细胞MDA-MB-415产生显著的杀伤效果(P＜0.05);加入HLA-Ⅰ抗体可显著减弱杀伤效果,加入HLA-Ⅱ抗体细胞毒活性无显著变化,加入HLA-Ⅰ抗体或HLA-Ⅱ抗体对正常乳腺细胞的杀伤性均无影响.结论:MGBA能明显加强脐带血DC诱导的CTL对乳腺癌细胞的杀伤活性,该杀伤活性具有MHC限制性.
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米托蒽醌通过诱导钙网蛋白的表达抑制黑素瘤的生长
目的:观察米托蒽醌(mitoxantrone,MIT)对黑素瘤B16细胞钙网蛋白(calreticulin, CRT)表达的影响,探讨高表达CRT的B16细胞膜抗原疫苗的免疫效果及其机制.方法:不同剂量MIT处理B16细胞,免疫荧光法检测B16细胞CRT的表达.以B16细胞建立小鼠荷瘤模型,用不同剂量的MIT治疗荷瘤小鼠,观察MIT对黑素瘤生长及肿瘤组织中CRT表达的影响.制备B16细胞膜蛋白和MIT处理后B16细胞膜蛋白作为疫苗分别免疫小鼠,免疫组化检测小鼠移植瘤组织内免疫细胞的浸润情况,流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏中CD4+、CD8+T细胞比例的变化.结果:MIT可剂量依赖性地上调B16细胞表面CRT的表达,对照组B16细胞表面CRT为(29.40±3.57)%,高剂量MIT处理组为(72.20±2.94)%(P<0.05);MIT促进移植瘤组织中CRT的表达,对照组为(3.21±1.37),高剂量MIT组为(9.17±1.06)(P<0.05).MIT有效抑制小鼠黑素瘤的生长(P<0.05,P<0.01).与B16细胞膜蛋白疫苗相比,高表达CRT的MIT-B16细胞膜蛋白疫苗可明显上调小鼠黑素移植瘤组织中的DCs和T细胞的数量,以及脾脏细胞中CD4+、CD8+T细胞的比例(P<0.05).结论:MIT能够上调CRT在B16细胞表面的表达,高表达CRT的B16细胞膜蛋白疫苗能够提高肿瘤组织中浸润DCs和T细胞的数量,抑制黑素瘤的生长.
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Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用
目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.
关键词： 4-1BBL 抗CD28单克隆抗体 抗肿瘤免疫 细胞毒性T细胞 -
LMPs特异性T淋巴细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用
目的:研究树突状细胞负载EB病毒潜伏膜蛋白(latent membrane proteins,LMPs)介导生成的LMPs特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)LMPs-CTL的生物学特性,观察其对LMPs阳性鼻咽癌细胞SUNE的杀伤作用.方法:用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,采用贴壁分离及白细胞介素(interleukin,IL)-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC),通过DC细胞负载LMPs多肽抗原并递呈给同源T淋巴细胞,制备LMPs-CTL.CCK8法检测LMPs-CTL对SUNE细胞的杀伤作用;ELISA和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxy fluoroscein succinimidyl ester,CFSE)染色法检测LMPs-CTL分泌IFN-γ及其增殖.结果:LM Ps-CTL对SUNE细胞的杀伤率在12h和24 h分别为(43.47±1.93)％和(77.15±3.18)％,显著高于对照组的(11.45±3.06)％和(24.27±13.20)％(P＜ 0.05).SUNE细胞刺激后,LMPs-CTL增殖能力较对照组有明显增强,IFN-γ分泌量达到(613.40±121.77) pg/ml,显著高于对照组(86.90±3.70) pg/ml(P＜ 0.05).结论:通过DC细胞负载LMPs混合多肽可诱导生成LMPs-CTL,对LMPs阳性鼻咽癌细胞有较强的杀伤作用.
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树突状细胞对肿瘤特异性CTL体外激发、扩增及功能的作用研究
目的研究凋亡肿瘤细胞负载的DCs联合细胞因子对T细胞体外激发、扩增及功能的诱导作用.方法人B淋巴瘤细胞株Raji经顺铂(DDP)诱导凋亡,体外共育法负载DCs,DCs和T细胞体外共培养观察DCs对T细胞的效应,采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型:ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10的含量;溶血实验检测细胞毒性T细胞(CTL)产生穿孔素的能力;体外肿瘤杀伤实验分析CTL的特异性肿瘤杀伤作用.结果凋亡肿瘤细胞负载联合CD40激发的DCs能有效地激发自体T细胞的体外扩增并诱导具有较特异杀伤肿瘤细胞作用的CTL.结论凋亡肿瘤细胞负载的DCs在CD40信号的作用下对自体T细胞具有较强的激发和扩增效应,所获得的CTL对肿瘤细胞具有较特异的杀伤作用.
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非细胞毒性清除乙型肝炎病毒机制的研究
乙型肝炎发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理损伤,涉及到病毒和机体两方面因素,而非细胞毒性机制在清除HBV中发挥主要作用.
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丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建
目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法：基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL（细胞毒性T细胞）表位（NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180），2条HLA-A*1101限制性CTL表位（NS3609-617和NS5b251-259），1条HLA-A*2402限制性CTL表位（NS5b382-390）和2条Th（辅助性T细胞）表位（P73-15和NS5A276-288），合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A；阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠，采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果：合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后，采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL，后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论：成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。
