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细胞治疗的研究进展
1 概述随着对医学研究的不断深入,人们逐渐认识到,细胞是生命的基础,细胞健康是人体健康的根本,世界卫生组织(WHO)对疾病康复也做了新的定义:"治愈疾病根本的途径是修复细胞、改善细胞代谢、激活细胞功能."由此可见,疾病康复的标准已经要求达到细胞康复的水平.因此有科学家形象地说:"20世纪是药物治疗的年代,21世纪将是细胞治疗的年代."这也将为输血医学的发展和进步提供更广更宽的舞台.
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EB病毒-细胞毒性T细胞免疫治疗改善EB病毒相关非霍奇金淋巴瘤化疗效果的实验研究观察
目的 探讨EB病毒(EBV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫治疗对EBV相关非霍奇金淋巴瘤(NHL)化疗效果的影响及机制.方法 通过细胞学实验成功诱导并扩增出大量的EBV特异性CTL;建立人EBV相关NHL的Balb/c裸雌鼠动物模型,设单纯免疫(EBV-CTL)治疗组、单纯化疗(CHOP)组、免疫治疗联合化疗疫(EBV-CTL+CHOP)治疗组以及空白对照组,5只/组,观察各组动物肿瘤生长情况;治疗结束后剥离肿瘤组织检测瘤内免疫细胞变化情况.结果 体外杀伤实验显示伴随效靶比的增加,EBV-CTL杀伤能力逐渐增大:效靶比例分别在2.5:1、5.0:1与、10:1及20:1时,杀伤效率(％)分别为9.41±1.23、19.45±3.54、50.34±6.77和55.26±7.21(P ＜0.01);动物实验显示自免疫治疗d3起,与对照组相比,3组实验组抑制淋巴瘤生长率(％)分别为28.57、57.9、76.7(P ＜0.01).进一步检测肿瘤相关免疫微环境实验发现,治疗后肿瘤内浸润性CTL及巨噬细胞(TIM)平均比率(％),EBV-CTL+CHOP组、EBV-CTL组、CHOP组及空白对照组分别为13.65±1.48、4.33％±1.04％,10.24±1.2％、3.82±0.54,6.83±0.16、0.95±0.07,6.32±0.18、1.96±0.24(P ＜0.05).结论 EBV特异性CTL可能通过激活TIM增殖而间接促进肿瘤免疫应答.EBV-CTL免疫治疗能有效改善EBV相关NHL化疗疗效,或对EBV相关NHL的治疗起到一定指导作用.
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脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞对人卵巢癌裸鼠移植瘤治疗的研究
目的:研究脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞用于卵巢癌过继免疫治疗的可行性.方法:采用肿瘤细胞和淋巴细胞混合培养法获得脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞对人卵巢癌裸鼠移植瘤进行治疗并与外周血来源淋巴因子激活的杀伤细胞相对照.结果:脐血来源的细胞毒性T淋巴细胞有明显的抑瘤作用,移植物抗宿主病的发生不明显.结论:脐血可作为过继免疫治疗中效应细胞来源试用于卵巢癌的治疗.
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细胞毒性T细胞与肿瘤免疫治疗
宿主对肿瘤的免疫应答是细胞免疫和体液免疫对肿瘤作用的综合结果,其中细胞免疫是抗肿瘤免疫的重要组成部分.本文通过介绍T细胞活化机制和杀死靶细胞的机制,进而综述目前常用的抗肿瘤免疫途径.
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纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用
目的 探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-155抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响.方法 用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联.用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态；ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷；用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率；用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166；分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响.结果 所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12 ±5.34) mV.蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25％；增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌；杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果.结论 抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用.
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HBV截短core基因融合preS1基因在BCG中的表达及其免疫应答
目的:探讨HBV相关抗原在卡介苗(BCG)中的有效表达及其刺激产生的体液和细胞免疫应答效果.方法:将带有HBV截短C基因和preS1基因片段的穿梭载体转化BCG菌株,筛选重组菌,SDS-PAGE和Western blot实验分析其抗原表达特性;分别以生理盐水、BCG、BCG-pDE22、BCG-pDE22-CS1皮下注射BALB/c小鼠,进行连续抗体测定和细胞毒性T细胞杀伤实验.结果:与对照组相比,重组BCG可表达M_r为24 000的新生蛋白,与CS1融合蛋白大小相符,Western blot实验分析显示出良好的抗原结合特性;带有HBVCS1抗原基因的重组BCG免疫组抗体滴度显著升高,特异性杀伤能力更强.结论:BCG可以作为HBV相关抗原的活载体,为研制HBV新型疫苗提供了实验依据.
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食管癌组织微环境对树突状细胞的影响
目的:探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响, 揭示肿瘤免疫逃逸机制, 为DC疫苗的应用提供理论基础.方法:制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液, ELISA检测其VEGF-A含量.密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞, 含rhGM-CSF和rhIL- 4 RPMI1640培养液诱导DC, 第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、癌旁匀浆上清组、 VEGF-A组, 均隔天半量换液, 第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原, 第6天加入脂多糖, 第8天收集各组细胞.观察DC形态, 流式细胞术(FCM)检测免疫表型, RT-PCR检测CD1a表达, CCK-8检测T细胞增殖率及杀伤率.结果:食管癌组织匀浆上清VEGF-A含量[(0.987±0.319) μg/L]明显高于癌旁[(0.152±0.105) μg/L, P<0.05]; 食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制, CD86分子阳性率(%)与正常DC相比由69±8降为42±11、 CD1a由56±12降为27±12、 CD11c由21±13降为18±13(P<0.01), CD1a基因几乎无表达, 刺激T细胞增殖率(%)由112.5±7.2降为70.2±3.5(P<0.01), 杀伤率(%)由62.4±0.6 降为46.8±1.6(P<0.01); 癌旁匀浆上清液组、 VEGF-A组结果与正常DC组无统计学意义.结论:食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用, 在该抑制作用中VEGF-A并不起主要作用.
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转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞诱导个体化免疫治疗的体外实验
目的:探讨转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞(DC)体外介导抗胃癌的免疫效应.方法:制备短期培养的原代胃癌细胞.用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC的发育和成熟,并转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T细胞产生CTL,用CCK-8试剂盒检测CTL的杀伤活性.应用流式细胞术及混合淋巴细胞培养技术检测DC的免疫功能状态.用ELISA法测定IL-12和INF-γ的水平.结果:转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC,不仅可高表达MHC-I、II类分子及CD80、CD83和CD86协同刺激分子,并可获得高效刺激自体或异体T细胞增殖的能力.转染RNA的成熟DC,分泌IL-12的水平及其刺激产生的CTL培养上清液中INF-γ的水平显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体胃癌细胞的杀伤率显著高于异体组.结论:转染自体胃癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性杀伤活性的CTL.
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HCV螺旋酶N端HLA-A2限制性CTL表位的变异和CTL免疫应答
目的: 研究丙型肝炎病毒(HCV)螺旋酶N端HLA-A2限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位的变异及其增殖反应.方法: 对两例慢性HCV感染者随访7年, 用第1年和第5年的外周血提取病毒RNA, 再以RT-PCR扩增HCV螺旋酶N端基因, 并亚克隆及测序.根据测序结果, 合成CTL抗原表位肽段.用血清学方法进行HLA分型.从感染者第7年外周血中分离淋巴细胞, 检测CTL对抗原肽的增殖反应.结果: 在具有HLA-A2表型的感染者中, 第1年病毒抗原表位的起始氨基酸均存在琥珀突变, 5年后该突变消失.在无HLA-A2表型的感染者中, 其感染后5年病毒抗原表位肽段既无共有序列的变异, 也无琥珀突变.HCV感染后7年, 两例感染者的淋巴细胞对该抗原表位肽段均无增殖反应. 结论: 螺旋酶N端抗原表位出现的无义突变, 可能与病毒的免疫逃避有关.在慢性感染的后期, 病毒感染者对螺旋酶N端的CTL表位肽不出现免疫应答.
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丙型肝炎患者血清HSP70水平的检测及HSP70-HCV肽诱导CTL作用
目的: 检测丙型肝炎患者及正常人血清中HSP70的水平, 探讨HSP70-HCV肽体外诱导特异性CTL的作用.方法: 先用ELISA法筛选出丙型肝炎患者及正常人血清, 再用双夹心ELISA法检测血清HSP70, 并分析抗HCV抗体和HSP70之间的关系.用HSP70-HCV肽激活外周血单个核细胞后, 通过51Cr释放试验测定CTL的杀伤活性. 结果: 76份血清(抗HCV抗体阳性28例, 正常人血清48例)中, 抗HCV抗体阳性患者HSP70的检出率为82.1%, 正常人血清中HSP70的检出率为18.8%.HSP70的检出率与HCV感染呈显著相关(χ2=28.77, P<0.01).HCV感染者血清HSP70的含量显著高于正常人.HSP70与HCV C区肽(DLMGYIPAV)的混合物, 可诱导1例患者的CTL对自体HCV肽致敏靶细胞的杀伤率达37.8%, 而用HCV肽单独作用则不显著.结论: HCV感染可刺激机体过表达HSP70, 同时HSP70可能有增强HCV表位肽递呈促进CTL特异性杀伤HCV感染细胞的作用.
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隐球菌抗原MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定
目的 鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.方法 应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位.结果 位于MP98 氨基酸序列肽5(436-444aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体者PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL.结论 肽5 GMFDGLSGV(436-444aa)是MP98上HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位.
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加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定
目的 制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体.方法 以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体.利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Western blot和ELISA鉴定折叠产物的构象.以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体.结果 该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性.结论 成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体.
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EB病毒免疫逃逸的分子机制
EB病毒( Epstein-Barr vius, EBV)是一种广泛的对人类感染的γ疱疹病毒,与人类多种疾病尤其是恶性肿瘤有关。其致病的一个重要条件是能够在人体B细胞中长期潜伏,并且在人体免疫力低下时被激活并增殖,这表明EB病毒存在逃逸宿主细胞免疫的机制。从潜伏期EB病毒基因表达的下调、干扰抗原加工和提呈、调节细胞毒性T细胞( Cytotoxic lymphocyte, CTL)免疫应答、干扰细胞因子的作用、干扰CTL的活动及抑制宿主细胞凋亡、抑制辅助性T细胞1(Helper T cell 1, Th1)免疫应答等方面,对EB病毒免疫逃逸的分子机制作一简要综述。
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细胞毒性T细胞表位预测
细胞毒性T细胞表位是由8～10个连续的氨基酸残基构成的特殊肽段.本文对基于基序、基于结构、基于人工神经网络和隐马尔可夫模型的各类细胞毒性T细胞表位预测方法进行了综述.
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HLA-A0201阳性慢性粒细胞白血病PR1特异性细胞毒性T细胞的初步研究
目的 探讨PR1特异性细胞毒性T细胞(CTL)与HLA-A0201阳性慢性粒细胞白血病(CML)患者疗效及预后的关系,探讨是否可以应用PR1肽作为疗效达到停药试验标准患者的后续免疫治疗,从而维持长期缓解状态.方法 收集28例HLA-A0201阳性CML患者外周血,利用可溶性PR1-MHC-Ⅰ类四聚体技术及流式细胞术检测PR1特异性CTL存在与否、频率高低;比较不同治疗时间CML患者PR1特异性CTL表达的差异.结果 PR1特异性CTL频率与同期PCR(bcr-abl/abl)IS(IS:国际标准值)之间呈负相关(r=-0.658,P＜0.001).接受治疗3、6、9个月及1、2、3、4、5、6年的PR1特异性CTL频率分别为(0.06±0.02)％、(0.10±0.02)％、(0.14土0.02)％、(0.16±0.02)％、(0.20±0.03)％、(0.18±0.03)％、(0.18±0.01)％、(0.17±0.05)％、(0.18±0.03)％.治疗3、6、9个月的频率分别与其他时间点频率相比,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).治疗1年及以上的频率两两相比,差异均无统计学意义(均P＞0.05).伊马替尼400 mg 1次/d治疗3、6、9、12个月,Sokal评分高危组患者PR1特异性CTL频率低于低危组、中危组.结论 治疗效果显著的CML患者体内可持续检测到PR1特异性CTL,其与肿瘤负荷呈负相关,提示PR1特异性CTL可能与抗白血病细胞作用相关,为疗效获得持续稳定MR4-5及MR5.0的CML患者使用PR1肽疫苗作为后续免疫治疗提供了依据.
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4-1BBL修饰小鼠结肠癌疫苗体外诱导抗肿瘤免疫反应的研究
背景与目的:研究4-1BBL(4-1BB Ligand,即CD137配体)转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)特异性杀伤活性及刺激淋巴细胞产生细胞因子的作用.材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKITneo/4-1BBL导入小鼠结肠癌colon26细胞,经G418筛选后获得4-1BBL高表达克隆,用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗,与经体外诱导的同系小鼠CTL共同培养,测定对CTL特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子(IL-2、IL.-4和IFN-γ)的影响.结果:转染4-1BBL的colon26细胞高表达4-1BBL蛋白,将该细胞经MMC处理后制成的瘤苗,与野生型colon26细胞相比,对CTL特异性杀伤亲本肿瘤细胞的作用明显增强(P＜0.01),但CTL对非亲本肿瘤细胞的杀伤作用无明显影响(P＞0.05);该瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的能力(P＜0.01).结论:4-1BBL转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗能有效诱导抗结肠癌免疫反应.
