LATS2基因在上皮性卵巢癌中的表达和临床意义

目的 检测人上皮性卵巢癌组织中大型肿瘤抑制因子2(LATS2)的表达与其发生、发展及临床病理参数之间的相关性.方法 用RT-PCR、SYBR Green实时定量PCR及免疫组化检测LATS2 mRNA和蛋白的表达.结果 LATS2 mRNA在上皮性卵巢癌组织中的表达量低于良性组和正常组(P＜0.01)；LATS2的表达水平与组织分化程度(P＜0.05)、FIGO分期(P＜0.01)、有淋巴结转移(P＜0.01)有关.LATS2蛋白主要定位于胞质；上皮性卵巢癌LATS2的阳性表达率均低于良性组和正常组(P＜0.01)；LATS2蛋白在临床晚期、组织分化低及有淋巴转移组中的阳性表达率低于临床早期、组织分化高及无淋巴结转移组(P＜0.01).结论 LATS2基因的表达水平可能与上皮性卵巢癌的发生、发展相关,对其早期诊断及预测病情进展具有一定的意义.

检测锯齿状腺瘤中CDX2基因甲基化率的两种qPCR方法比较

目的 应用两种方法检测锯齿状腺瘤中CDX2基因甲基化状态,比较这两种检测方法的差异.方法 采用Taqman探针qPCR (MethyLight)和SYBR Green qPCR方法检测129例锯齿状腺瘤(包括61例SSA/P、68例TSA)和42例正常结直肠黏膜组织中CDX2基因CpG岛甲基化状态.结果 MethyLight方法:SSA/P组织中CDX2基因甲基化率(75.41％,46/61)高于对照组(53.38％,22/42),两者差异显著(P＜0.05).TSA组织中CDX2基因甲基化率(80.88％,55/68)高于对照组(53.38％,22/42),两者差异显著(P＜0.05).SYBR Green qPCR方法:SSA/P、TSA组和对照组的组织中CDX2基因均呈高甲基化状态,SSA/P组织中CDX2基因甲基化率(81.97％,50/61)高于对照组(73.81％,31/42),两者比较差异不显著(P＞0.05);TSA组织中CDX2基因甲基化率(86.76％,59/68)高于对照组(73.81％,31/42),两者比较差异不显著(P＞0.05);结论 MethyLight消除了引物二聚体和非特异性扩增对试验结果的影响,提高了结果的特异性和准确性,被证实是进行异常DNA甲基化状态检测的可靠方法.

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的 建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法.方法 根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测.结果 建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%(21/81),高于普通PCR检测率20.99%(17/80).结论 建立的Real-time PCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测.

SYBR Green 实时定量PCR检测乳腺癌组织CXCR4基因的表达

.59),P=0 001.CXCR4 mRNA在乳腺癌中表达上调与淋巴结转移数目(>3个)、HER-2表达情况(+ + +)密切相关,P值分别为0.013和0 031.但CXCR4 mRNA在不同年龄、绝经情况、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及其他免疫组化指标(ER、PR、p53和Ki-67)组间的差异均无统计学意义,P>0.05.结论:趋化因子受体CXCR4表达可作为预测乳腺癌转移的生物学指标,有望成为乳腺癌治疗的新靶点.

Objective: hTe results of a previous study showed that a clear dysregulation was evident in the global gene expression of the BCL11A-suppressed B-lymphoma cells. In this study, the bone morphogenetic protein receptor, type II (BMPR2), E1A binding protein p300 (EP300), transforming growth factor-β2 (TGFβ2), and tumor necrosis factor, and alpha-induced protein 3 (TNFAIP3) gene expression patterns in B-cell malignancies were studied.
Methods:The relative expression levels ofBMPR2,EP300,TGFβ2, andTNFAIP3 mRNA in B-lymphoma cell lines, myeloid cell lines, as well as in cells from healthy volunteers, were determined by real-time quantitative reverse transcript-polymerase chain reaction (qRT-PCR) with SYBR Green Dye. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as reference.
Results:hTe expression level ofTGFβ2 mRNA in B-lymphoma cell lines was signiifcantly higher than those in the cells from the healthy control (P<0.05). However, the expression level ofTNFAIP3 mRNA in B-malignant cells was signiifcantly lower than that of the healthy control (P<0.05). hTe expression levels ofBMPR2 andEP300 mRNA showed no signiifcant difference between B-malignant cell lines and the healthy group (P>0.05). In B-lymphoma cell lines, correlation analyses revealed that the expression ofBMPR2 andTNFAIP3 (r=0.882,P=0.04) had signiifcant positive relation. hTe expression levels ofBMPR2,EP300, andTNFAIP3 mRNA in cell lines from myeloid leukemia were significantly lower than those in the cells from the healthy control (P<0.05). hTe expression levels ofTGFβ2 mRNA showed no signiifcant difference between myeloid leukemia cell lines and the healthy control or B-malignant cell lines (P>0.05). hTe expression levels of BMPR2,EP300, andTNFAIP3 mRNA in B-lymphoma cells were signiifcantly higher than those of the myeloid leukemia cells (P<0.05).
Conclusion:Different expression patterns ofBMPR2,EP300,TGFβ2, andTNFAIP3 genes in B-lymphoma cells exist.

实时荧光定量聚合酶链反应技术及应用

从1985年Kary Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,到1988年Saiki发现耐热DNA聚合酶,使PCR进入应用阶段,至今已有近20年的历史了.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)在核酸定量方面具有高敏感性、特异性强、可重复性等优点,从应用以来,给分子诊断领域带来了一次革命,并被广泛应用,成为科研的主要工具之一.本研究旨在阐述RQ-PCR的基本原理,介绍5种荧光化学方法:水解探针(hydrolysisprobes)、分子信标(molecularbeacons)、荧光标记引物(fluorescently-labeled primer)、双杂交探针(dual hybridization probes)、双链DNA嵌合剂SYBR Green Ⅰ(the double-stranded DNA-intercalating agent SYBR Green Ⅰ),并阐述其研究进展及应用.

针刺对肥胖模型大鼠下丘脑瘦素受体mRNAB的表达与针刺的影响:SYBR Green实时定量聚合酶链反应检测

背景:脂肪细胞合成的瘦素作用于下丘脑,引起食欲降低,能量消耗增加.导致降低体质量,减少体脂.但单纯性肥胖病患者由于瘦素抵抗导致肥胖.目的:观察针刺对肥胖大鼠血清瘦素含量和下丘脑瘦素受体OB-Ra和OB-Rb表达的影响,探讨针灸减肥的机制.设计、时间及地点:随机对照动物实验.于2006-10/2007-01在南京中医药大学动物实验中心完成.材料:刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只,体质量50-70 g.实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的<关于善待实验动物的指导性意见>.方法:随机挑选10只普通饲料喂养为正常组.另一组80只高脂致肥饲料喂养,将造模成功的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺组,每组各15只.采用实时定量聚合酶链反应技术测定瘦素受体(OB-Ra,OB-Rb)基因表达水平,酶联免疫测定法测定血清中瘦素的含量.主要观察指标:针刺治疗前后肥胖大鼠体质量、血清中瘦素的含量以及下丘脑OB-Ra与OB-Rb基冈表达的变化.结果:肥胖模型组大鼠体质量、血清瘦素水平均显著高于正常大鼠,而下丘脑OB-Rb基因表达水平均明显低于正常大鼠.针刺治疗取得良好减肥疗效的同时,针刺组大鼠血清瘦索明显回降,而下丘脑OB-Rb基因表达水平却明显升高.OB-Ra表达量3组差异无著性意义.结论:针刺可改善肥胖大鼠瘦素抵抗状态以及促进下丘脑OB-Rb基因表达可能是针刺减肥的细胞分子重要机制.

猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法的建立

目的:建立一种用SYBR Green荧光染料检测猪细胞因子的实时PCR方法.方法:从猪外周血淋巴细胞中提取细胞因子mRNA,反转录成cDNA,利用SYBR Green荧光染料法实时检测IL8、IL10、IFNα、IFNγ和TNFα的mRNA表达水平.分别通过融解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析各细胞因子检测的特异性;并对各细胞因子PCR产物进行梯度稀释后作为模板进行敏感性试验;利用建立的方法分别对正常猪和感染PRRSV的猪的外周血淋巴细胞中上述细胞因子进行检测,并以管家基因cyclophilin为内参照对各细胞因子进行定量分析.结果:建立的各细胞因子SYBR Green实时检测方法具有良好的特异性和敏感性,TNFα检测敏感性可达10个拷贝,其它细胞因子检测敏感性均可达100个拷贝.猪在感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中IL8和IL10明显增加,而IFNα和TNFα略有下降.结论:建立了五种猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法,并能成功地应用于临床检测.

转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因拷贝数的检测

目的:采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因的拷贝数.方法:用本课题组前期构建的重组质粒pEAC 10、pEPC10作为标准品,SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因pacA-ctxB 、pacP-ctxB的转基因番茄植株总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数.结果:含pacA-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为1.3,含pacP-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为3.2.结论:构建的转基因番茄植株属低拷贝转基因植物,具有较好的稳定性.

实时定量聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3方法的建立

目的 建立检测前列腺癌抗原3(PCA3)基因的实时定量聚合酶链反应(PCR)方法.方法 应用反转录-PCR扩增PCA3后,通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定.应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测PCA3和建立相应的标准曲线,使用熔解曲线分析扩增产物的特异性.同时在临床标本中验证所建立的PCA3检测方法的效能.结果 琼脂糖凝胶电泳和基因测序均提示扩增产物是特异性的.建立的检测PCA3的SYBR Green实时荧光定量PCR方法的线性检测范围为1×101～1×10-7拷贝,扩增效率为98％,决定系数为0.999.熔解曲线仅见单一的峰,证实扩增产物是特异性的.该方法的日内和日间变异系数分别为2.1％和2.7％.利用所建立的PCA3检测方法分析86例前列腺癌患者和45例非前列腺癌患者尿液中的PCA3表达水平,结果表明PCA3早期诊断前列腺癌的性能显著优于血清前列腺特异性抗原(PSA).结论 建立了一种快速、灵敏、高特异性、宽定量范围和高重复性检测PCA3的实时定量PCR方法.

玫瑰糠疹患者单一核细胞转录因子T-bet mRNA及GATA-3mRNA的表达

目的 探讨T-bet、GATA-3在玫瑰糠疹发病机制中的意义.方法 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测17例玫瑰糠疹患者和20例正常人外周血单一核细胞中T-bet mRNA和GATA-3mRNA的表达.结果 玫瑰糠疹患者外周血中T-bet mRNA与GATA-3 mRNA Avg△Ct值分别为3.33±0.94与5.22±0.69,对照组分别为4.31±1.11与4.36±1.02.患者的T-bet mRNA表达高于对照组(P＜0.05),GATA-3表达低于对照组(P＜0.05).结论 玫瑰糠疹患者外周血中T-bet/GATA-3升高,Th1优势表达,细胞免疫异常在玫瑰糠疹发病过程中可能具有重要作用.

两种定量聚合酶链反应方法检测CK20 mRNA表达的比较

[目的]比较两种荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测结肠腺癌细胞系中CK20 mRNA的表达.[方法]分别用TaqMan探针和SYBR Green Ⅰ荧光染料作为荧光指示剂,检测CK20 mRNA在结肠腺癌细胞系中的表达水平,比较两种检测模式的差异.[结果]两种检测模式的检测结果均显示结肠腺癌细胞中有CK20 mRNA的表达,TaqMan荧光定量方法检测出CK20 mRNA的表达量高于SYBR实时定量PCR,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]两种荧光定量聚合酶链反应均能检测出结肠腺癌中CK20 mRNA的表达,且TaqMan荧光定量方法检出CK20 mRNA的表达量高于SYBR实时定量PCR.

SYBR Green实时定量PCR检测人脑原发胶质瘤中LATS1和LATS2基因的表达

目的:运用实时定量PCR检测肿瘤抑制基因LATS1和LATS2的mRNA在人脑原发胶质瘤组织中的表达情况,并进一步分析其表达变化与临床资料之间的关系.方法:建立SYBR Green实时定量PCR的检测方法;通过标准曲线法对肿瘤抑制基因LATS1和LATS2的mRNA在30例原发胶质瘤(WHO分级:Ⅱ级10例,Ⅲ级10例,Ⅳ级10例)和10例正常脑组织中的表达进行定量检测;统计学分析不同级别胶质瘤及正常脑组织间的表达差异,并进一步结合临床资料分析不同性别和不同年龄组的表达差异.结果:与正常脑组织相比,在各病理级别胶质瘤中LATS1和LATS2的mRNA表达均下调(P＜0.05),但胶质瘤不同级别组之间的差异均无统计学意义(P＞0.05).LATS1和LATS2在不同性别组和年龄组胶质瘤中的表达差异也无统计学意义(P＞0.05).结论:①成功地建立了SYBR Green实时定量PCR检测LATS1和LATS2基因表达的方法;②胶质瘤中LATS1和LATS2的mRNA表达水平均低于正常脑组织,但不同病理分级间的表达无明显差异.

SYBR Green实时定量PCR检测人原发脑胶质瘤中REV3和REV7基因的表达

目的 运用实时定量PCR检测跨损伤修复基因REV3和REV7在人脑原发脑胶质瘤组织中的表达水平,探讨其和肿瘤级别之间的关系.方法 采用SYBR Green实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测跨损伤修复基因REV3和REV7的mRNA在85例原发胶质瘤(Ⅱ级20例、Ⅲ级20例和Ⅳ级45例)和14例正常脑组织中的表达水平,统计学分析表达水平和肿瘤级别之间的关系.结果 与正常组织相比,REV3和REV7在各病理级别胶质瘤中均表达上调(P＜0.05);并且REV3在Ⅳ级胶质瘤中的表达比在Ⅱ级和Ⅲ级中都要高(P＜0.05).秩相关分析表明:REV3的表达量与胶质瘤病理分级呈正相关性(r=0.454,P＜0.001).结论 REV3和REV7在胶质瘤组织中均高表达,而且REV3表达水平和恶性程度有密切联系.

SYBR Green实时定量PCR检测胰腺癌中HIF1α、VEGF和bFGF的表达及其临床意义

目的:研究胰腺癌及癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGF mRNA的表达情况及其临床意义.方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应技术对22例胰腺癌细胞及其对应的癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGF mRNA进行定量检测,并分析其与临床病理特点之间的关系.结果:统计结果显示HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中的表达高于癌旁组织(P<0.01),相关性分析显示肿瘤组织中HIF-lα表达与VEGF、bFGF表达呈显著正相关(P<0.01).HIF-1α表达与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关(P<0.01),与TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄无相关性,VEGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关(P<0.05),bFGF高表达与肿瘤大小、淋巴转移淋巴转移相关(P<0.05),而与TNM分期、性别及年龄无相关性.结论:HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中存在高表达,HIF-1α表达与TNM分期、肿瘤大小和淋巴转移相关,VEGF和bFGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关.实时荧光定量PCR检测HIF-1α、VEGF和bFGF对评估胰腺癌患者预后可能有一定的价值,也为胰腺癌的治疗提供了治疗靶点.

SYBR Green实时荧光PCR技术在肝细胞癌基因甲基化定量分析中的应用

目的 建立一种简便易行的甲基化定量检测技术,并对肝细胞癌中基因的甲基化情况进行分析,从而对该技术在临床应用中的可行性进行评估.方法 基因组DNA经亚硫酸氢钠修饰处理后,构建包含CDKN2A和ACTB两个基因片段的质粒标准品,通过SYBR Green荧光定量PCR检测并制作标准曲线,并用这一方法对41例肝细胞癌中两种基因进行甲基化定量分析.结果 通过对扩增曲线、熔解曲线、标准曲线以及电泳结果的分析表明,SYBR Green荧光定量PCR对102～108拷贝/μL范围内质粒标准品的扩增具很高特异性、灵敏度和较宽的检测范围;通过对41例肝细胞癌手术标本的检测进一步表明证实了本方法在基因甲基化定量分析中的可行性.结论 SYBR Green荧光定量法作为一种简便易行且具备高通量分析能力的定量检测方法,可以应用于肿瘤中基因甲基化的研究与临床检测.

SYBR GREEN 荧光定量聚合酶链反应检测粘蛋白1在乳腺癌诊断中的应用

目的：探讨SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应法检测外周血循环肿瘤细胞中粘蛋白1基因表达水平在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法以β-actin为内对照，采用SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应法测定45名健康女性体检者、91例良性乳腺疾病患者和193例乳腺癌患者以及87例其它肿瘤患者外周血中粘蛋白1的表达量，分析不同临床病理因素与基因表达的相关性。结果乳腺癌患者粘蛋白1阳性率显著高于健康体检者、良性乳腺疾病和其它肿瘤患者（P＜0.05）；良性乳腺疾病及其它肿瘤患者粘蛋白1阳性率显著高于健康体检者（P＜0.05），而良性乳腺疾病与其它肿瘤患者粘蛋白1阳性率差异无统计学意义（ P＞0.05）；乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移及HER2／neu表达是MUC1 mRNA表达独立相关因素（ P＜0.05）。结论 SYBR GREEN 荧光定量聚合酶链反应法是灵敏较高、特异较强的快速定量检测粘蛋白1方法，可有效监测乳腺癌诊断、疗效、转移和预后。

一种新的实时荧光定量PCR方法对血小板制品细菌污染检测效果的评价

目的 建立一种自主研发的针对细菌16 S rDNA基因的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法并评价该方法对浓缩血小板制品中细菌污染检测的效果.方法 设计16S rDNA基因保守区引物,构建SYBR Green Real-timePCR反应体系;然后分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和绿脓杆菌以初始浓度为1CFU/mL、10 CFU/mL和100 CFU/mL接种到浓缩血小板中,经22℃保存7d后,用实时定量荧光PCR方法进行细菌检测.结果 细菌污染后的血小板在常规保存条件下,长保存期＜7d,不同接种浓度的细菌生长情况的变化趋势基本一致,所有种类的细菌均在d1、2表现出迅猛的增殖高峰,d3以后增殖趋于平缓.结论 该Real-time PCR检测体系可定量地检测出血小板的细菌污染的情况,可适用于血小板输注前的快速细菌污染检测.

17-AAG对人RPE细胞PDGFR和EGFR基因表达的调控

目的:通过检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中PDGFR和EGFR基因表达的调控.方法:体外培养人RPE细胞株.当加入17-AAG并作用0,2,5,10μmol/L及0,16,24,48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录.同时根据PDGFR、EGFR的基因序列,设计PDGFR、EGFR的引物,利用ABI 7300PCR仪和SYBRGreen,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct值进行基因表达的相对定量分析.结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调PDGFR基因的表达(P<0.05),上调EGFR基因表达(P<0.05).结论:SYBR Green实时荧光PCR可特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件.

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR.方法 运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价.结果 通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0× 102 copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0× 107 copies/μL、1.0× 105 copies/μL、1.0×103 copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96％～1.68％.结论 SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作.