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RNA干扰bcl-2基因质粒载体的构建
目的:构建bcl-2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体.方法:根据人bcl-2的基因序列设计短双链3条,人工合成后,连接到带增强型绿色荧光蛋白基因的pGenesil-1载体中,构成3个靶向bcl-2的重组质粒,经酶切、DNA序列测定鉴定,转人HepG-2细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,以确定靶向bcl-2重组质粒进行下一步研究.结果:成功构建了3个靶向bcl-2的shRNA表达载体,为下一步研究奠定基础.结论:靶向shRNA表达载体较其它形式的干扰RNA具更强烈的抑制同源基因表达的作用.
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应用RNA干扰技术体外抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达
目的给探讨脂蛋白脂肪酶基因作为动脉粥样硬化基因治疗靶点提供实验基础.方法利用RNA干扰技术在细胞水平抑制脂蛋白脂肪酶基因的表达,根据人脂蛋白脂肪酶基因设计靶序列短发夹RNA,构建重组干扰质粒pSIREN-DNR-shRNA,将干扰质粒与人脂蛋白脂肪酶真核表达质粒pCDNA3-hLPL以脂质体方法共转染COS-7细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和活性检测等方法判断脂蛋白脂肪酶基因抑制的效果.结果转染干扰质粒的细胞中脂蛋白脂肪酶mRNA、蛋白表达以及酶活性均明显降低,抑制率可达70%以上.结论所选靶序列可以有效抑制细胞中脂蛋白脂肪酶基因的表达,为进一步的体内研究奠定了基础.
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shRNA靶向抑制COX-2基因表达对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响
目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞SGC-7901的生长和细胞周期的影响.方法 构建COX-2基因的特异性小RNA干扰质粒,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.实验分3组:未转染胃癌细胞组,阴性对照HK组,pshRNA-COX-2转染组.用质脂体lipofectamine~(TM) 2000转染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞的生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为70.1%和43.2%;G_0～G_1期细胞由61.5%上升至70.2%,S期细胞由27.3%下降至21.7%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制COX-2的表达,从而抑制胃癌细胞生长.
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甲基莲心碱联合mdr-1shRNA对K562/A02细胞mdr-1/P-gp表达的影响
目的:探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr-1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr-1/ P-gp表达的影响. 方法:采用MTT方法比较Nef,mdr-1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT-PCR和Western印迹法检测mdr-1/P-gp的表达. 结果:Nef与mdr-1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr-1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr-1/P-gp表达的抑制作用强于单独处理组(P＜0.01). 结论:甲基莲心碱能增强mdr-1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr-1/P-gp表达的抑制作用,逆转mdr-1基因编码蛋白P-gp介导的多药耐药.
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P38丝裂原活化蛋白激酶短发夹RNA对H9C-2心肌细胞基因表达的影响
目的 探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的短发夹环RNA(shRNA)质粒对H9C-2心肌细胞增殖变化的影响并探讨其发生机制.方法 构建3种P38MAPK shRNA质粒并测序鉴定,将其转染入H9C-2心肌细胞中,应用RT-PCR和Western blotting检测心脏细胞P38MAPK mRNA和蛋白的表达.结果 P38MAPK shRNA质粒分布在心肌细胞的胞浆及细胞核中,与心肌细胞组比较,AngⅡ组和shRNA阴性组的P38MAPK mRNA和蛋白水平显著升高(P ＜0.01,P＜0.01)；与AngⅡ组比较,shRNA1、shRNA2和shRNA3组的P38MAPK mRNA和蛋白水平明显降低(P ＜0.05,P＜0.05,P＜0.01).结论 P38MAPK shRNA质粒成功转染心肌细胞,P38MAPK shRNA3质粒能有效地抑制心肌细胞P38MAPK的表达.
关键词： p38丝裂原活化蛋白激酶 短发夹RNA 心肌细胞 -
VEGF的RNAi对卵巢癌细胞SKOV3生物学活性的影响
目的 检测靶向血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹RNA(shRNA)质粒载体对卵巢癌细胞株SKOV3生物学活性的影响作用.方法 构建携带有GFP报告基因的VEGF-shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入卵巢癌细胞株SKOV3,通过流式细胞术检测细胞的转染效率,RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-mRNA及蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖抑制率,人工基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 VEGF-ShRNA稳定转染后,SKOV3细胞内VEGF-mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-ShRNA对SKOV3细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑增殖效应呈时间依赖性;VEGF-CshRNA组可有效抑制SKOV3细胞的人工基底膜体外侵袭能力.结论 VEGF在卵巢癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用,通过RNA干扰技术实现VEGF沉默在卵巢癌的生物治疗中具有较好的应用前景.
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大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干扰表达质粒构建与鉴定
目的 构建并筛选大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)基因的RNA干扰(RNAi)表达质粒,为职业性疾患的基因治疗探索新途径.方法 根据基因序列数据库中报道的PARP-1基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1 RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体Lipofectamine TM2000介导转染大鼠骨髓间充质干细胞.48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染细胞中PARP-1 mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1 RNAi质粒.结果 4种重组PARP-1 RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确.转染后48 h,转染质粒shRNA-PARP-1-532的细胞PARP-1基因抑制效果明显,mRNA的转录水平下降了78％,可作为后续实验的有效质粒.结论 成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为探索PARP-1基因在疾病中的作用奠定了基础.
关键词： 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 短发夹RNA 骨髓间充质干细胞 转染 大鼠 -
CD147基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以CD147为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的一对DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer 4.1-CMV neo构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:CD147靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,为肿瘤的基因治疗提供了可能.
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Fibulin-3表达对恶性胸膜间皮瘤细胞的影响
目的:研究纤蛋白3(fibulin-3)基因过表达/沉默对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelio-ma,MPM)细胞系SMC-1的影响,为MPM的治疗寻找新的方法.方法:分别构建fibulin-3过表达和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,并将SMC-1细胞分别转染空白对照载体(control)、过表达载体(Exp)、过表达对照载体(Exp-NC)、干扰载体(shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4)和干扰对照载体(shRNA-NC).应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,real-time PCR法和Western blot法检测过表达/干扰前后fibulin-3的表达情况.结果:SMC-1细胞转染相应载体后,流式细胞术结果显示,与control组相比,fibulin-3+Exp组的G2期细胞数量增加(P<0.05),shRNA2组的G2期数量减少(P<0.05);凋亡检测结果显示,与control组相比,Exp组的细胞凋亡率下降(P<0.05),而shRNA2组的细胞凋亡率上升(P<0.05).分子水平检测结果显示,与control组相比,Exp组fibulin-3和间皮素(mesothelin)的mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.05),各shRNA组fibulin-3和mesothelin的mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.05).结论:本实验构建了fibulin-3基因的过表达及沉默载体,证实转染Exp和shRNA能有效改变fibulin-3的表达水平及SMC-1细胞的生长,为以fibulin-3为靶点的RNA沉默手段应用于临床MPM的治疗提供了实验依据.
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慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因表达对人生长激素型垂体腺瘤细胞生长的影响
目的 观察慢病毒介导shRNA沉默PTTG基因表达对人生长激素型垂体腺瘤细胞生长的影响.方法 原代培养人生长激素型垂体腺瘤细胞,分为正常对照组、阴性对照组和实验组.实验组构建PTTG-shRNA的慢病毒表达载体并转染肿瘤细胞,阴性对照组转染空慢病毒载体,正常对照组细胞不转染.流式细胞仪分析细胞转染效率,RT-PCR和Westem blot检测肿瘤细胞PTTG mRNA和蛋白的表达水平,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 与正常对照组和阴性对照组比较,实验组细胞转染PTTG-shRNA慢病毒载体后,PTTG mRNA和蛋白表达显著下降(均P＜0.01),细胞生长显著变慢(均P＜0.05),G0/G1期细胞比例显著增高(均P＜0.05),凋亡率明显增加(均P＜0.05).结论 慢病毒介导shRNA沉默PTTG基因表达可显著抑制人生长激素型垂体腺瘤细胞的生长,为进一步研究垂体腺瘤的发病机制和肿瘤的基因治疗提供实验基础.
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钠氢交换子1短发夹RNA抑制醛固酮引起的系膜细胞纤连蛋白增生
目的 构建钠氢交换子1(NHE1)的短发夹RNA(shRNA),用来抑制NHE1表达,进一步明确NHE1是否直接介导醛固酮引起的细胞外基质增生.方法 构建靶向NHE1的短发夹状双链RNA的真核表达质粒(shRNA-NHE1),并将该质粒转染体外培养的大鼠肾小球系膜细胞.分别于转染后1、3、4 d用荧光定量PCR(real-time PCR)和Western印迹观察NHE1 mRNA和蛋白的表达.选择shRNA-NHE1质粒转染后第4天,给予醛固酮(10-7 mol/L)干预24 h,用ELISA法检测培养上清液中细胞外基质成分纤连蛋白(FN)的表达.结果 PCR结果显示转染后24 h,shRNA-NHE1组NHE1 mRNA表达下降36.9%;转染第3、4天NHE1mRNA表达降低69.2%和77.9%.Western印迹显示转染后24 h NHE1的蛋白表达无明显变化;3 d后蛋白水平显著下降,4 d后抑制作用更明显.ELISA结果显示,在未转染的系膜细胞中,醛固酮刺激后上清液中FN水平比对照组明显升高[(51.78±1.15)比(17.74±1.38)μg/L,P＜0.05],而当细胞转染shRNA-NHE1质粒后,醛固酮的上述作用被明显抑制[(28.07±1.73)μg/L,P＜0.05].结论 靶向NHE1的shRNA真核表达载体导入可以特异性抑制大鼠肾小球系膜细胞NHE1的表达,同时显著抑制醛固酮引起的FN增生,提示NHE1在醛固酮诱导的肾小球硬化中起重要作用.
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Survivin shRNA增强人卵巢癌耐药细胞OVCAR3对泰素敏感性的研究
背景与目的:耐药是目前恶性肿瘤治疗急需解决的难题.近研究显示,卵巢癌组织及细胞中均有Survivin高表达,可能与其抑癌耐药有关.本研究探讨Survivin的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人卵巢癌耐药细胞OVCAR3 Survivin基因表达、凋亡及其对泰素、顺铂敏感性的影响.方法:脂质体介导Survivin shRNA转染OVCAR3.转染空载体或脂质体的细胞及未转染细胞作为对照.逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析Survivin蛋白的表达及细胞凋亡率.四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)测定Survivin shRNA转染后OVCAR3细胞对泰素的敏感性.结果:与未转染组、空脂质体组、空载体组相比较,Survivin shRNA处理24 h后细胞Survivin mRNA及蛋白表达水平均明显下调.SurvivinshRNA转染12、24、36、48 h后的细胞凋亡率分别为20.7%、31.9%、39.0%、46.7%,呈时间依赖性.MTT结果显示,泰素对未转染组、空脂质体组、空载体组、转染组OVCAR3细胞的IC50分别为(0.305±0.032)μmol/L、(0.157±0.031)μmol/L、(0.175±0.010)μmol/L、(0.019±0.001)μmol/L;顺铂对4组OVCAR3细胞的IC50依次为(9.410±0.796)μmol/L、(6.675±1.739)μmol/L、(6.930±1.273)μmol/L、(7.862±0.081)μmol/L,Survivin shRNA使OVCAR3对泰素的敏感性提高16倍(P＜0.01),但是对顺铂的影响不大(P＞0.05).结论:靶向Survivin的序列特异性shRNA可有效抑制OVCAR3细胞中Survivin基因的表达,同时可以增强OVCAR3对泰素的敏感性,但不增加其对顺铂的敏感性.
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短发夹RNA沉默hTERT基因对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用
背景与目的:RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象.RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道.但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因,目前尚未见报道.本课题利用RNAi技术,研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)抑制hTERT基因表达对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA.建立人喉癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型.将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况.以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤组织内的表达;以HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变;以原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况;以免疫组化SP法检测hTERT蛋白在肿瘤内的表达;光镜下观察心、肝、肾、脾结构的改变并测量血液学和血液生化指标.结果:pshRNA组(A组)、空质粒载体组(B组)与生理盐水组(C组)之间比较,A组与C组瘤体积有显著性差异(P＜0.01),B组与C组之间瘤体积无显著性差异(P＞0.05),抑瘤率为76.50%.pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光.病理学检查及TUNEL检测发现:A组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂相少见,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡,该组肿瘤细胞的凋亡指数[(26.47±4.25)%]明显高于B组[(3.40±1.41)%]和C组[(2.73±1.35)%].给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调,而且对心、肝、肾、脾无明显损害,对造血系统无影响.结论:表达shRNA的DNA载体质粒沉默hTERT基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长,而且对心、肝、肾、脾及造血系统无明显的毒副作用.
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短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达
目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应.方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上;采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定;将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果.结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板;RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制.结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达.
关键词： 短发夹RNA Survivin基因 神经胶质瘤 -
表皮生长因子受体shRNA对人鼻咽癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响
目的 荷瘤裸鼠瘤内注射RNA干扰(RNAi)表皮生长因子受体(EGFR)基因表达载体shRNA-EGFR,探讨其对肿瘤放射敏感性的影响.方法 用shRNA-EGFR结合脂质体转染人鼻咽癌细胞系CNE1,收集转染后细胞的总RNA和蛋白质,利用RT-PCR和Western blotting检测EGFR表达水平的变化.用CNE1细胞建立裸鼠肿瘤动物模型,荷瘤裸鼠瘤内注射shRNA-EGFR脂质体混合物,观察肿瘤体积变化.经放射治疗后第16天处死裸鼠剥离瘤体称重,评价其对放射敏感性的影响.结果 shRNA-EGFR成功转染CNE1细胞.RT-PCR和Western blotting检测结果 表明shRNA-EGFR可显著下调EGFR mRNA和蛋白质的表达(P<0.05).shRNA-EGFR联合放射治疗组与对照组、单独放射治疗组、shRNA-EGFR治疗组之间的肿瘤体积变化和质量存在显著性差异(P<0.05).结论 shRNA-EGFR基因放射治疗能显著抑制鼻咽癌移植瘤的生长,增加其对放射治疗的敏感性.
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抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建
目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.
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慢病毒介导shRNA抑制垂体腺瘤PTTG基因表达及对细胞增殖和侵袭能力的影响
[目的]观察慢病毒介导的shRNA对GH3和AtT20型垂体腺瘤中垂体肿瘤转化基因(PTTG)表达的抑制作用,以及对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制探讨.[方法]筛选佳抑制效果的干扰序列构建PTTG基因shRNA的慢病毒表达载体,转染GH3和AtT20型垂体腺瘤细胞.流式细胞仪分析细胞转染效率,RT-PCR和Western blot检测细胞PTTG基因mRNA和蛋白的表达水平,MTT和EdU法分别检测靶向PTTG的shRNA对肿瘤细胞增殖生长的抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期变化.Transwell小室检测细胞侵袭能力的变化,基因芯片筛查干扰后的基因表达谱差异并进行生物信息学分析.[结果]细胞转染表达PTTG基因shRNA的慢病毒载体后,能显著抑制肿瘤细胞PTTGmRNA和蛋白的表达,与对照组相比有统计学差异(P＜0.05),细胞的增殖能力受到明显抑制,且增殖抑制效应具有时间依赖性;细胞生长显著变慢,G0/G1期细胞比例显著增高,克隆形成能力下降,细胞侵袭能力也显著减弱,均与对照组相比有统计学差异(P＜0.05).PI3K等信号通路的基因表达也发生显著变化.[结论]慢病毒介导shRNA沉默PTTG基因表达可能是通过对PI3K信号通路的调控,抑制了GH3和AtT20垂体腺瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞的体外增殖和侵袭能力.
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shRNA靶向干预肌萎缩侧索硬化症小鼠模型的长期安全性评价
目的 通过AAV9载体转染将SOD1-shRNA导入骨骼肌等组织,建立长期、有效的小鼠shR-NA序列的RNAi转染模型,动物实验水平验证建模有效率及靶基因抑制率,分析靶基因导入过程中致命性肝毒性机制.方法 构建针对SOD1 shRNA重组AAV9 SOD1-shRNA载体,并通过腹腔内注射法将其导入新生小鼠体内,利用qRT-PCR法检测骨骼肌、心肌、肝脏中不同时间段靶基因抑制效率;通过血清学及病理组织学检测评估毒副作用.结果 经腹腔注射SOD1-shRNA AAV9载体,在骨骼肌、心肌及肝脏中长期、有效地抑制了靶基因mRNA表达,尤其是大腿后群肌中12周后佳抑制效率达32％,同时避免了致命性肝毒性.结论 小鼠shRNA序列的RNAi转染模型的成功建立可以获得靶基因在骨骼肌、心肌、肝脏等组织的长期沉默,并未发现致命性肝毒性,为遗传性疾病的分子机制研究提供了新的途径.
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成纤维细胞Ⅰ型胶原基因shRNA载体的构建及干扰效果
目的 构建有效针对人成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,检测RNA干扰后对病理性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法 设计合成4对针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA靶序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4),将合成的shRNA片段通过重组技术克隆到真核表达载体pmU6,经酶切与测序验证表明成功构建针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4),并将该干扰载体与空载体分别通过脂质体转染人的病理性瘢痕成纤维细胞(依次为Col-shRNA1组、Col-shRNA2组、Col-shRNA3组、Col-shRNA4组、空载体转染组),另选未处理的成纤维细胞作为空白对照组,采用RT-PCR与羟脯氨酸含量测定试剂盒检测该干扰载体的干扰效应.结果 酶切与测序结果表明成功构建了针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体.Ⅰ型胶原基因mRNA的相对表达水平在空白对照组与空载体转染组之间差异无统计学意义(P＞0.05);而干扰组Col-shRNA(1～4)与空载体转染组之间比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).空白对照组与空载体转染组的羟脯氨酸含量及胶原合成差异无统计学意义,干扰组(Col-shRNA1、Col-shRNA2、Col-shRNA3、Col-shRNA4)的羟脯氨酸含量和胶原合成与空载体转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功构建了4组有效针对人Ⅰ型胶原基因的shRNA干扰载体,它们均能明显抑制病理性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达与减少细胞胶原的合成,其中Col-shRNA1对成纤维细胞Ⅰ型胶原基因表达的干扰效果强.
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靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.
