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缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7中的抗凋亡作用
目的 研究缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中对凋亡的作用.方法 氯化钴(COCl2)模拟低氧环境.采用RNA干扰技术.构建针对HIF-1α的shRNA真核表达栽体,转染MCF-7细胞.Real-time PCR和Western-blot技术分别检测HIF-1αmRNA和蛋白质水平.Sub-G1测定,AnnexinV荧光标记和DNA ladder检测细胞凋亡.结果 缺氧后MCF-7细胞HIF-1α的蛋白质水平表达增加,但缺氧后细胞的凋亡率比正常氧水平时低.实时定量PCR和Western blot结果证实转染短发夹RNA后,MCF-7细胞中HIF-1α基因表达被成功抑制.阿糖胞苷诱导或无凋亡诱导剂时,干扰组凋亡率比未转染组明显增高.结论 这项研究证明HIF-1在MCF-7中发挥抗细胞凋亡的作用.为针对HIF-1α的shRNA有效地用于乳腺癌的治疗提供新的思路.
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CTGF shRNA表达质粒对翼状胬肉成纤维细胞的转染条件优化
目的 用CTGF shRNA表达质粒转染翼状胬肉成纤维细胞,筛选质粒与脂质体的佳比例,确定佳转染方案.方法 组织块法培养人眼翼状胬肉成纤维细胞,经细胞免疫组化法(SP法)鉴定,取2~3代细胞,将CTGF shRNA表达质粒与脂质体转染试剂Lipofectamin 2000以不同的比例进行转染,24 h后应用流式细胞仪检测转染效率.测定各组的转染效率,筛选出质粒与脂质体的适比例.结果 质粒与脂质体的转染比例为1∶2.5时,转染效率高,达(56.7±1.5)%.结论 本实验为有效地进行体外胬肉成纤维细胞转染及进一步研究重组质粒CTGF shRNA对翼状胬肉干扰奠定了基础.
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水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用
目的 构建人水甘油通道蛋白9 (AQP9)短发夹RNA (shRNA),筛选出沉默效果明显的重组质粒,检测AQP9的sh.RNA对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的作用.方法 设计合成针对人AQP9的小干扰RNA,退火形成双链shRNA后插入pGenesil-1质粒中,并将其转染L02肝细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot筛选出沉默效果明显的重组质粒.经油酸诱导L02细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型,通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测重组质粒对NAFLD细胞模型的作用.数据比较采用方差分析.结果 经RTPCR及Western blot筛选,pshRNA-AQP9a转染组mRNA及蛋白质相对表达率为25.10％±1.19％及25.41％±1.96％,与未处理L02细胞组的39.33％±1.69％及35.08％±1.89％相比,均明显降低(P值均＜ 0.01);将重组质粒pshRNA-AQP9a转染NAFLD细胞模型能够降低其AQP9的mRNA及蛋白质表达量;油红O染色结果显示,油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内脂质含量明显减少.油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(2.738±0.231) mmol/L、(1.182±0.168)mmol/L和(0.730±0.084) mmol/L,油酸组分别为(3.218±0.220) mmol/L、(1.538±0.193)mmol/L及(1.024±0.148) mmol/L,油酸/pshRNA-AQP9a转染组均明显降低(P值均＜0.05).结论 降低AQP9表达量能够减轻NAFLD细胞模型的脂肪变性程度,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础.
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磷脂酰肌醇蛋白聚糖3转录干预对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用
目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC-3)特异性短发夹RNA (shRNA)对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用与机制.方法 将GPC-3特异性shRNA转染肝癌细胞,检测GPC-3 mRNA及蛋白表达的变化；分析其对细胞增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响.样本均数两两比较采用独立样本t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析.结果 shRNA转染肝癌细胞的效率大于80％,GPC-3 shRNA1转染HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞后,GPC-3 mRNA水平分别为2.13±1.10、4.94±0.59、3.66±0.32,与空白对照组的19.34±0.90、20.24±1.61、13.97±1.15相比,t值分别为21.786、15.473、15.004,P值均＜0.001,差异均有统计学意义,且GPC-3 shRNA1可明显诱导细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖、运动及侵袭能力.HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞干扰组β-连环蛋白mRNA表达分别为6.82±0.21、4.01±0.52和5.47±0.90,与阴性对照组的12.52±0.30、12.03±0.98、12.45±0.26比较,t值分别为26.903、12.578和12.870,P值均＜0.001,差异均有统计学意义;Glil mRNA水平分别为9.78±1.35、10.78±1.15和10.93±0.97,与阴性对照组的6.49±0.72、6.80±0.79、10.03±0.97比较,t值分别为-3.730、-4.918和-3.083,P值均＜0.05,差异均有统计学意义.GPC-3 shRNA1还可下调HepG2和MHCC-97H细胞胰岛素样生长因子Ⅱ和血管内皮生长因子表达.结论 GPC-3shRNA1可下调GPC-3 mRNA水平,通过Wnt/β-连环蛋白和Hedgehogs信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生,提示GPC-3为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标.
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结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1shRNA表达质粒对肝星状细胞细胞因子表达及细胞外基质分泌的影响
目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒分别及共转染肝星状细胞(HSC)对CTGF、TIMP-1、I型前胶原(PCI)mRNA表达及细胞外基质(ECM)分泌的影响. 方法 筛选并成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1有效RNA干扰靶位的shRNA表达质粒,分别及共转染转化生长因子β1刺激活化的大鼠HSC-T6细胞,荧光定量PCR检测各组细胞中CTGF、TIMP-1、PCI mRNA的表达;放射免疫法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)的含量.组间比较采取方差分析;多组间两两比较采用SNK-q检验. 结果 CTGFshRNA转染和双质粒共转染HSC-T6的CTGFmRNA相对表达量分别为0.59±0.03、0.62±0.01,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.00±0.07比较,CTGF mRNA表达量均明显下降,F=66.515,P值均＜0.05,差异有统计学意义;而TIMP-1 shRNA组和双质粒共转染组的TIMP-1 mRNA相对表达量分别为0.66±0.04、0.68±0.03,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.05±0.03比较,TIMP-1 mRNA表达量均明显下降,F=83.835,P值均＜0.05,差异有统计学意义;CTGFshRNA转染、TIMP-1shRNA转染和共转染组的PCI rnRNA相对表达量分别为0.55±0.02、0.57±0.02和0.41±0.01与空白对照组的1比较,PC I mRNA表达量均明显下降,F=709.905,P值均＜0.05,差异有统计学意义;双质粒联合转染对CTGF、TIMP-1、PC I的mRNA表达量抑制作用优于单质粒转染.CTGF shRNA转染、CIGF shRNA转染和双质粒共转染组的PCⅢ含量分别为(78.02±6.50) ng/ml、(79.03±5.47) ng/ml、(53.91±4.01)ng/ml,与空白对照组的(113.79±15.88)比较,PCⅢ含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义; CTGF shRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的HA含量分别为(127.36±8.33)ng/ml、(116.55±3.37) ng/ml、(82.84±9.03) ng/ml,与空白对照组的(163.10±7.01)ng/ml比较,HA含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义CTGFshRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的LN含量分别为(55.41±9.37)ng/ml、(49.77±6.70) ng/ml、(30.72±1.22) ng/ml,与空白对照组的(83.99±4.67) ng/ml比较,LN含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义.CTGF shRNA与TIMP-1 shRNA双质粒联合转染对PCⅢ、HA、HA分泌的抑制作用优于单质粒转染.结论 CTGF shRNA.TIMP-1 shRNA可明显抑制HSC的CTGF、TIMP-1、PCI基因表达及ECM的分泌,且shRNA联合干扰效果更显著,有望成为抗肝纤维化基因治疗的有效方法.
关键词： 肝硬化 转染 短发夹RNA 基质金属蛋白酶组织抑制因子-1 结缔组织生长因子 -
慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力
目的:探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1 (phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1)基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响.方法:设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证.转染293T细胞,Western blot筛选佳干扰序列,包装产生慢病毒.转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞(KD组)、空病毒转染细胞(NC组)及TCA8113细胞(CON组)迁移、侵袭能力变化.结果:PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中.Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率高,包装获得慢病毒滴度为7×108 TU/ml.通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降(F=809.120,P=0.000);PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组(25.5±0.4)明显少于NC组(81.5±2.0)和CON组(88.5±2.3)(F=1 092.970,P=0.000).结论:沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力.
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TGF-β1基因特异性shRNA真核表达载体的构建及其基因抑制作用
目的:构建针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体并评价其在人脐静脉内皮细胞株中对TGF-β1基因的抑制作用,筛选出高效的表达载体以用于后续的RNAi研究.方法:利用生物信息学方法设汁shRNA,在人TGF-β1基因的mRNA序列中选择靶序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核件酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒.构建2个表达载体PCenesil-TGF-β1-1(pT11)和PGenesil-TGF-β1-2(pT12),酶切及测序证实后转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中,错构载体(pHK)为阴性对照.转染后采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TGF-β1mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TGF-β1蛋白质的表达.结果:酶切及测序证实表达载体pT11、pT12构建成功,两个表达载体的转染率为38.2%和40.1%,两个表达载体对人脐静脉内皮细胞株TGF-β1基因的转录抑制率为58.1%和60.0%,蛋白表达抑制率为38.9%和44.3%.结论:成功构建的针对人TGF-β1基因的shRNA表达载体对脐静脉内皮细胞株FGF-β1基因的转求有明显的抑制作用,并以表达载体pT12的效果为优,为后续移植肾肾病基因治疗的研究奠定了基础.
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shRNA干扰沉默Mcl-1基因对淋巴瘤细胞系增殖的影响
目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.
关键词： 淋巴瘤 髓细胞白m病基因-1 短发夹RNA 凋亡 慢病毒载体 -
Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响
目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.
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沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞生长及其趋化效应的影响
目的 构建大鼠趋化因子CX3C的配体1(chemokine CX3C ligand 1,CX3CL1)基因慢病毒RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,观测其沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,bMSCs)生长及其趋化效应的影响.方法 首先分离、培养大鼠骨髓bMSCs,并予以流式细胞术检测鉴定.针对CX3CL1基因mRNA序列,筛选3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点并予以合成.把合成的siRNA导入bMSCs,Western blot检测其对靶基因编码蛋白的抑制效应,以此明确佳siRNA.设计与合成针对佳siRNA序列的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA),连入CD513B-1慢病毒载体,构建CD513B-1/CX3CL1 shRNA慢病毒,并行测序鉴定.测序正确者用293T细胞包装成具有高效感染力的CD513B-1/CX3CL1 shRNA重组慢病毒,该重组病毒用于感染bMSCs.分离培养大鼠脾巨噬细胞,将其与被感染的bMSCs共培养.倒置显微镜下观测被感染bMSCs的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;CCK-8检测被感染bMSCs的生长变化;Real-time PCR检测被感染bMSCs的CX3CL1与核抗原PCNA基因的表达变化;Western blot检测被感染bMSCs的CX3CL1和PCNA蛋白,与被感染的bMSCs共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF和IL-8的表达变化.结果 大鼠bMSCs得以分离、培养和鉴定.筛检得CX3CL1基因的佳干扰序列:CTCTATGAGCAArTTATTTA;测序证实,成功构建重组慢病毒载体CD513B-1/CX3CL1 shRNA.荧光观察表明,被CD513B-1/CX3CL1shRNA病毒感染的bMSCs明显表达GFP.CCK-8检测结果显示,与对照细胞比较,沉默CX3CL1的bMSCs的生长减慢,48 h开始更为明显(P＜0.01);Real-time PCR、Western blot检测结果证实,CX3 CL1基因的shRNA慢病毒能有效沉默bMSCs的CX3CL1,并下调其核抗原基因PCNA及其蛋白的表达,沉默CX3 CL1的bMSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达.结论 成功构建CX3 CL1基因RNAi重组慢病毒载体.该病毒载体能有效沉默bMSCs的CX3CL1基因,使bMSCs的生长减慢并下调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达.沉默CX3 CL1的bMSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达.
关键词： 趋化因子CX3C的配体1基因 短发夹RNA 骨髓间充质干细胞 慢病毒 趋化效应 -
靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定
目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.
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甲酰肽受体shRNA稳定转染U87细胞系的构建
目的 构建靶向甲酰肽受体(FPR)基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定转染的U87细胞系.方法 设计并合成FPR基因特异性的shRNA序列,构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体,通过脂质体转染293T细胞包装成FPR慢病毒颗粒,感染U87细胞.荧光显微镜观察转染效果,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测FPR干扰效率.结果 成功构建FPR基因shRNA慢病毒表达载体.稳定转染U87细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白.实时荧光定量PCR及Western blot证实PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体具有良好的干扰效果.结论 成功构建FPR shRNA稳定转染的U87细胞系.
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PLCε特异性shRNA对人膀胱癌生物学行为的影响
目的 探讨人源磷脂酶Cε(PLCε)特异性短发夹RNA(shRNA)对人膀胱癌增殖、凋亡、侵袭、转移能力的影响.方法 用携带PLCε shRNA基因的真核表达质粒pGenesil- PLCε转染BIU-87细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞PLCε mRNA和蛋白的变化.分别用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、流式细胞术和免疫组化检测BIU-87细胞及裸鼠移植瘤增殖情况和细胞周期的变化;采用RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax mRNA的变化;采用Transwell小室体外侵袭法及明胶酶谱分析细胞的侵袭能力.结果 转染pGenesil-PLCε质粒的细胞可明显抑制PLCε基因和蛋白表达水平(P<0.05);MTT、流式细胞术与免疫组化检测结果表明转染pGenesil- PLCε质粒的细胞生长明显受抑制(P<0.05),且细胞周期阻滞于G0/G1期;转染pGenesil- PLCε质粒的细胞 Bcl-2/Bax mRNA明显降低(P<0.05);明胶酶谱及侵袭实验显示转染pGenesil- PLCε质粒的细胞侵袭、转移能力明显下降(P<0.05).结论 特异性shRNA干扰PLCε基因可抑制膀胱癌的生长,其作用机制可能与抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡及抑制侵袭转移有关,PLCε为膀胱癌基因治疗的潜在靶点.
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IRF3shRNA腺病毒包装及其对RAW264.7细胞IRF3表达的抑制效应
目的 重组并包装干扰素调节因子3(interferon regulator factor 3,IRF3)短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)腺病毒,研究该病毒对RAW264.7细胞IRF3基因表达及对细胞增殖活性和吞噬功能的影响.方法 采用酶切和连接方法构建pAdeno-U6-CMV-EGFP-IRF3 shRNA质粒;借助AdMaxTM病毒包装系统完成IRF3基因干扰腺病毒的重组与包装;IRF3基因表达分别采用real-time PCR和Western blot分析方法检测;RAW264.7细胞的增殖活性和吞噬功能分别采用CCK8分析和吞墨试验检测.结果 IRF3基因的干扰片段及对照序列被正确插入pAdeno-U6-CMV-EGFP质粒Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,经PCR扩增及DNA测序证实;RAW264.7细胞组成性表达IRF3基因,针对IRF3基因后部序列的干扰腺病毒Y2147明显抑制了IRF3 mRNA和蛋白质的表达,而针对IRF3基因前部及中部序列及对照序的干扰腺病毒对IRF3的表达无明显沉默或封闭效应;腺病毒Y2147对RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬功能无明显不良影响.结论 成功构建并包装了IRF3shRNA腺病毒,该病毒能有效抑制RAW264.7细胞IRF3 mRNA和蛋白表达,且对细胞的增殖活性和吞噬能力无不良影响.
关键词： 干扰素调节因子3 短发夹RNA 腺病毒 病毒包装 RAW264.7细胞 -
CCL20基因短发夹RNA表达载体转染人胚胎肾细胞的干扰效应
目的 观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293FT细胞),以及对其表达CCL20mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用.方法 用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和pSCS-EGFP-3均为CCL20基因特异型)转染到293FT细胞,24 h后分别用荧光显微镜照相和流式细胞仪检测293FT细胞的转染率.将未转染及分别转染3种质粒的293FT细胞培养48h,用TNF-α和IL-1β刺激培养24 h后,分别用荧光定量RT-PCR和ELISA法检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,计算其抑制率.结果 3种质粒(pSCS-EG-FP-1～3)转染293FT细胞的效率分别为(73.8±5.3)%、(50.0±4.8)%、(56.8±2.9)%.加细胞因子刺激下,3种载体对293FT细胞表达CCL20mRNA相应的抑制率分别为(18.53±34.44)%、(90.40±3.94)%和(92.50±6.15)%;上清中CCL20蛋白相应的抑制率分别为(14.88±17.39)%、(71.76±8.27)%和(88.56±1.74)%.未加细胞因子刺激下,CCL20 mRNA的相应抑制率分别为(61.37±11.72)%、(84.33±12.78)%和(80.27±15.84)%;CCL20蛋白的相应抑制率分别为(19.91±48.12)%、(-27.87±50.24)%和(87.21±8.36)%.结论 特异性CCL20shRNA表达载体能明显下调细胞因子刺激人胚胎肾细胞表达CCL20 mRNA及蛋白,该载体为研究肾移植排斥反应等CCL20相关性肾脏疾病的治疗提供了一定的实验基础.
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泛素特异性蛋白酶39对人结直肠癌细胞增殖的调控研究
目的 观察结直肠癌组织中泛素特异性蛋白酶39 (USP39)蛋白的表达情况,以及USP39基因敲低对结直肠癌细胞系SW1116和HCT116细胞生长和细胞周期的影响.方法 ①采用免疫组织化学染色方法检测USP39蛋白在结直肠癌组织中的表达情况.②选取结直肠癌SW1116和HCT116细胞系作为研究对象,将细胞分为4组(每组5个复孔):KD-1组和KD-2组,采用慢病毒短发夹RNA (shRNA)敲低肿瘤细胞中USP39基因的表达;shCon组细胞感染阴性对照慢病毒,Con组细胞未接受任何处理.采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞的增殖能力,采用流式细胞仪检测细胞的周期分布.结果 ①免疫组织化学染色结果显示,USP39蛋白在结直肠癌组织中的高表达率高于癌旁组织(P=0.007).②不管是在SW1116细胞还是在HCT116细胞中,第3、4及5天时,KD-1组和KD-2组细胞的增殖能力均明显低于shCon组和Con组(P＜0.05).③不管是在SW1116细胞还是在HCT116细胞的KD-1组中,G0/G1期细胞百分比均较Con组和shCon组降低(P＜0.05),G2/M期细胞的百分比和亚G1期细胞数均增加(P＜0.05).结论 USP39蛋白高表达于结直肠癌组织中.结直肠癌细胞系中敲低USP39基因的表达可抑制肿瘤细胞的增殖形成能力,促进肿瘤细胞早期发生凋亡.
关键词： 结直肠癌 泛素特异性蛋白酶39 短发夹RNA 细胞凋亡 靶向治疗 -
STAT3基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胃癌细胞生长和侵袭的抑制作用
目的 构建信号传导及转录活化因子3(STAT 3)基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,探讨STAT 3抑制后对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法 根据STAT 3 Mrna 编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT 3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT 3),使用脂质体转染MKN-45细胞,实验分为对照组、psiRNA-H1转染组和psiRNA-H1/STAT 3转染组.通过RT-PCR和Western blot检测STAT 3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达的影响; MTT比色法检测细胞的生长抑制率; 采用流式细胞术检测转染后对MKN-45细胞凋亡的影响; 采用Boyden小室侵袭实验检测转染后MKN-45细胞侵袭力的变化.结果 成功转染重组体的MKN-45细胞中STAT 3 Mrna和蛋白表达明显下降(P＜0.05).psiRNA-H1/STAT 3转染组各时相均明显抑制MKN-45细胞生长,且MKN-45细胞凋亡率为34.26%,相比对照组(3.75%)和psiRNA-H1转染组(4.43%)明显升高(P＜0.01).另外,psiRNA-H1/STAT 3转染组MKN-45细胞侵袭力较另外2组明显减弱(P＜0.01).结论 成功构建了针对STAT 3基因的shRNA表达载体,通过转染MKN-45细胞,在体外能有效抑制人胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达,细胞增殖、侵袭能力减弱并且促进细胞凋亡,为STAT 3基因靶向治疗提供一定的实验依据.
关键词： 信号传导及转录活化因子3 短发夹RNA 胃癌 表达载体 -
沉默c-myc重组腺病毒载体的构建
目的 设计、构建并筛选出转染至人骨肉瘤细胞系OS-9901,对c-myc沉默效果佳的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd-c-myc-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包装出表达c-myc-shRNA的重组腺病毒,并测定其滴度.方法 设计有shRNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligos),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligos),插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后,经LipofectamineTM2000阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,采用RTPCR筛选对c-myc沉默效果佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子.采用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒,观察其细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用病毒颗粒法(viral particles,VP)和50%组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定病毒滴度.结果 电泳验证后的ds oligos插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.从3对ds oligos通过RT-PCR方法筛选出对c-myc沉默效果佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒,CPE和空泡现象3 d开始出现,6 d更加明显.采用VP法测定的第1代腺病毒滴度为5.23×109VP/mL,经3～4代扩增后可达2.26×1012 VP/mL.TCID50证实病毒滴度为10-3.8/0.1 mL.结论 通过RNA干扰技术,体外成功构建了介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.
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Survivin shRNA重组慢病毒构建及对A549细胞增殖的影响
背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点.本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响.方法 设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒；将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Western blot检测干扰效果；MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响.结果 本研究成功构建了重组质粒；重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达；细胞受阻于G2/M期.结论 本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础.
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NogoB-shRNA表达质粒的构建及其在大鼠原代肝星状细胞收缩中的作用
目的 构建针对大鼠NogoB基因的shRNA表达质粒,并初步探究其在大鼠肝星状细胞(HSCs)收缩功能中的作用.方法 设计并合成针对大鼠NogoB基因3个不同位点的shRNA,通过DNA重组技术,将shRNA插入pSuper质粒中,构建NogoB-shRNA重组质粒,转染至大鼠原代肝星状细胞(HSCs)中,并通过Realtime PCR技术检测基因的相对表达量,筛选出能沉默大鼠NogoB基因的重组质粒,再通过Western blot加以验证,同时观察NogoB基因被抑制后,HSCs中内皮素1(Endothelin-1,ET-1)受体A、受体B(ETA、ETB)表达水平的变化.结果 构建的3对重组质粒中,NogoB-shRNA2对NogoB的基因的表达具有明显的抑制作用.NogoB基因被抑制后,大鼠HSCs中ETA的表达无明显变化,ETB的表达升高,ETA/ETB的水平降低.结论 成功构建了有效、特异的抑制大鼠NogoB基因表达的shRNA表达质粒,并初步观察到NogoB在肝星状细胞的收缩中可能有一定作用.
