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慢病毒介导的shRNA干扰大鼠施万细胞RSC96 MYH14基因的表达
目的 应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14(MYH14)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 根据MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列,连接入经AgeⅠ和BamHⅠ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中,菌液经PCR鉴定并测序验证.取测序正确的菌液提取质粒转染大鼠施万细胞RSC96,利用免疫荧光法观察转染效率,蛋白质印迹法筛选有效敲低MYH14的shRNA质粒,CCK-8法检测转染后RSC96细胞的活力.结果 合成3对MYH14-shRNA序列并将其克隆到GV298载体中,构建了重组质粒MYH14-shRNA1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序筛选出测序正确的载体MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2.免疫荧光检测结果显示转染72 h时RSC96细胞荧光表达强;蛋白质印迹法检测结果显示,与阴性对照(scramble序列)组相比,MYH14-shRNA2转染后RSC96细胞中MYH14蛋白的表达水平降低(0.57±0.15 vs 1.11±0.06,P<0.01),而MYH14-shRNA1转染后MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05).MYH14-shRNA2转染RSC96细胞24 h后的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义(1.09±0.16 vs 1.00±0.15,P>0.05).结论 成功构建大鼠MYH14基因重组慢病毒干扰载体,该载体能有效下调RSC96细胞中MYH14的表达.
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EMMPRIN短发夹RNA对SGC-7901细胞侵袭与迁移的影响
目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)短发夹RNA(shRNA),研究其对人胃癌细胞SGC-7901侵袭与迁移的影响.方法 体外设计合成针对人EMMPRIN的4组小干扰RNA (siRNA),退火形成双链shRNA,并插入pGenesil-1质粒中.经测序鉴定及RT-PCR和Western blotting筛选出沉默效果明显的干扰质粒,通过脂质体Lipofectamine 2000转染SGC-7901细胞,Transewell法检测重组干扰质粒对SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响.结果 成功构建并筛选出pshRNA-EMMPRIN干扰质粒.重组干扰质粒转染SGC-7901细胞后,细胞EMMPRIN mRNA和蛋白表达显著降低.Transewell法检测发现,在转染重组干扰质粒的SGC-7901细胞中,侵袭细胞和迁移细胞的个数明显减少.结论 下调EMMPRIN表达能够显著减弱肿瘤的侵袭和迁移能力,为进一步研究EMMPRIN对消化道肿瘤的基因治疗奠定了基础.
关键词： 细胞外金属蛋白酶诱导因子 短发夹RNA SGC-7901 侵袭 迁移 -
ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选
目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.
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腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响
目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性. 方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平. 结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1 106.3±10.8、1 121.3±10.2、1 058.5±12.1和空白对照组的1 076.6±9.7、1 133.4±11.2、1 104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05). 结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平.
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特异性shRNA干扰人慢病毒载体抑制U251细胞株Chk1、Chk2基因的表达
目的 构建针对细胞周期检测点激酶1和2(Chk1和Chk2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,包装成慢病毒,建立稳定转染的细胞株,为探讨抑制Chk1和Chk2基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础.方法 根据GenBank数据库提供的Chk1和Chk2基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,命名为Chk1 - shRNA和Chk2-shRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为blank-shRNA.并与pLKO.1-TRC质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Nco Ⅰ酶切电泳,DNA测序鉴定,包装慢病毒.3组重组表达慢病毒载体转染胶质瘤细胞系U251,用嘌呤霉素筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株.逆转录酶-聚合酶连反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测Chk1和Chk2的表达.结果 重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确.嘌呤霉素对U251细胞的筛选浓度为4ug/ml,筛选出稳定转染三种质粒的U251细胞,Chk1-shRNA和Chk2-shRNA组细胞各自Chk1和Chk2的mRNA和蛋白表达水平明显低于blank-shRNA组.结论 成功构建了针对Chk1和Chk2基因的shRNA慢病毒表达载体,转染后可抑制Chk1和Chk2基因的表达,为进一步研究Chk1和Chk2基因在脑胶质瘤细胞中的作用奠定了基础.
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PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响
目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)分化的影响.方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰PGC-1α编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1.将构建正确的PLKO.1/PGC-1α-shRNA感染DSPC,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的表达,细胞化学染色和实时荧光定量PCR检测其对DPSC分化的影响.结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,DPSC转染了PGC-1α-shRNA后PGC-1α表达水平降低,干扰效率达81%,而且细胞钙化结节增多,牙本质涎磷蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显上调,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).结论:慢病毒介导的PGC-1α-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响牙髓干细胞的分化.
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雌激素受体α-shRNA慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙/成骨向分化的影响
目的 构建雌激素受体α(estrogen receptor α,ERα)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,探讨其对根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)体外成牙/成骨向分化的影响.方法 根据shRNA设计原则,合成用于体内干扰ERα的两条shRNA序列,重组入慢病毒载体PLKO.1.将PLKO.1对照组与ERα-shRNA(shERα-1和shERα-2)实验组分别感染SCAPs,western blot检测ERα的表达及其对SCAPs成牙/成骨向分化的影响.结果 测序结果证实重组质粒构建成功;体外实验表明,SCAPs转染ERα-shRNA后ERα蛋白表达水平降低,其中shERα-2组对ERα的下调作用更明显,两组ERα-shRNA中核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达均有不同程度下调,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).结论 慢病毒介导的ERα-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并显著影响了根尖牙乳头干细胞的成牙/成骨向分化.
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靶向EphB4基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建和鉴定靶向EphB4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体.方法 体外合成一对互补并编码靶向EphB4基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经Bbs Ⅰ酶切线性化的psiRNA人H1启动子质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用脂质体转染的方法将构建的重组载体导入人恶性胶质瘤细胞系U251中,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞EphB4mRNA的表达变化.结果 经酶切和测序证明,pH1-EphB4-shRNA序列正确;转染pH1-EphB4-shRNA载体后,U251细胞EphB4基因的电泳条带明显减弱,在磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)参比下较空载体组下降60%.结论 靶向EphB4基因的shRNA真核表达载体构建成功,转染U251细胞之后获得稳定表达,并可特异性沉默EphB4基因的表达,为进一步研究EphB4基因在恶性胶质瘤的发生发展中的作用提供了实验基础.
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抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建
目的构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体.方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游,获得重组pSUPER-H1质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定.结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,表明序列完全一致.结论重组pSUPER-H1载体的成功构建,为进一步研究神经生长因子活性打下基础,同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法.
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荷载管家基因shRNA的双调控溶瘤腺病毒抑制肾癌细胞增殖的研究
目的 研究荷载管家基因GAPDH shRNA的溶瘤腺病毒(TD-GAPDH)对人肾癌细胞OSRC增殖抑制的作用.方法 病毒TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP感染OSRC细胞、人肾小管上皮细胞HK-2.Western blot法检测E1A表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法分别检测GAPDH的mRNA、蛋白的表达;原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;MTT法检测细胞增殖;结晶紫染色法检测细胞毒作用.结果 TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP感染的OSRC细胞均表达E1A,HK-2细胞均不表达;抑制OSRC细胞GAPDH表达作用依次为TD-GAPDH>TD55>ZD55-EGFP.TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP感染OSRC细胞的凋亡率(%)依次为(48.0±3.17)、(32.3±6.68)、(23.6±5.43),各组之间差异均有统计学意义(P<0.05);用10MOI TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP感染OSRC细胞,4天后存活率(%)依次为:(26.1±2.98)、(47.2±3.10)、(61.2±2.52)、PBS(100),各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);病毒对OSRC细胞的毒性作用依次为TD-GAPDH>TD55>ZD55-EGFP.结论 TD-GAPDH能在肾癌OSRC细胞复制,具有显著的抑制肾癌OSRC细胞GAPDH基因表达、诱导凋亡、杀伤肾癌细胞作用.为溶瘤腺病毒进一步荷载癌基因的shRNA奠定基础.
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RNA干扰抑制RPA70基因质粒载体的构建与鉴定
目的 构建含复制蛋白A 70(RPA70)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,诱导RNA干扰(RNA interference,RNAi).方法 根据GenBank中RPA70基因的mRNA序列,设计、合成2条反向重复多聚寡核苷酸序列,退火形成双链DNA.利用分子克隆技术,将含RPA70基因的双链DNA与经双酶切后的载体pSi-U6-GFP-Neo连接,构建pSi-U6-GFP-Neo-shRNA-RPA70重组质粒,通过DNA测序证实表达质粒构建成功.设空白对照组、阴性对照组及实验组,在脂质体2000的介导下转染食管癌TE-1细胞株,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况.结果 DNA测序证实含RPA70基因的shRNA表达质粒构建成功.结论 成功地构建了重组质粒pSi-U6-GFP-Neo-shRNA-RPA70,为下一步干扰实验奠定了基础.
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特异性siRNA的筛选及CTGF-shRNA质粒的构建
目的 构建结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor,CTGF) 短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA) 重组质粒,研究其在人皮肤瘢痕成纤维细胞中对CTGF基因表达的沉默效果,为探讨病理性瘢痕的基因治疗奠定基础.方法 设计针对人CTGF基因特异性的3条siRNA oligo,通RT-PCR及Western blot检测其在瘢痕成纤维细胞中的干扰效果,从中筛选出一条佳片段.根据所筛选出的佳片段序列设计并构建CTGF-shRNA质粒,通过单酶切和测序鉴定该质粒.结果 3条siRNA oligo中C3序列干扰效果佳.酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功.结论 成功构建CTGF-shRNA 质粒,为进一步探索CTGF对人皮肤病理性瘢痕形成的作用奠定了基础.
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人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定
目的构建端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体.方法化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6 shRNA表达载体的U6 RNA 聚合酶Ⅲ(Pol Ⅲ)启动子的下游,构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT.结果经酶切电泳及测序分析证实,目的序列成功插入到预计位点.结论已成功构建pSliencer-hTERT载体,为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础.
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S100P 基因 shRN A 慢病毒载体构建与RN A 干扰效率鉴定
目的 构建S100P基因短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体 ,并在胃癌细胞中鉴定其沉默效率.方法 设计S100P基因特异性的RNA干扰序列 ,构建shRNA慢病毒载体 ,与S100P过表达质粒共转染293T细胞.随后筛选有效的shRNA慢病毒载体 ,与pHelper 1 .0和pHelper 2 .0质粒共转染293T细胞 ,包装病毒 ,感染胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901.采用RT-PCR和Western blot检测S100P基因的敲减效率.结果 成功构建S100P基因的shRNA慢病毒载体 ,MGC-803和SGC-7901细胞中S100P基因的mRNA和蛋白表达均降低(P<0 .05).结论 成功构建的S100P基因shRNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.
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抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建
目的构建抑制血管内皮生长因子(VEGF)活性的小干扰RNA表达载体.方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游,获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定.结果重组质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致.结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法.
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慢病毒载体构建稳定的maspin表达敲减食管癌细胞株
目的 前期研究表明maspin在食管癌组织中表达下调.文中利用慢病毒载体介导短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)感染食管癌细胞株,诱导maspin基因沉默,构建稳定的maspin表达敲减细胞株.方法 合成maspin特异shRNA序列(shMas1和shMas2),构建shMas1和shMas2慢病毒表达载体;利用293FT细胞包装病毒后,感染食管癌细胞株HKESC-2;经嘌呤霉素筛选获得稳定感染细胞株.定量PCR和免疫印迹法检测干扰效果.结果 成功构建shMaspin的慢病毒表达载体;与野生型HKESC-2细胞比较,获得的稳定maspin表达敲减细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2生长特性无明显变化,其maspin mRNA及蛋白质表达水平均明显降低,maspin mRNA敲减效率分别为37.8%及58.2%,maspin蛋白质表达的相对抑制率分别为49%和53%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了稳定的maspin表达敲减的食管癌细胞株shMas1/HK2和shMas2/HK2.
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靶向大鼠Caveolin-1基因的短发夹RNA表达载体的构建
目的 构建靶向大鼠caveolin-1基因的shRNA表达载体.方法 化学合成靶向caveolin-1的单核苷酸链,经退火成双链.将退火得到的双链DNA克隆至表达载体pLL3.7中得到重组质粒,经限制性内切酶酶切、DNA测序进行鉴定.结果 通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实,成功构建大鼠pLL3.7-cav-1表达载体.结论 成功构建了靶向大鼠caveolin-1的shRNA表达载体,为以后进行caveolin-1与ALI/ARDS的相关研究奠定了基础.
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胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因ShRNA质粒表达载体的构建
目的:构建针对胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体.方法:以Survivin基因为靶点,通过自行设计并构建包含两段短发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA),携带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)基因和Neo基因的pGenesil-1 Survivin shRNA载体,利用脂质体介导的方法转染人胰腺癌Bx-PC3细胞,RT-PCR观察其对Bx-PC3细胞Survivin基因表达的影响.结果:HE1质粒和HE2质粒的酶切鉴定正确,质粒转化菌液HE1、HE2进行测序分析均为插入正确的克隆质粒.胰腺癌Bx-PC3细胞转染成功,转染细胞后Survivin mRNA的表达有明显抑制.结论:实验构建针对胰腺癌细胞Survivin 基因2条shRNA的质粒表达载体成功.
关键词： Survivin基因 RNA干扰 短发夹RNA 胰腺癌细胞 -
PPARγ基因靶向shRNA真核表达载体的构建及表达
目的 研究短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)真核表达载体在人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVECs)中对人过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达的抑制作用.方法 设计3条靶向PPARγ的shRNA,经退火成互补双链,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中构建重组载体,经酶切鉴定和测序确认后,将3个重组表达载体转染到HUVECs,利用Western blot检测并筛选出抑制效果好的重组表达载体.结果 通过酶切鉴定和测序分析,靶向PPARγ的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体构建成功,Western blot结果显示pGPU6/GFP/NeoshRNAPPARγ3可有效抑制高糖诱导HUVECs中PPARγ基因的表达,抑制率为63.2%.结论 PPARγ基因靶向shRNA真核表达载体构建成功,且能有效抑制HUVECs中PPARγ基因的表达.
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RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
目的:研究shRNA降低p62基因表达对人宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响.方法:构建具有沉默p62表达的慢病毒载体短发夹RNA(shRNA)序列,采用Polybrene将其转染入宫颈腺癌HeLa细胞中(shRNA组),设立shNC作为阴性对照组,另设未加慢病毒转染载体的空白对照组.采用实时荧光定量qRT-PCR技术检测各组相对空白对照组的p62基因相对表达量;采用CCK-8实验检测3组细胞的增殖情况,采用集落克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成率.结果:沉默p62基因表达的宫颈癌HeLa细胞成功构建;shRNA组p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为(0.18 ± 0.08),而shNC组的p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为(1.01 ± 0.12)(t=9.97,P<0.01);shRNA的干扰效率为81.00%;shRNA组较阴性对照组和空白对照组细胞增殖速度变慢(P<0.05),克隆形成率减少(P<0.01).结论:p62基因沉默后,宫颈癌HeLa细胞的增殖速度变慢.p62基因在宫颈癌HeLa细胞的增殖中起着重要的作用.
