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靶向沉默转化生长因子β1表达的短发夹 RNA的筛选
目的：筛选可靶向沉默转化生长因子β1（TGF－β1）表达的短发夹RNA（shRNA）。方法：设计和制备靶向沉默TGF－β1的5条shRNA，并构建靶向沉默TGF－β1的p－Genesil－shRNA真核表达重组质粒及含无关shRNA的 p－Genesil－1－shRNA－vect对照质粒，酶切和测序方法进行鉴定。通过脂质体介导分别将p－Genesil－1－shRNA－vect质粒和各重组表达质粒转染入高糖或AngⅡ环境激活的HKC细胞（分别命名为p－Genesil－1－vect细胞及p－Genesil－shRNA 1～5细胞），Western blot方法检测沉默TGF－β1表达的效果。结果：酶切和测序结果显示，5种重组质粒均可切出与预计相符的目的片段，所有shRNA编码序列与设计一致。与HKC细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的HKC细胞和p－Genesil－1－vect细胞中TGF－β1表达均增高（F＝74．188，P＜0．001），而后二者之间TGF－β1表达差异无统计学意义（P＞0．05）。与高糖或AngⅡ刺激的p－Genesil－1－vect细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的各组p－Genesil－shRNA细胞中TGF－β1表达均降低（F＝139．695，P＜0．001）。结论：筛选出1条可靶向沉默TGF－β1表达的shRNA。
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Ku70基因RNA干扰载体的构建及干扰效果鉴定
目的 构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定.方法 设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系.在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量.把RNAi效果显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSilencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果.结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降.在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制.结论 成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础.
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siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性
目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.
关键词： 小干扰RNA 短发夹RNA Synaptotagmin基因 序列设计 基因沉默 -
短发卡RNA介导的缺氧诱导因子-1α基因沉默对缺氧状态下骨肉瘤细胞增殖的影响
目的 观察缺氧环境对原代骨肉瘤细胞增殖的影响,以及用短发卡RNA (shRNA)沉默缺氧诱导因子(HIF)-1α基因后,缺氧状态下原代骨肉瘤细胞增殖的变化.方法 将原代骨肉瘤细胞分别置于缺氧环境(37℃、1％ O2、5％ CO2)或常氧环境(37℃、21％O2、5％ CO2)下培养,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化,Western blot检测HIF-1 α蛋白表达水平.其次,将HIF-1α基因及阴性对照基因(SCR)对应的shRNA由慢病毒载体介导转染原代骨肉瘤细胞,分别记为HIF-1 α/shRNA组和SCR/shRNA组,定量聚合酶链反应(qPCR)定量分析HIF-1αmRNA变化,Western blot检测转染后细胞HIF-1 α蛋白表达变化.后,转染后的细胞再次缺氧培养,采用MTT法检测细胞增殖.结果 细胞实验显示,缺氧环境可在一定时间(24 h)内抑制原代骨肉瘤细胞增殖,但随着缺氧时间延长抑制作用减弱,与常氧组比较,缺氧细胞12 h细胞增殖率减少30.5％,24 h减少25.0％.同时HIF-1α表达升高,表明肿瘤细胞增殖与HIF-1α之间明显相关.转染shRNA后,与空白对照组及SCR/shRNA组比较,HIF-1 α/shRNA组的HIF-1α mRNA相对表达量明显降低(P =0.000),HIF-1α蛋白表达下降(P=0.000),缺氧培养的细胞增殖受到抑制.结论 shRNA介导的HIF-1 α基因沉默可以有效逆转缺氧环境中HIF-1 α对骨肉瘤细胞增殖的促进作用,从而可能干预肿瘤发育和生长的进程.
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短发夹RNA干扰技术沉默趋化因子受体7基因表达对结肠癌LoVo细胞侵袭、转移能力的影响
目的 通过对趋化因子受体7(CXCR7)的基因干扰,观察其对人结肠癌细胞株LoVo的侵袭、转移能力的影响.方法 将靶向CXCR7基因的携带短发夹RNA(shRNA)表达的质粒转入LoVo细胞株,以体外侵袭实验观察LoVo细胞侵袭能力的改变;将36只裸鼠分成3组,行种植成瘤肝转移实验观察LoVo细胞转移能力的改变.结果 体外实验结果显示CXCR7-shRNA干扰组LoVo细胞穿膜数[(51.70 ±6.89)个]较空白对照组[(94.30±7.40)个]减少(P＜0.05);动物实验结果显示3组裸鼠的中位生存时间分别为:CXCR7-shRNA干扰组52 d、空白对照组30 d、阴性对照组32 d.CXCR7-shRNA干扰组较空白对照组生存率明显提高(P＜0.05),肝脏表面的转移瘤结节数较空白对照组明显减少(P＞0.05).空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 shRNA干扰技术沉默CXCR7的表达能抑制人结肠癌细胞LoVo的侵袭和转移能力.
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短发夹RNA稳定沉默Y盒结合蛋白-1基因的人肺腺癌A549细胞株的建立及增殖能力研究
目的 构建稳定沉默Y盒结合蛋白1(YB-1)基因的人肺腺癌A549细胞株并观察其增殖能力.方法 以脂质体将两种沉默YB-1基因的shRNA真核表达载体转染人肺腺癌细胞株A549,G418筛选稳定转染细胞株.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Westem blot法检测YB-1基因表达;噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线.结果 稳定转染细胞株稳定表达绿色荧光蛋白(GFP);RT-PCR、FQ-PCR和Western blot法检测结果显示稳定转染组细胞株A549-746与A549-326 YB-1 mRNA和蛋白表达(0.41±0.01与0.39±0.06、0.43±0.10与0.20±0.24、0.49 ±0.06与0.24±0.02)较对照组明显下降(P＜0.05);噻唑蓝(MTT)检测稳定转染组较对照组生长速度降低(P＜0.05).结论 成功建立稳定表达GFP,并稳定沉默YB-1基因的人肺腺癌细胞株A549-746和A549-326,沉默YB-1可抑制A549细胞增殖能力.
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短发夹RNA抑制高迁移率蛋白A2基因表达后对垂体生长激素腺瘤细胞生物学行为的影响
目的 观察RNA干涉后高迁移率蛋白A2(HMGA2)在垂体生长激素(GH)腺瘤细胞中表达的变化,探讨HMGA2基因表达的抑制对GH腺瘤细胞增殖、凋亡和侵袭性的影响.方法 构建针对人HMGA2基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,瞬时转染GH腺瘤细胞.用Western blot法观察转染24 h后HMGA2蛋白表达水平,经细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)测定、流式细胞仪(FCM)检测及Transwell小室检测转染后GH腺瘤细胞增殖、凋亡及侵袭.结果 HMGA2-shRNA组HMGA2蛋白表达水平与空白对照组比较下降45.58％,与scrambled组比较下降40.98％,差异有统计学意义(p＜0.05).细胞增殖反应结果显示实验组细胞增殖率显著低于对照组(P＜0.05).细胞凋亡率的结果显示与空白对照组、scrambled组比较,HMGA2-shRNA组的细胞凋亡率明显增加[(18.32±1.73)％比(7.32±1.06)％、(9.21±1.12)％,P＜0.05].体外侵袭实验显示GH腺瘤细胞侵袭力受到明显抑制(P＜0.05).结论 靶向HMGA2基因的shRNA可以有效抑制垂体GH腺瘤细胞的增殖和侵袭力,并促进细胞的凋亡.
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靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2 shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达
目的 构建靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和环氧合酶-2(COX-2)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,观察其在人胃癌细胞株SGC-7901中的表达.方法 利用同源重组技术构建重组腺病毒载体pGSadeno-Akt1+COX-2(pGSadeno-A+C),经酶切及测序鉴定后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组rAd5-A+C腺病毒,并测定病毒的滴度.体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后,Real-time PCR和蛋白印迹分别检测Akt1和COX-2 mRNA和蛋白质的表达.结果 成功构建rAd5-A+C重组腺病毒,测定包装的病毒滴度为1.0×1010pfu/ml.转染组Akt1和COX-2 mRNA表达明显下调,其△Ct值分别是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比rAd5-HK空载组(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和对照组(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高(P<0.01),而空载组和对照组比较ΔCt值无明显变化(P>0.05).同样转染组Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组比较分别下调70.5%和63.7%(P<0.01),空载组和对照组比较Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 靶向性Akt1和COX-2的shRNA腺病毒载体可以特异性抑制Akt1和COX-2的表达,可能成为胃癌靶向性Akt1和COX-2基因治疗的新策略.
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短发夹RNA对SMMC-7721肝癌细胞株ICAM-1基因表达的影响
目的 探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1,CD54)基因的短发夹结构RNA(shRNA)表达载体pGenesil-1/CD54对SMMC-7721肝癌细胞株CD54表达的抑制作用.方法 设计CD54基因shRNA片段和阴性对照shRNA片段,构建pGenesil-1/CD54和阴性对照表达载体,载体在coli菌扩增、鉴定后,转入SMMC-7721细胞.应用免疫组织化学技术检测肝癌细胞中CD54基因的表达.结果 阳性和阴性表达载体酶切,电泳有65 bp和4.9kb条带,载体插入片段测序,与设计序列相同,表达载体构建正确.免疫组织化学检测表明,阴性对照表达载体转染SMMC-7721细胞,细胞膜和细胞质着黄色和棕色,pGenesil-1/CD54转染SMMC-7721细胞,不着色或着淡黄色.结论 CD54的shRNA能特异性地抑制CD54在肝癌细胞SMMC-7721中的表达.
关键词： 短发夹RNA RNA干扰 CD54 SMMC-7721细胞 基因表达 -
双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究
目的 观察人端粒酶反转录酶(hTERT)与杂合启动子HREAF双调控并携带靶向干扰黏着斑激酶(FAK)短发夹RNA(FAK shRNA)的溶瘤腺病毒SG505-siFAK在体外和体内对肝癌的抗癌作用.方法 利用半数细胞培养物感染量(TCID50)法检测重组溶瘤腺病毒SG505、SG505-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和SG505-siFAK病毒在不同细胞中的扩增倍数.利用Western blot检测FAK、早期蛋白E1A和早期蛋白E1B的表达强度.建立裸鼠移植瘤模型,给予溶瘤腺病毒治疗,观察比较肿瘤生长体积,分析FAK免疫组织化学结果.结果 TCID50法检测病毒扩增结果显示:SG505-siFAK在Hep3B和HepG2细胞中的扩增倍数为1.36×108倍和2.02×108倍,明显强于在SMMC-7721、BJ、L02、PANC-1和H460细胞中的扩增能力.SG505-siFAK携带的靶基因FAK-shRNA可以有效降低FAK的表达.Westem blot结果显示SG505、SG505-EGFP和SG505-siFAK感染BJ、L02后E1A、E1B表达较弱,而感染Hep3B、HepG2后E1A、E1B表达较强.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖结果显示,SG505-siFAK感染Hep3B、HepG2、SMMC-7721、L02、PANC-1和H460的半数抑制浓度(IC50)分别是(0.092 ±0.009)、(0.424±0.414)、(14.790±2.520)、(48.709±0.927)、(5.970±0.945)和(2.710 ±0.244) pfu/cell.裸鼠移植瘤实验结果显示:静脉注射和瘤内注射Wad5、SG505和SG505-siFAK的产生的抑瘤率分别是80.06％、54.14％、79.63％和84.54％、56.64％、87.14％,瘤内注射SG505-siFAK较静脉注射产生更高的抑瘤率(P＜0.01).免疫组织化学结果显示SG505-siFAK可以有效降低FAK在肿瘤组织的表达.结论 SG505-siFAK能选择性地在甲胎蛋白(AFP)阳性肝癌细胞内扩增并产生溶瘤作用,腺病毒SG505自身的溶瘤作用和FAK-shRNA的抑瘤作用表现出协同抗肿瘤效应.
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bmi-1shRNA逆转录病毒表达载体的构建及稳定转染LoVo细胞系的建立
目的 构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,建立稳定转染的LoVo细胞系,探讨稳定转染bmi-1shRNA对大肠癌细胞LoVo靶基因表达的影响,为下一步应用RNAi技术治疗打下基础.方法 设计合成靶向bmi-1基因编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,另设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-C,载体经脂质体2000介导转染LoVo细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的LoVo细胞系,显微镜观察、MTT检测、荧光定量PCR、Western blot检测bmi-1表达受抑后对细胞的增殖影响.结果 成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体,建立了稳定转染的LoVo细胞系,bmi-1shRNA对LoVo细胞bmi-1 mRNA表达抑制率为80%、bmi-1蛋白抑制率为82%,P<0.05.结论 针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞LoVo的增殖能力,bmi-1 mRNA与蛋白表达受抑制,但对细胞形态学无明显影响.
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RNA干扰HER2基因对人大肠癌HT29细胞株增殖影响的研究
目的 研究载体介导的靶向HER2基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对体外生长的人大肠癌HT29细胞增殖的影响.方法 将针对HER2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shR-NA)表达载体转染体外生长的HT29细胞,分别用半定量RT-PCR和Western blot检测HER2 mRNA和蛋白的表达,MTT测定各组细胞的增殖差异.结果 靶向HER2的shRNA可以有效地抑制体外生长的人大肠癌HT29细胞中HER2基因mRNA和蛋白表达,与对照组比较,实验组细胞增殖明显受到抑制.结论 靶向HER2的shRNA表达载体可以通过降低HER2基因的表达,进而抑制体外生长的大肠癌HT29细胞的增殖.
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DNA-PKcs短发夹RNA载体的构建及其表达
目的 构建DNA-PKcsshRNA表达载体,观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响.方法 将针对人DNA-PKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞,RT-PCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率,MTT法测定DNA-PKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响.结果 DNA测序分析证实DNA-PKcs shRNA表达载体pSIRENDNA-PKcs shRNA构建成功并在细胞中表达,转染重组载体的A2780细胞DNA-PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降;重组载体转染细胞增殖活性明显降低.结论 成功构建DNA-PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA-PKcs奠定了基础;DNA-PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低.
关键词： DNA-PKcs基因 短发夹RNA 真核表达载体 细胞增殖活性 -
利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达
目的构建生存素(survivin)短发夹状RNA表达载体,检测其对骨肉瘤细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响.方法体外构建survivin shRNA 表达载体pSilence2.1-neo-survivin,转染骨肉瘤细胞系MG-63,RT-PCR、免疫组化方法检测转染前后survivin mRNA及蛋白的表达,MTT比色法检测细胞增殖活性.结果 pSilence2.1-neo -survivin载体转染能显著抑制survivin mRNA、蛋白表达,转染后48h细胞增殖的抑制率为61.83%.结论 pSilence2.1-neo-survivin可显著抑制MG-63细胞survivin mRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性.
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慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响
目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(shRNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响.方法:RT-qPCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的shRNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率.实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-shRNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-shRNA组(慢病毒介导Cullin组).MTT法和BrdU实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化.结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达.Cullin3-shRNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-shRNA组相比,Cullin3-shRNA组Cullin3表达水平下降(P＜0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期.结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点.
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RNA干扰神经干细胞中NgR基因的表达修复大鼠面神经缺损的体外实验研究
目的:应用RNA干扰技术抑制神经干细胞中NgR基因表达,观察神经干细胞的体外分化,为体内面神经修复提供营养支持.方法:采用PCR扩增,限制性内切酶酶切,T4DNA连接酶连接,将NgR与pGCsi载体连接,构建重组载体NgR shRNA,通过测序鉴定.NgR shRNA通过Lipofectamine 2000感染神经干细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western Blot检测NgR的表达,免疫细胞化学鉴定转染前后神经干细胞向神经元分化的比例,转染后的神经干细胞种植于PLGA管,扫描电镜观察.结果:成功构建NgR shRNA质粒,成功感染神经干细胞,Western Blot结果表明干扰后的神经干细胞中的NgR表达减弱、免疫细胞化学结果示干扰后的神经干细胞向神经元分化比例明显高于对照组(P＜0.01),差异有统计学意义.结论:成功构建NgR shRNA质粒,感染神经干细胞,使神经干细胞向神经元进一步分化,能更有效促进神经轴突的再生,为面神经损伤修复提供高效稳定的基因平台.
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NRP—1在调控人舌鳞状细胞癌细胞分化中的作用
目的:构建神经纤毛素1(Neuropilin-1,NRP-1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对人舌鳞状细胞癌细胞株SCC25(squamous cell carcinoma 25)分化的影响.方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰NRP-1编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1.将构建正确的PL-KO.1/NRP-1-shRNA感染SCC25,western blot和实时荧光定量PCR检测NRP-1的表达,划痕实验和实时荧光定量PCR检测其对SCC25分化的影响.结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,SCC25转染了NRP-1-shRNA后NRP-1表达水平降低,干扰效率达65％.划痕实验结果表明NRP-1下调明显降低了SCC25的迁移能力.实时荧光定量PCR结果表明NRP-1下调可以导致SCC25上皮标记蛋白钙粘附蛋白(epithelial cadberin,E-cadherin)表达上调,而间充质标记蛋白纤粘蛋白(fibronectin.FN)和波形蛋白(Vimentin,VIM)表达下调,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).结论:慢病毒介导的NRP-1-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响SCC25的分化.
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短发夹RNA对头颈肿瘤细胞端粒酶活性和增殖的影响
目的:观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的短发夹RNA(shRNA)对喉癌Hep-2细胞株和鼻咽癌NEC细胞株端粒酶活性和生长增殖影响,探讨抑制端粒酶活性途径治疗头颈肿瘤的可行性.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达shRNA、含荧光素基因、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒shRNA1和表达shRNA的、含荧光素基因的、靶向非人类基因的真核表达质粒shRNA2.分别以质粒shRNA1、shRNA2、转染试剂及空白培养液处理体外培养的Hep-2细胞和NEC细胞.转染48 h后以TRAP PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性并行HE染色;倒置显微镜下每天观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖活性.结果:① Hep-2细胞和NEC细胞shRNA1处理48 h后与空白对照组比较端粒酶活性下降, P＜0.05.② HE染色发现shRNA1处理后Hep-2和NEC细胞胞体缩小、核固缩,同等培养条件下,细胞生长密度变稀,见许多圆形死亡细胞.③与相应时间点空白对照组细胞平均吸光度(A)值比较,shRNA1处理组Hep-2细胞和NEC细胞24, 48, 72 h A值均减小,P＜0.05.结论:靶向hTERT mRNA的小干扰RNA能够显著降低Hep-2细胞和NEC细胞的端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖,并诱导细胞凋亡.
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细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定
目的 构建针对大鼠细胞信号转导抑制因子3(SOCS-3)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,选取有效shRNA模板序列.方法 设计并合成编码的shRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定;转染至骨骼肌细胞中.Real-time PCR和Western blot 检测各组SOCS-3的表达情况.结果 测序证实重组质粒构建成功.4对shRNA模板序列对SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比差异均有统计学意义(均P＜0.05),且以SOCS-3-shRNA a干预效果较好.结论 SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌细胞SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础.
关键词： 细胞信号转导抑制因子3 短发夹RNA RNA干扰 -
LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选
目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.
