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慢病毒介导shRNA沉默人纤维介素基因对心肌微血管内皮细胞增殖、迁移的影响
目的：探讨人纤维介素（fgl2）对心肌微血管内皮细胞（MMVECs）增殖、迁移的影响。方法制作并包装fgl2的RNA干扰慢病毒，转染MMVECs。实验分为单纯MMVECs（对照组）、空载质粒慢病毒（ GFP组）、fgl2短发夹 RNA（ shRNA）慢病毒（ fgl2-RNAi-LV组）。稳定转染4 d后，实时定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测各组fgl2 mRNA表达，MTT检测细胞增殖；Transwell 检测细胞迁移能力。结果 qRT-PCR 结果显示，与对照组与GFP组比较，fgl2-RNAi-LV组的fgl2表达明显下调，MMVECs的增殖能力与迁移能力增强（P＜0.05），而对照组与 GFP 组无明显差异。结论转染fgl2shRNA慢病毒载体后MMVECs的fgl2表达水平明显下调， fgl2shRNA慢病毒转染MMVECs，MMVECs的增殖能力与迁移能力增强。
关键词： 纤维介素2(fgl2) 短发夹RNA 心肌微血管内皮(MMVECs) 增殖 迁移 -
慢病毒携带的短发夹RNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶基因表达的沉默作用
目的 通过构建短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,探讨慢病毒携带的shRNA对乳腺癌细胞乙酰肝素酶(HPA)基因表达的沉默作用.方法 采用RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以乳腺癌HPA基因为靶基因,将构建5对shRNA重组慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过Western印迹检测HPA-shRNA对MDA-MB-231细胞HPA蛋白表达水平的影响;用CCK-8的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞的生长抑制作用及5-氟尿嘧啶(5-Fu)对乳腺癌细胞的杀伤作用,运用transwell实验检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞侵袭能力的影响.进一步,运用流式分析的方法检测HPA-shRNA对乳腺癌细胞周期的影响.建立小鼠转移瘤模型,检测HPA-shRNA在体内对乳腺癌细胞的生长抑制作用.结果 成功构建HPA-shRNA重组慢病毒载体.在体外,实验组HPA-shRNA1组、HPA-shRNA3组、HPA-shRNA4组有效沉默了人乳腺癌MDA-MB-231细胞HPA的表达,HPA蛋白表达明显降低(P<0.05).HPA-shRNA1对乳腺癌细胞的生长具有良好的抑制作用,HPA-shRNA1能够增加乳腺癌细胞对5-Fu的敏感性.此外,HPA-shRNA1能够诱导乳腺癌细胞在S期发生细胞周期阻滞.在体内,HPA-shRNA1组HPA基因mRNA相对表达量明显低于阴性对照组(P<0.05),HPA-shRNA1能够沉默乳腺癌移植瘤HPA mRNA表达.在体内HPA-shRNA1同样能够抑制乳腺癌细胞生长.结论 HPA-shRNA重组慢病毒载体可有效抑制乳腺癌HPA基因的表达,进而发挥良好的抗肿瘤作用.
关键词： 乙酰肝素酶 乳腺癌 慢病毒载体 短发夹RNA MDA-MB-231细胞 -
Nurr1基因shRNA表达载体的构建及其鉴定
目的构建针对小鼠核受体相关因子1(Nurr1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体,为进一步体内外研究Nurr1基因的功能奠定基础.方法选择两段RNA干扰靶序列,在体外分别合成两段互补的寡核苷酸,退火后与线性化的pSilenCircle质粒连接、转化感受态细胞DH5α,扩增、纯化得到所需质粒,通过酶切后琼脂糖电泳以及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果纯化质粒的大小为4.6kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符.结论成功构建了针对Nurr1基因的shRNA的表达载体.
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人NOB1基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定
目的:构建人NOB1基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并在卵巢癌SKOV3和HEY细胞上鉴定其沉默效率.方法:针对NOB1基因设计特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLVTHM载体,筛选获得的有效shRNA慢病毒载体在293T细胞包装成病毒颗粒,随后将其感染卵巢癌SKOV3和HEY细胞,采用ReaI-time PCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率.结果:构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到8×10~8 PU·L~(-1).shRNA慢病毒颗粒感染SKOV3和HEY细胞后NOB1基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了73.5%和82.2%.结论:成功构建NOB1基因的shRNA慢病毒表达载体,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.
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超声靶向破坏微泡技术介导小鼠肝癌细胞株JNK1基因表达、细胞迁移和侵袭抑制
目的:探讨应用超声靶向破坏微泡(UTMD)技术介导小鼠肝癌细胞株JNK1基因的表达、细胞迁移和侵袭抑制的作用,阐明其作用机制.方法:构建并筛选RNA干扰效果好的短发夹RNA (shRNA).将小鼠肝癌细胞株Hca-F分为正常Hca-F细胞组、shRNA质粒组、脂质体组、超声微泡结合超声辐照组及脂质体结合超声微泡加超声辐照组.采用倒置荧光显微镜观察各组细胞转染率,荧光定量PCR和Western blotting法检测JNK1基因mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,应用Transwell实验检测各组细胞的体外迁移能力.结果:脂质体结合超声微泡加超声辐照组细胞转染率高于shRNA质粒组、脂质体组和超声微泡结合超声辐照组(均P＜0.05),脂质体组和超声微泡结合超声辐照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).脂质体结合超声微泡加超声辐照组JNK1 mRNA和蛋白表达水平低于其他各组(P＜0.05);脂质体结合超声微泡加超声辐照组细胞活性和平均穿膜细胞数均低于其他各组(P＜0.05).结论:UTMD技术结合脂质体转染法可以提高小鼠肝癌细胞株JNK1 shRNA的转染效率,增强其对基因表达、细胞活力、迁移和侵袭能力的抑制.
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下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用
目的:利用特异性发夹结构Wee1B shRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响.方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、ControlshRNA注射组和Wee1B shRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1BshRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性.结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1B shRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1B mRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1B shRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33 h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91％±1.74％、72.90％±2.25％和72.28％±2.06％,3组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);而Wee1B shRNA注射组的卵裂率提高18.00％,为90.00％±0.77％,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程.
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RNA干扰FZD4基因表达对人胶质瘤干细胞自我更新能力的抑制作用
目的:探讨FZD4在人胶质瘤干细胞自我更新能力中的作用,并阐明其作用机制.方法:针对人的FZD4设计了2条短发夹RNA (shRNA)序列,利用慢病毒包装后感染人胶质瘤U251细胞(FZD4 shRNA干扰组分为FZD4-shRNA-1#和FZD4-shRNA-2#组),经空病毒感染的U251细胞为对照组.倒置显微镜观察感染的U251细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,通过RT-PCR和免疫印迹法检测各组细胞中FZD4 mRNA和蛋白表达水平.利用干细胞培养基筛选出胶质瘤干细胞,采用极限稀释实验观察FZD4 shRNA对肿瘤干细胞增殖及自我更新的影响.结果:与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组FZD4 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组中干细胞形成的神经球直径明显缩小(P＜0.01).极限稀释实验,与对照组比较,FZD4 shRNA干扰组干细胞在每个孔中生成至少1个神经球所需要的细胞数明显增加(P＜0.05或P＜0.01).结论:通过shRNA下调U251细胞中FZD4的表达后可以显著抑制胶质瘤肿瘤干细胞的自我更新能力.
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抑制丙型肝炎病毒NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义
目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用.方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencerTM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白表达.结果:对重新构建的pSilencerTM 3.1-H1neoHCV NS5A-R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4 348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒NS5A蛋白在相对分子质量5 600处出现条带.结论:设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用.
关键词： 丙型肝炎病毒NS5A基因 短发夹RNA RNA干扰 -
人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响
目的 探讨特异件抑制人Makofin环指蛋白1(MKRN1)基冈的表达对HEK293细胞的影响.方法 用脂质体将前期筛选出的含有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响.结果 人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖.结论 抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖.
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细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测
目的 构建细丝蛋白A(filaminA,FLNa)shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞HepG2和Huh7中的干扰效率.方法 通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2,转染HepG2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率.结果 构建的FLNashRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,HepG2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在HepG2细胞中分别约为45.4％和63.7％,在Huh7细胞中分别约为76.5％和78.3％.结论 成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在HepG2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路.
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TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
目的 探讨TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 构建3个靶向TPX2基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,转染A549细胞,RT-PCR检测TPX2基因mRNA的转录水平;筛选干扰效果佳的质粒转染的细胞,RT-PCR检测增殖相关基因CDK4和CyclingD1 mRNA的转录水平,Western blot检测TPX2蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活力.结果 TPX2 shRNA-3质粒干扰效果佳,有效沉默TPX2基因后,A549细胞中TPX2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均受到明显抑制(P＜0.01),与空白对照组比较,抑制率分别为73.8％和82.8％;CDK4和CyclingD1基因mRNA的转录水平也明显降低(P＜0.01或＜0.05),与空白对照组比较,抑制率分别为76.7％和67.3％;A549细胞的生长和增殖也明显受到抑制,转染后72 h,增殖抑制率可达61.55％(P＜0.05).结论 成功构建了靶向TPX2基因的shRNA表达质粒,其在mRNA和蛋白水平有效抑制A549细胞TPX2基因的表达后,细胞生长受到抑制,增殖能力减弱.
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靶向Pin1基因的shRNA干扰质粒的构建及其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用
目的 构建靶向Pin1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰真核表达质粒,并检测其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用.方法 设计合成特异性针对人Pin1基因的寡核苷酸序列,退火后与pGenesil-1载体连接,构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pGenesil-1-Pin1(+),利用脂质体转染大肠癌SW620细胞.以质粒pGenesil-1-Pin(-)转染细胞和未转染细胞为对照.利用荧光显微镜观察转染后细胞表达的绿色荧光蛋白,估算转染效率;应用实时荧光定量PCR和Western blot检测其对SW620细胞Pin1基因mRNA转录及蛋白表达的影响.结果 所构建的特异PinlshRNA真核表达质粒经酶切及测序证明构建正确,转染SW620细胞的转染效率为64%.shRNA对SW620细胞Pin1基因mRNA的抑制率在转染后72 h高,为70.2%,蛋白抑制率为60%.结论 已成功构建了靶向Pin1基因的shRNA干扰真核表达质粒.可抑制SW620细胞Pin1基因mRNA的转录及蛋白的表达.
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环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.方法 将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经Pme Ⅰ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经Pac Ⅰ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度.RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.结果 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml.重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均＜0.05).结论 成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础.
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人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
目的 构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响.方法 设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响.结果 经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%.结论 已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础.
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shRNA沉默P115基因对胃癌细胞增殖相关蛋白表达的影响及机制
目的 探讨高尔基体囊泡转运蛋白(colgi-vesicular transport protein,P115)基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中增殖相关因子细胞周期素D1 (cyclinD1)、微小染色体维持缺陷蛋白2(mini chromosome maintenance protein 2,Mcm2)和增殖细胞核抗原(proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表达的影响及其可能的机制.方法 采用脂质体介导法将重组表达质粒P115-shRNA2(P115-shRNA2组)和阴性对照质粒shNC(阴性对照组)转染至高表达P115的胃癌细胞株BGC-823中,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测细胞中P115、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)、cyclinD1、Mcm2和PCNA基因mRNA的转录水平；Western blot法检测细胞中P115、MIF、pERK1/2、cyclinD1、Mcm2和PCNA蛋白表达水平；免疫共沉淀法检测BGC-823细胞中P115与MIF间的相互作用；ELISA法检测细胞上清液中MIF的分泌水平.结果 与未转染组和阴性对照组相比,P115-shRNA2组细胞中P115、MIF、cyclinD1、Mcm2和PCNA的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,ERK1/2的磷酸化水平明显下调,BGC-823细胞培养上清中MIF的含量明显降低；P115蛋白可在抗MIF的免疫沉淀物中检出,P115和MIF在BGC-823细胞中存在特异性的相互作用.结论 P115基因沉默下调胃癌细胞中cyclinD1、Mcm2和PCNA的表达,其分子机制可能与P115通过调控MIF的表达和分泌,进而启动下游的ERK1/2信号通路有关.P115可作为研究胃癌细胞增殖分子机制的新靶点.
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小鼠白细胞介素-17及其shRNA重组表达质粒的构建
目的 构建小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及其shRNA重组表达质粒.方法 以小鼠脾脏细胞总RNA为模板,PCR扩增IL-17基因,并亚克隆至质粒pLVX-IRES-ZsGreen1,构建重组表达质粒pLVX-IL-17-IRES-ZsGreen1;设计并合成3对针对IL-17基因的shRNA序列和1对阴性对照shRNA序列,分别插入质粒pLVX-shRNA,构建重组干扰质粒pLVX-shRNA 1、pLVX-shRNA2、pLVX-shRNA3和阴性对照质粒shRNAC,进行测序;用脂质体法将各重组干扰质粒分别与表达质粒共转染293T细胞,分为空白对照组、过表达组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组和shRNAC组,经荧光定量PCR和ELISA法分别检测各组细胞中IL-17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 PCR扩增获得500 bp的目的基因,IL-17重组表达质粒及其shRNA重组质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;重组表达质粒转染293T细胞48 h后可见绿色荧光表达;过表达组IL-17基因mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P均＜0.05),shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组IL-17基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于shRNAC组(P均＜0.05).结论 成功构建了小鼠IL-17基因重组表达质粒及其特异性shRNA表达质粒,并筛选出shRNA1,其对IL-17的表达具有佳的抑制效应.
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质粒介导的NDRG2 shRNA抑制其在人肿瘤细胞HHCC中的表达
目的构建含有针对MDRG2的shRNA的质粒,抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达.方法用PCR方法从人基因组DNA中扩增出336bp的U6启动子,与29bp的NDRG2靶序列的反向重复序列和pSNAV质粒相连.连接后的pSNAVU6质粒转染入HHCC细胞,检测它们对NDRG2表达的影响.结果pSNAVU6重组质粒能抑制NDRG2的表达.结论针对NDRG2的短的发夹RNA能抑制NDRG2在HHCC细胞中的表达.
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PDE5 shRNA对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响
目的:探讨磷酸二酯酶5(PDE5) shRNA对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响.方法:通过结扎小鼠左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型,并将建立好的模型随机分为实验组(n=10):将携带有抑制PDE5的shRNA (PDE5 shRNA)重组腺病毒载体对小鼠心肌组织多部位注射;模型组(n=10):将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体对小鼠心肌组织多部位注射.1周后,进行免疫组化和TUNEL分析检测梗死及梗死周边细胞凋亡情况,ELISA法检测环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)和蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)的表达,免疫蛋白印迹分析检测各组磷酸二酯酶5(phosphodiesterase5,PDE5)的表达情况.结果:心梗1周后,和模型组相比较,实验组小鼠梗死区及梗死周边区域细胞凋亡明显减少(P＜0.05),实验组小鼠心肌PDE5表达明显减少,cGMP和PKG表达明显上调(P＜0.05).结论:PDE5 shRNA可以明显减少梗死区及梗死周边区细胞凋亡,可能与上调cGMP和PKG的表达密切相关.
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针对核因子-kB P65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定
目的:构建针对人核因子kB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制NF-kB P65基因表达的作用.方法:根据shRNA设计原则,在人NF-kB P65全长序列中选取合19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER.retro.neo中,构建针对NF-kB P65基因的shRNA表达载体.经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞.分别采用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果.结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-kB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-kB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制.结论:成功构建了NF-kB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-kB P65的表达.
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靶向bmi-1真核表达载体的构建及对SW480细胞的增殖研究
目的:构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,检测它对大肠癌细胞株SW480增殖的影响.方法:利用载体介导的RNA干扰技术,设计、合成靶向bmi-1基因、编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,并设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-c,载体经脂质体2000介导转染SW480细胞,经MTT检测,观察bmi-1表达受抑后对细胞增殖的影响.结果:成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体.结论:针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞SW480的增殖能力.
