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复发性外阴阴道念珠菌病患者及性伴侣带菌情况分析
目的 研究复发性外阴阴道念珠菌病(RWC)复发相关因素.方法 选择55例RVVC患者及其中45位患者性伴侣,取阴道、肛门、口腔及龟头分泌物分离念珠菌,采用ITS1区单链构型多态性(SSCP)分析和大亚基26S rDNA基因D1/D2区序列分析相结合的方法进行菌种鉴定,应用微卫星CAI位点的SSCP和基因扫描分析相结合的方法进行白色念珠菌的基因型测定.结果 RVVC患者阴道、肛门、口腔及其性伴侣龟头分泌物的念珠菌培养阳性率分别为100.0%(55/55)、61.8%(34/55)、1.8%(1/55)和60.0%(27/45),各部位念珠菌感染均以白色念珠菌为主,且所占比例无明显差异.同一患者阴道与肛门、阴道与性伴侣龟头分泌物的白色念珠菌基因型符合率分别为86.2%和54.5%.结论 肠道及性伴侣龟头携带的念珠菌可能是RVVC复发的重要因素之一.
关键词： 复发性外阴阴道念珠菌病 基因型 单链构象多态性 基因扫描 -
基因扫描分析AML-M2a病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖
目的了解AML-M2a患者外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法利用RT-PCR扩增14例AML-M2a患者外周血单个核细胞中24个TCR Vβ亚家族基因的CDR3,了解TCR Vβ亚家族T细胞的分布.阳性产物进一步经基因扫描分析了解其克隆性.结果 14例AML-M2a患者选择性表达3～10个Vβ亚家族,其中部分Vβ亚家族呈寡克隆增殖.结论 AML-M2a患者TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖,可能是机体对M2a细胞刺激所产生的特异性免疫反应.
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CD45RO阳性的B细胞性淋巴瘤
目的研究免疫表型异常淋巴瘤的起源.方法从48例B细胞淋巴瘤中筛选出3例CD45RO、CD20和CD79a(+),CD3(-)的淋巴瘤.采用免疫组化、PCR和基因扫描技术对其免疫表型,免疫球蛋白重链基因重排(IgH)和T细胞受体基因重排(TCR)进行深入研究.结果 3例淋巴瘤均为结外淋巴瘤.1例为滤泡性淋巴瘤,2例为弥漫性大B细胞性淋巴瘤.PCR和基因扫描显示3例均有IgH克隆性扩增;PCR未显示TCR扩增;高敏感性基因扫描显示低峰值TCR克隆性扩增,提示可能为背景T细胞扩增.结论 CD45RO不是T细胞特异性抗原,CD45RO阳性细胞不能完全等同于T细胞,因此,在研究和临床病理诊断中应选用多种抗体配合使用.
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单管PCR扩增鉴定ABO血型基因型
本研究目的是建立单管PCR扩增鉴定ABO血型基因型的方法.采用盐析法抽提DNA,应用单管PCR扩增结合基因扫描技术对ABO血型的基因型进行鉴定.结果表明:用本方法鉴定出的132例样本的ABO基因型结果与其血清学结果完全符合,A、B、O基因频率分别为0.205、0.159、0.636,其中AA基因型8例(6.1%),AO基因型31例(23.5%),AB基因型7例(5.3%),BB基因型6例(4.5%),BO基因型23例(17.4%),OO基因型57例(43.2%).结论:单管PCR扩增结合基因扫描技术能鉴定ABO血型基因型.
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β模块配型技术的建立
本研究目的是建立β模块配型技术.采用盐析法从全血中抽提DNA,采用PCR和GeneScan技术进行β模块配型.结果表明:①在检测的100例样本中,扩增出的DNA片段长度不一,其范围为91-197 bp;共形成4个相对较集中的区域,分别为91-93 bp、105-113 bp、125-139 bp、177-197 bp,其中所有样本均存在91 bp的片段.②在样本中不同长度的DNA片段的个数呈现高度多态性,其范围为7-24个.结论:建立的β模块配型技术是可行的,可用于造血干细胞移植供者的选择.
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白血病过继免疫治疗时外周血T淋巴细胞诱导培养后的克隆性变化
本研究分析白血病细胞免疫时自体树突细胞(DC)和多种细胞因子诱导外周血淋巴细胞后T细胞克隆性的变化.采集21例化疗缓解后行细胞免疫治疗的白血病患者的骨髓和外周血,加入细胞因子培养,获得树突细胞(DC)和激活T细胞.用RT-PCR扩增代表T细胞克隆性的T细胞受体β链可变区(T-cell receptor β variable region,TCRBV),用TCRBV基因扫描的方法观察培养前后T细胞克隆的特征性变化;对T细胞克隆的TCRBV进行序列分析.流式细胞术(FCM)检测CD3+、CD4+、CD8+、CD56+和CD4+ CD25str+FOXP3+,确定其细胞毒T细胞、辅助T细胞、调节T细胞和NK-T细胞的比例变化.结果表明:临床缓解后的白血病患者的T细胞呈寡克隆分布,分属在24个TCRBV家族中一些TCRBV基因家族的淋巴细胞克隆消失,仅少数保持多克隆分布,其中TCRBV 24基因家族均为克隆性的分布(100%).分析患者的TCRBV24基因序列特征时发现.3例在CDR3区共用motif VAG,2例共用GGG,表明这些TCRBV 24有可能识别同一抗原,其中1例(例5)患者除TCRBV24在CDR3区有motif GGG外,TCRBV8也有GGG,也可能会识别同一抗原.外周血淋巴细胞经过13天的体外抗原和细胞因子培养后,培养前出现的一些寡克隆以及克隆完全缺失的状态随即出现了明显变化,培养后都出现完整多克隆分布.将培养前后T细胞进行流式细胞术分析显示,培养后淋巴细胞数目为培养前的3.38±1.20倍,CD3+ 数培养前为(71.1±11.8)%细胞,培养第13天后为(95.4±3.2)%,明显增加;CD4+数培养前为(26.7±11.4)%,培养第13天后为(27.0±13.1)%,无明显变化(p>0.01);CD8+数培养前为(35.7±12.9)%,培养第13天后为(55.5±13.8)%,明显增加(p<0.01);CD3+ CD56+数培养前为(3.1±1.6)%,培养第13天后为(9.8±6.1)%,增加2倍多(p<0.01);CD4+CD25str+ FOX P3+数培养前为(0.12±0.1)%,培养第13天后为(0.22±0.18)%(p<0.01).结论:T淋巴细胞诱导培养方法的主要作用是促进CTL和NK细胞增殖,缓解后白血病患者体内淋巴细胞群往往呈寡克隆增殖,一些克隆会共用同样的TCRBV CDR3模体,识别同样的抗原,细胞因子联合诱导与DC共培养后淋巴细胞恢复多克隆免疫状态,产生以CTL和NK-T为主的效应细胞.
关键词： 白血病 过继免疫治疗 T细胞克隆 T细胞受体亚家族(TCRBV) 基因扫描 -
异基因造血干细胞移植患者外周血TCR Vβ亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系
本研究观察异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ亚家族克隆性增殖的动态变化,分析T细胞的克隆性演变与GVHD的关系.利用RT-PCR方法扩增70例次allo-HSCT后患者(其中17例次出现GVHD)外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性.结果表明:移植患者T细胞增殖一般都经历由单克隆向多克隆演变的过程,在移植后60-90天时,逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半.120天以后,无GVHD患者大多转为多克隆性表达;而GVHD患者受免疫抑制剂和GVHD的影响,直到1年以上仍有部分呈单克隆表达趋势.GVHD患者发生GVHD或靶器官受累明显的时候,外周血TCR Vβ亚家族的表达主要呈现单/双克隆的表现,而经过免疫抑制治疗病情好转后,部分患者出现由寡克隆表达转为多克隆增殖趋势.结论:移植后早期患者尤其是合并GVHD的患者,T细胞呈克隆性增殖和T细胞受体的倾向性利用;随着造血和免疫的恢复,TCR Vβ亚家族表达重新恢复趋向正常的多克隆性演变.
关键词： 造血干细胞移植 移植物抗宿主病 T细胞受体Vβ亚家族 T细胞克隆性 基因扫描 -
利用基因扫描技术分析类风湿关节炎T细胞受体的表达
目的通过研究T细胞Vβ的表达探讨类风湿关节炎的发病机制,为新的治疗手段提供一定的理论基础. 方法应用半定量的逆转录多聚酶链反应及基因扫描技术分析类风湿关节炎、骨关节炎、截肢病人滑膜及外周血中T细胞受体Vβ基因的表达情况以及T细胞的克隆性,并选择呈现单克隆或寡克隆的部分Vβ基因进一步克隆与测序. 结果滑膜组织与外周血T细胞表达绝大多数Vβ基因.类风湿关节炎病人滑膜组织中Vβ基因的表达呈现更明显的不均衡状态,Vβ6、Vβ 17与Vβ 22为优势亚群,其中以Vβ 17的高水平表达为突出.大多数阳性表达的Vβ基因均呈多克隆性. 结论类风湿关节炎病人滑膜组织中Vβ基因表达无限制性,但是存在明显的不均衡性,某些特定Vβ基因的选择性表达支持类风湿关节炎为抗原或超抗原驱动的免疫过程.
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CDR3谱型分析在肿瘤研究中的应用进展
肿瘤特异性T细胞通过其表面T细胞受体(Tcell receptor,TCR)识别肿瘤,进而杀伤肿瘤细胞,其所介导的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫应答中发挥极其重要的作用.寻找肿瘤特异性T细胞克隆是当前肿瘤研究领域的热点,而应用广泛、灵敏地寻找肿瘤特异性T细胞的方法是通过基因扫描(Ge-neScan)对TCR互补决定区3(complementary deter-mining region 3,CDR3)谱型进行分析.
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基因扫描技术在ABO血型基因型鉴定中的应用
目的建立基因扫描(GeneScan)技术鉴定ABO血型基因型的方法.方法根据O1基因在261位G缺失而非O1基因无缺失,B基因第803位核苷酸与A基因不同的特点,设计4对引物,分别在上游引物5′端标记荧光基团,PCR-SSP扩增后,用基因扫描技术鉴定ABO血型基因型.结果 129例样本用GeneScan技术鉴定的ABO血型结果与血清学结果完全符合,A、B、O基因频率分别为0.198、0.159、0.643.其中AA基因型8例(6.2%),AO基因型29例(22.5%),AB基因型6例(4.7%),BB基因型6例(4.7%),BO基因型23例(17.8%),OO基因型57例(44.2%).结论 GeneScan技术鉴定ABO血型基因型具有可行性,提供了一种可选择的方法.
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厦门地区大肠癌人群某些遗传性易感因子和抗性因子的研究
目的:比较15个STR基因座基因频率在厦门地区大肠癌患者和正常人群中的分布,推测与大肠癌相关的基因.方法:应用PCR复合扩增结合四色荧光检测方法对血样DNA进行基因型分析,调查了本地区大肠癌患者人群和无关人群的基因频率分布,并根据二者的该15个基因座等位基因频率分布的显著性差异,推测易感连锁和抗性连锁的等位基因.结果:厦门地区大肠癌患者的D5S818(0.5200vs 0.219 5,X2=36.69,P＜0.01;RR=3.852 1,P＜0.05)、vWA(0.050 0 vs 0.292 7,X2=53.99,P＜0.01;RR=0.127 2,P＜0.05)和FAG(0.09vs 0.243 9,x2=37.58,P＜0.01;RR=0.306 6,P＜0.05)基因座的等位基因的分布与该地区健康人群有显著性差异,(P＜0.01).B组超微结构改变明显,而C组较B组超微结构有不同程度减轻.结论:D5S818-11附近可能存在大肠癌易感基因;vWA-15、FAG-23附近有可能存在与大肠癌相关的抗性基因.
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乳腺癌患者T细胞受体基因重排及CDR3区序列分析
目的 分析乳腺癌转移淋巴结穿刺标本中T细胞受体(TCR)β链克隆性基因重排及互补决定区3(CDR3)区序列.方法 应用RT-PCR扩增2例反应性增生淋巴结及3例乳腺癌转移淋巴结T细胞24个TCR Vβ亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序.结果 乳腺癌转移淋巴结T细胞中TCR存在限制性取用,仅表达3～5个Vβ亚家族.增生的T细胞存在克隆性特点,增生形式包括寡克隆及多克隆.CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 乳腺癌转移淋巴结中存在T细胞克隆性增生,其TCRVβ呈限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同.
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外周T细胞淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析
目的 分析外周T细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体(TCR)β链克隆性基因重排及互补决定区3(CDR3)谱型.方法 应用RT-PCR扩增TCR V β 24个亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物测序分析其CDR3序列.结果 4例淋巴瘤患者TCR表达受到明显抑制,仅表达1～4个Vβ亚家族.所有患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增生T细胞,增生形式包括单克隆、双克隆及寡克隆增生趋势.CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 外周T细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCR V β呈限制性取用,不同克隆T细胞具有不同的CDR3谱型.
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延安地区汉族人群15个STR基因座多态性分析
目的调查15个STR基因座在延安地区汉族人群中的多态性分布,为群体学研究、法医学个体识别和亲权鉴定提供基础数据.方法应用美国ABI公司Identifiler荧光标记复合扩增试剂盒,结合PE9700扩增仪和ABI3100Avant遗传分析仪,对延安地区100名汉族无关个体的静脉血进行PCR扩增和电泳检测,并利用Genescan和Genotype软件进行自动分型.结果 15个STR基因座在延安汉族人群中的等位基因频率分布在0.005～0.550之间,基因型频率分布在0.010～0.310之间,累计耦合概率为2.5×10-17,累计非父排除率为0.999999999.结论本研究所应用的15个STR基因座在延安汉族人群中具有较高的多态性,适合于该地区的群体学研究、法医学个人识别和亲权鉴定.
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疾病相关基因研究需要临床流行病学
寻找疾病相关基因是继人类基因组计划完成后的一项新的庞大工程，涉及到医学和生物学的许多专业和领域。除了分子生物学外，临床流行病学是疾病相关基因研究需要的另一重要相关专业。 病人和相应的对照者是疾病相关基因研究必不可少的研究对象。以人为对象的研究，涉及到许多复杂的问题，必须用人群研究的方法和技术进行研究设计、资料收集和分析评价，这些内容都包括在临床流行病学范畴内。 已知多数疾病的病因是复杂的，如由多个基因致病，或由多个环境因素致病，或由多个基因和多个环境因素共同致病等，统称为复杂疾病的病因，疾病相关基因属于这一范畴。对于复杂疾病的病因学研究人们已经做了长期努力，包括疾病相关基因的研究，但成功的例子很少。究其原因，研究策略和方法学的相对滞后是制约进展的“瓶颈”。如家系＋全基因扫描的技术路线沿用单基因病研究的方法，在实践中遇到复杂疾病多个微效基因的困扰，至今没有取得突破性的进展。病例-对照＋预选基因的技术路线遇到对照的选择、预选基因的选择等难题，仍需要不断改进。
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苯致再生障碍性贫血患者T细胞受体Vβ亚家族基因的表达
目的比较苯中毒所致再生障碍性贫血(再障)患者与原发再障患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ亚家族基因不同期间的表达.方法采用RT-PCR扩增1例苯中毒所致再障患者与1例原发再障患者发病初期和骨髓恢复后的不同期间外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族的互补决定区3(CDR3),产物进一步经基因扫描分析T细胞的克隆性,并与10名正常人比较.结果健康人表达全部Vβ亚家族,PCR产物呈多峰图像(多克隆).苯中毒所致再障患者发病初期出现Vβ表达受抑制的情况不明显,但PCR产物出现多个单峰图像(寡克隆)或双峰图像(双克隆)的异常克隆性改变占41%,提示苯对机体的刺激作用而引起机体的相应的细胞免疫反应.随着病情恢复重新出现多克隆.原发再障患者发病初期出现9个亚家族表达受抑制,但其克隆性的改变绝大多数表现为多克隆图像,提示免疫功能不同程度受损,在骨髓恢复后可见受抑制的亚家族基因重新得到恢复,出现多克隆的多表达图像.结论苯中毒再障和原发再障患者外周血TCR Vβ亚家族基因表达有所差异,为进一步研究两者的免疫诊治提供了参考.
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孕妇血浆胎儿DNA的β地中海贫血产前基因诊断
我们对广西地区可能生育重型β地中海贫血(地贫)患儿的高危夫妇,通过分离和提取孕妇血浆中的胎儿DNA,应用荧光聚合酶链反应(PCR)和基因扫描(Genescan)分析方法,进行无创伤性β地贫产前基因诊断.
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CML细胞和K562细胞诱导TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖和杀伤性的研究
目的:了解CML细胞和K562细胞体外诱导CML细胞特异性T细胞的TCRVβ亚家族利用、克隆性增殖和杀伤性情况.方法:采用混合淋巴细胞/白血病细胞培养法(MLTC)体外将CML细胞和K562细胞与脐血和成人外周血MNC混合培养和扩增,运用RT-PCR-基因扫描技术分析其TCR Vβ亚家族的利用和克隆性特点,以及应用间接荧光单抗标记技术和LDH法分析诱导增殖的T细胞免疫表型和杀伤性.结果:CML细胞和K562细胞可以诱导出呈寡克隆或寡克隆趋势生长的Vβ亚家族T细胞,并具有识别和杀伤CML细胞的功能.结论:CML细胞和K562细胞可在体外诱导出异体CML细胞特异性CTL,该CTL可能为优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞.
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苯接触工人外周血T细胞受体TCR Vβ亚家族基因多态性分析
目的了解苯接触工人外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性,寻找防治苯中毒的免疫指标.方法采用RT-PCR扩增6例不同工龄低浓度苯接触工人外周血单核细胞的TCR Vβ 24个亚家族的互补决定区3(CDR3),产物进一步经基因扫描分析确定T细胞的克隆性,并与8名健康人作对照.结果 8名健康者表达全部Vβ亚家族,PCR产物呈多峰图像(多克隆).苯接触工人随工龄不同,外周血损伤的情况不同而出现Vβ表达减少,PCR产物出现寡克隆或双克隆改变.结论低浓度苯接触工人的外周血T细胞的TCR Vβ亚家族表达出现限制性,部分Vβ亚家族呈克隆性增殖,可能由于苯损害T细胞而造成机体免疫的不同改变.该方法有望成为预防和诊治苯中毒的一项免疫指标.
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CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析
目的:了解慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)患者外周血CD4+和CD8+T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法:利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞(PBMCs)、CD4+和CD8+细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果:CML患者外周血CD4+和CD8+细胞分别表达部分(1～21个)Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8+细胞中,分别以Vβ21(CD4+)和Vβ11(CD8+)亚家族的克隆性增殖多见.结论:CML患者外周血CD4+和CD8+细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4+和CD8+T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.
