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自身免疫性溶血性贫血病人T细胞的寡克隆性
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是机体免疫功能紊乱所引起的溶血性贫血，主要由于体内存在自身抗体而诱发。近年有研究发现AIHA病人的T细胞激活有异常[1,2]，但有关资料甚少。本文利用RT-PCR和基因扫描(Genescan)等方法分析T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因互补决定区3(CDR3)的长度，从而了解2例AIHA病人TCR Vβ各亚家族T细胞的分布和克隆性特点。1 材料与方法1.1 标本 经溶血性贫血有关检查等确诊的AIHA和Evans综合征各1例，正常人10例，T细胞株Molt-4和Jurkat作为对照。外周血单个核细胞分离、RNA提取及cDNA合成均按常规方法进行。1.2 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物[3]。每一标本分别以一Vβ(1～24)与Cβ引物共进行24次PCR检测。PCR操作按已报道方法进行[4,5]。1.3 基因扫描分析(T细胞克隆性分析)1.3.1 标记PCR产物(runoff reaction) 采用一荧光素标记引物Cβ-Fam(位于Cβ内侧)进行不对称半巢式PCR扩增，将首次PCR产物标上荧光素(fam)。总反应体积为10μl，其中包括2μl首次PCR产物，0．1μmol/L Cβ-Fam，3 mmol／L MgCl2，0．2 mmol/LdNTP,0．25U Taq聚合酶，PCR操作按已报道方法进行[4,5]。1.3.2 基因扫描(Genescan)分析 由于Vβ和Cβ引物是固定的，故Vβ/Cβ所扩增的PCR产物的大小决定于Vβ区和Dβ区之间以及Dβ区和Jβ区之间重排时的连接片段N区，即VβNDβNJβ(CDR3)，不同的T细胞克隆的PCR产物长度和浓度不同，通过PCR产物的状况，便可了解体内T细胞克隆存在的情况。经荧光素(fam)标记的产物通过自动序列分析仪(373A DNA序列仪，ABI，PE公司)中的分析软件672即基因扫描分析，通过电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰表示产物的大小和含量；峰的形态提示产物的均一性即克隆性，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，在电泳过程中，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头，所显示的结果为一单峰图象，即提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性。有关操作步骤按使用指南进行。取标记的PCR产物1μl，加入2．5 μl甲酰胺，0．5μl标准品[ABI，GENESCAN,500-TAMRA，其中含有不同大小的用荧光素Tamra标记的DNA片段作为产物大小的参照物]及0．5μl加样缓冲液(葡聚糖兰50mg／ml，EDTA25mmol／L)，于94℃，4 min变性后于6％聚丙酰胺凝胶，373ADNA序列分析仪中电泳及分析结果[4,5]。2 结果2.1 RT-PCR扩增结果 正常人T细胞包含几乎全部的Vβ亚家族T细胞；Molt-4仅表达Vβ2、Jurkat仅表达Vβ8的T细胞[4,5]，AHA病人的T细胞中仅存在Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ13、Vβ16和Vβ24等6个亚家族的T细胞；而Evans综合征病人的T细胞中则存在Vβ3、Vβ13和Vβ16等3个亚家族T细胞。2.2 基因扫描分析结果 正常人所有PCR产物均呈多峰图象，提示为多克隆性[5]；T细胞株的产物则为单克隆性；而所检测的2例病人中的Vβ3PCR产物均呈寡克隆性，Vβ16的PCR产物均呈双克隆性，其它的产物均提示为多克隆性(图1)。
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广西仫佬族3个短串联重复序列基因座的遗传多态性
目的:研究中国仫佬族短串联重复序列(STR)遗传多态性.方法:采用PCR-STR、基因扫描及基因分型技术,研究广西仫佬族无关个体3个STR位点(CSF1PO、TPOX、TH01)的基因频率分布情况.结果:3个STR位点共检出19种等位基因,其频率分布在0.0027～0.5297之间;平均杂合度为0.6378,多态信息总量为0.6152,累积个体识别力达0.9960,非父排除率达0.8127.结论:仫佬族具有高度遗传多态性的特点,实用价值较高,故以上数据可用于群体遗传学、法医学个体识别和亲子鉴定等研究.
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霉酚酸酯治疗GVHD及其分子机制的初步研究
初步探讨霉酚酸酯(MMF)治疗GVHD的分子机制.采用MMF每日1～2 g,并应用RT-PCR扩增3例GVHD患者MMF使用前后外周血单个核细胞的TCR Vβ 24个亚家族的CDR3,了解患者TCR VB T细胞的分布情况.结果表明,患者在GVHD发生前,有TCR Vβ3及其他亚家族基因表达,MMF治疗后,GVHD得以缓解,Vβ3不表达;当患者GVHD复发时,Vβ3基因又表达,治疗后不表达.MMF作用的分子机制可能与抑制TCR Vβ亚家族基因表达有关,TCR Vβ3可能是MMF作用的靶基因.
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利用TCR Vβ基因分析GVHD患者的克隆性T细胞
应用RT-PCR扩增3例异基因造血干细胞移植术后合并慢性GVHD患者的外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族的CDR3，了解患者TCR Vβ T细胞的表达，PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性。结果显示，3例患者均有克隆性T细胞生长，它可能与GVHD的发生有关。
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中国宁夏回族人群15个人类短串联重复序列位点的遗传多态性研究
目的研究宁夏回族人群15个人类短串联重复序列位点(STR) D3S1358、THO1、D21S11、D18S51、vWA、CSF1PO、D8S1179、TPOX、FGA、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D2S1338的遗传多态性.方法通过STR复合扩增、基因扫描、基因分型调查了102名回族无关个体15个STR位点等位基因分布情况.结果 15个STR位点均符合Hardy-Weinberg平衡,共检出150个STR等位基因,其频率分布在0.004 9～0.553 9之间,杂合度(H)为0.625 5～0.865 4,个体识别力(DP)为0.834 7～0.960 6,非父排除率(EPP)为0.381 2～0.720 4,多态信息含量(PIC)为0.572 2～0.845 6.结论此研究为进一步研究中国回族STR遗传结构奠定了基础,在人类学、法医学等领域也有重要的应用价值.
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AML-M2a诱导TCR Vβ T细胞的克隆性增殖和细胞毒作用
目的:了解急性髓性白血病(AML)M2a细胞诱导的体外增殖T细胞的特异性杀伤作用和克隆性增殖情况.方法:利用肿瘤细胞-T淋巴细胞混合培养方法(MLTC),分别收集3例经AML-M2a细胞体外诱导不同扩增时间的健康人T细胞,利用LDH释放方法分析其特异性细胞毒作用,同时利用RT-PCR和基因扫描方法分析经AML-M2a细胞诱导前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的表达和克隆性情况.结果:在培养第12天和第21天时,1例AML-M2a细胞诱导的3例健康人T细胞对该诱导细胞的平均杀伤率分别为39.88±7.79%和62.14±9.79%,而对AML-M2a患者和健康人外周血T细胞均无杀伤作用.TCR Vβ谱系分析发现诱导后3例健康人T细胞均出现Vβ16的克隆性增殖.结论:AML-M2a细胞可诱导健康人T细胞成为具有克隆性增殖的特异性CTL,并以Vβ16的克隆性增殖为主.
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基因扫描分析维持性血液透析患者外周血T细胞克隆性分布的特点
目的:了解慢性肾功能衰竭进行维持性血液透析(MHD)患者的外周血T细胞克隆性增殖的特性和意义. 方法:通过RT-PCR方法扩增11例膜性肾病(MGN)3例、膜增殖性肾炎(MPGN)3例、IgA肾病(IgAN)4例、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)1例.MHD患者外周血单核细胞T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因的CDR3,阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描的方法分析产物CDR3的长度及序列,了解T细胞的克隆性.结果:11例MHD患者中仅表达1～10个TCRVβ的亚家族,其中2例只表达Vβ3一个亚家族,分别为寡克隆及双克隆性.常见的TCR Vβ亚家族是Vβ3,其次Vβ8、Vβ19、Vβ22,再次为Vβ10、Vβ23.11例患者的透析时间与TCR Vβ表达呈显著负相关(r=-0.646,ρ=0.044);用协方差分析MGN、MPGN、IgAN三个病种的TCR Vβ表达差别:不同透析时间的TCR Vβ表达的数量不同(F=10.193,P=0.019),而MGN、MPGN、IgAN三个病种之间的表达量没有显著的差异(F=1.772,P=0.249).结论:MHD患者外周血存在着TCR Vβ亚家族T细胞倾斜分布的现象,并有克隆性增殖的特征,提示大部分MHD患者存在某些细胞免疫功能低下和有相同的免疫刺激原.透析时间愈长,TCR Vβ表达的数量愈少,提示长期血液透析可能是MHD患者的细胞免疫功能低下的一个原因;而 MGN、MPGN、IgAN三个病种之间TCRVβ的表达量没有显著差异.
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播散性浅表光线性汗孔角化病致病基因的定位
目的对播散性浅表光线性汗孔角化病(DSAP)的致病基因进行定位.方法收集一个DSAP家系成员的血样抽提基因组DNA,选用12号染色体长臂上已知致病区域的7个微卫星标记进行基因扫描,并用LJNKAGE软件(5.1 Version)对基因分型结果进行连锁分析.结果连锁分析结果发现本家系在微卫星标记D12S79的两点大LOD值为5.15(θ=0.00).结论DSAP致病基因位于12号染色体的长臂上.
关键词： 播散性浅表光线性汗孔角化病 家系 微卫星标记 基因扫描 连锁分析 -
福建泉州汉族人群15个STR位点的遗传多态性
目的阐明福建泉州地区汉族人群15个短串联重复序列(STR)的遗传多态性.方法应用STR复合扩增、基因扫描、基因分型方法,调查320名福建泉州地区无关个体15个STR位点的等位基因及其基因型分布情况.结果共检出150个等位基因,其频率分布在0.015625～0.5921875,符合Hardy-Weinberg定律,累计非父排除率和个体识别率分别达0.999999286和0.9999999999999999155.结论泉州地区汉族人群15个STR位点遗传结构特征,除TPOX和TH01位点外,均具有高度的多态信息为含量.
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基因扫描分析人T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立
目的 建立人T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)基因谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,应用RT-PCR方法扩增5例健康志愿者外周血T细胞的34个TCR Vα亚家族和26个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 T细胞株Jurkat细胞仅表达TCR Vα1.1和Vβ8基因,且为单克隆,而B细胞株Raji细胞则不表达所有的TCR Vα和Vβ基因.5例健康人表达所有的TCR Vα和Vβ基因,均为多克隆T细胞.结论 基因扫描分析人TCR CDR3基因谱型是检测T细胞克隆性的精确敏感方法.
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乳腺癌转移淋巴结T细胞克隆性分析
目的：分析乳腺癌患者转移淋巴结中 TCR BV 亚家族 T 细胞的克隆性分布特点。方法选取2例反应性增生淋巴结及10例乳腺癌转移淋巴结标本，应用 RT －PCR 方法扩增 T 细胞24个 TCR β链可变区（BV）亚家族的互补决定区3（CDR3）基因，经基因扫描确定 T 细胞克隆性。结果乳腺癌转移淋巴结中 T 细胞存在克隆性增生，增生形式包括单、寡克隆及多克隆。不同患者增生 T 细胞克隆中均存在 TCR 谱型偏移，仅表达2～5个 BV 亚家族。结论乳腺癌转移淋巴结内克隆性 T 细胞 TCR BV 亚家族存在选择性取用特点，可能与机体对乳腺癌相关抗原的特异性免疫反应有关。
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用基因芯片鉴别诊断四种水泡性疾病
为了对临床上症状非常相似的四种水泡性动物疾病进行大批量、快速准确的检测,我们尝试用基因芯片技术来对这四种水泡性疾病进行快速鉴别诊断.用Qiaquick 96 plate Kit对扩增的39个基因目的片段进行纯化,TE调配浓度至0.36μg/μL,于GMS417点样仪上按预选设计好的布阵方式点样,然后经紫外灯照射进行紫外交联等一系列处理.用Salmon进行非特异性杂交检测芯片点样的质量.大量抽提组织中FMDV和细胞上清液中的SVDV的总RNA,随机引物反转录的同时采用随机荧光标记法,标记FMDV和SVDV.标记好的cDNA超声波随机打断后进行特异性杂交,以佳光扫描强度进行扫描,Imagene软件扫描结果,对两者信号进行对比,结合各病毒相对应的坐标,可鉴别诊断出四种动物的水泡性疾病病毒.本方法不但快速、灵敏、准确性高,而且可实现对大批量货物的集成化检测,满足我国快速通关的要求.
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弥漫大B型非霍奇金淋巴瘤患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞分布和克隆性增生特点
目的:了解弥漫大B淋巴瘤(DLBL)患者外周血T细胞的TCR Vβ基因谱系及克隆性增殖情况.方法:利用RT-PCR 方法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性.结果:6例DLBL患者分别表达9～20个TCR Vβ亚家族.患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式包括寡克隆、寡克隆增殖趋势及双克隆.Vβ13和Vβ15 亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高(66.7%).结论:DLBL患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布具有特点,表现为TCR Vβ亚家族T细胞呈限制性选用和克隆性增殖,这可能是淋巴瘤患者机体对淋巴瘤相关抗原产生的特异性免疫反应.
关键词： 弥漫大B细胞性淋巴瘤 T细胞受体Vβ基因 T细胞克隆性 基因扫描 -
散发性结直肠癌患者18号染色体高频杂合缺失的研究
目的探讨散发性结直肠癌患者18号染色体上抑癌基因相关的杂合缺失(LOH)情况,并探索新的抑癌基因位点.方法对83例散发性结直肠癌患者基因组DNA用14个不同荧光标记的高度多态性微卫星引物,扩增相应的微卫星位点,平均距离为10 厘摩(centi-morgan,cM).用ABI PRISM 377 测序仪进行基因扫描,统计各位点杂合缺失率.结果在12个获得有效数据的微卫星位点中,平均杂合缺失率为36.78%,18p中高为D18S53(38.09%),18q中高为D18S474(55.74%).4位患者的18号染色体所有杂合位点都存在缺失,30位患者的杂合缺失位点不少于50%(平均6个/人);缺失位点少于50%的有53人(平均1个/人).结论结直肠癌患者18号染色体存在高频的LOH,并以整体缺失为特点.存在高频LOH的区域定位有转化生长因子(TGF)信号传导相关基因、结直肠癌缺失基因(DCC)、Rb结合蛋白8(RbBP8),特别是TGF信号传导相关基因MADH2、4、转化生长因子-β1反应元件(TGF-β1)等的缺失可能对结直肠癌的发生有重要影响.18 p也有存在未知抑癌基因的可能.
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CML相关TCRVα亚家族T细胞的克隆性分布特点
目的 了解慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血TCR Vα亚家族T细胞的克隆性分布特点.方法 采用RT-PCR扩增10例CML患者外周血的单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因,分析其TCR Vα亚家族的利用情况.PCR产物进一步经基因扫描分析,了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性.结果 不同病人外周血中所能检测出的Vα亚家族数量不等(1～21个),以Vα3、Vα4、Vα8、Vα10和Vα14为常见,并在Vα1、Vα2、Vα3、Vα4、Vα5、Vα8、Vα10、Vα12、Vα14、Vα15、Vα16、Vα19、Vα21和Vα23中发现克隆性生长T细胞.结论 CML病人外周血T细胞的TCR Vα亚家族选用呈现明显的选择性并出现克隆性T细胞,这可能与机体对白血病相关抗原产生特异性免疫有关,且克隆性增殖Vα亚家族分布以个体特异性为主.
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AML-M5细胞诱导TCR Vβ T 细胞克隆性增殖研究
目的了解急性髓细胞白血病(AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCR Vβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况.方法采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养(MLTC)方法,用AML-M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖,用RT-PCR扩增经MLTC前后获得细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解病人各Vβ亚家族的利用情况.并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点.结果脐血和供者外周血分别表达13和5个TCR Vβ亚家族T细胞,经MLTC培养初期,则表达全部24个Vβ亚家族,随着诱导时间的增加,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少.基因扫描显示AML-M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变,主要为Vβ21的克隆性增殖T细胞.结论 AML-M5细胞可诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖,这可能是对AML-M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果.
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乳腺癌淋巴结微转移患者克隆性T细胞TCRα链CDR3谱型分析
目的 分析乳腺癌微转移淋巴结T细胞克隆性增生及TCR α链谱型偏移情况,了解抗肿瘤T细胞克隆的分子特征.方法 利用RT-PCR扩增10例乳腺癌微转移淋巴结T细胞32个TCR可变区(AV)亚家族的基因,基因扫描检测T细胞克隆性及TCR AV亚家族取用情况,对单克隆家族行PCR扩增TCR α链全长序列,构建重组质粒后测序,分析互补决定区(CDR3)序列.结果 乳腺癌淋巴结微转移患者T细胞呈单、寡克隆、寡克隆趋势和多克隆增生,不同患者表达1～4个TCR AV亚家族.克隆性T细胞的CDR3氨基酸序列不同,但是病例4和病例8含有相同的CDR3氨基酸基序:AM和DDKⅡ.结论 乳腺癌TCR AV基因表达具有多样性特点,TCR AV家族的取用可能与乳腺癌肿瘤抗原的多样性和不同个体的免疫应答反应有关.相同CDR3氨基酸基序的发现可能对乳腺癌的T细胞介导免疫治疗提供帮助.
关键词： 乳腺肿瘤 T细胞受体 互补决定区(CDR) 基因扫描 -
陕西汉族人群2号和11号染色体15个STR基因座的遗传多态性
目的:分析陕西汉族人群2号和11号染色体上15个短串联重复序列(short tandem re-peat,STR)位点的多态性.方法:采用荧光标记基因扫描技术对15个STR基因座在175例无血缘关系的陕西汉族人中的遗传多态性进行分析.结果:D2S335, D2S396, D25338, D2S2382, D2S305, D2S151, D2S2368, D2S391, D11S912, D11S4090, D11S4147, D11S4190, D11S4149, D11S4126, D11S4094分别检出11,11,11,10,8,8,9,12,7,11,8,10,5,5,6个等位基因,各位点等位基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,杂和度(heterozygosity,H)为0.4216～0.8517,个体识别力(power of dis-crimination,DP)为0.6568～0.9598,多态信息量(polymerphism information content,PIC)为0.4078～0.8366,非父排除率(probability of paternity exclusion,EPP)为0.3135～0.8537.结论:15个STR基因座在陕西汉族人群中具有较好的多态性,表明了陕西汉族人群15个STR基因座结构特征,为人类学、法医学研究提供了数据.
关键词： 短串联重复序列 遗传多态性 基因扫描 Hardy-Weinberg平衡 -
基因扫描分析小鼠T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立
目的 建立小鼠T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 应用RT-PCR方法分别扩增近交系小鼠C57BL/6H-2b,Balb/CH-2d和F1代小鼠[Balb/cx C57BL/6 F1H-2d/b,CB6F1)脾脏T细胞的21个TCK Va家族和18个TCK VB家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 3种小鼠脾脏T细胞均表达所有的TCR Vα和Vβ CDR3基因,基因扫描显示全部TCK CDR3谱型呈高斯(钟型)分布,提示均为多克隆T细胞.各家族CDKs基因表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.结论 基因扫描分析TCR.αβ CDR3基因谱型是检测小鼠T细胞克隆性的精确敏感方法.
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抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移
目的 探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础.方法 采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析.结果 刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链 CDR3序列.结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定.将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础.
