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布地奈德降低哮喘小鼠肺中去整合素-金属蛋白酶33表达
去整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM33)与哮喘气道的损伤修复有着密切的关系.布地奈德(budesonide,BUD)是临床治疗哮喘应用较广泛的糖皮质激素,其能否通过干预ADAM33的表达来干预哮喘气道重塑,目前相关的报道较少.本研究观察BUD干预对慢性哮喘小鼠模型中肺组织ADAM33表达水平的影响,探讨其对小鼠哮喘气道重塑的干预作用.
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去整合素和金属蛋白酶10与阿尔兹海默病的研究进展
去整合素和金属蛋白酶（ a disintegrin and metalloprotease ， ADAM）家族为一个包含了三十多个成员的家族，它们在细胞黏附、细胞迁移、白细胞募集、炎症、蛋白水解等方面发挥各自的作用［1］。 ADAM10为ADAM家族中一员，早从牛的脑髓鞘膜中分离纯化所得，当时被称为哺乳动物整合素金属蛋白［2］，其后实验发现其为细胞质髓鞘碱性蛋白酶［3］；随后的研究显示 AD-AM10在人的大脑［4］及外周结构［5］均有表达；而在过表达AD-AM10 cDNA的HEK293细胞中首次证实ADAM10具有切割APP的α分泌酶活性［6］。其后，Postina等［7］将阿尔兹海默病（Alzhei-mer disease，AD）小鼠与ADAM10转基因小鼠杂交，发现小鼠脑内淀粉样斑块明显减少，而α分泌酶切割淀粉样前体蛋白（ amy-loid precursor protein ，APP）所产生的可溶性片段APPsα增多，杂交小鼠的学习及记忆能力均有所增强；与此相反，ADAM10突变小鼠的APPsα减少，淀粉样斑块增多，学习能力降低［8］。上述结果表明，ADAM10是一种功能性的分泌酶，其对APP的加工可抑制淀粉样斑块的形成。
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去整合素-金属蛋白酶17与动脉粥样硬化发病机制的研究进展
心脑血管疾病是严重威胁人类生命健康及生活质量的常见病,其发病率和死亡率一直居高不下,并随着经济发展呈上升趋势.动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是其中一些常见病(如冠心病、脑梗死)的共同病理基础,在疾病的发生、发展中起关键作用.以往认为AS是由血脂代谢紊乱、脂质病理性沉积所致,目前许多研究表明,炎症在AS发生、斑块形成、不稳定斑块转变中发挥着重要作用[1].近年来研究发现去整合素-金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase,ADAMs)家族在血管病理及生理过程中发挥重要作用,其家族成员ADAM17作为多种细胞因子活化裂解的关键酶,参与血管病理生理.
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尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析
目的:获得尖吻蝮蛇去整合素基因,并分析重组蛋白生物学活性.方法:提取尖吻蝮蛇毒腺组织总RNA,经RT-PCR获得去整合素基因片段,将该去整合素基因片段重组入pMAL-p2x载体中诱导表达,以直链淀粉树脂柱亲和纯化,并检测融合蛋白的抑制血小板聚集活性.结果:该片段编码的氨基酸序列中含有去整合素保守的RGD三肽序列及12个Cys残基,与GenBank中其他蛇毒去整合素氨基酸序列高同源性为86%,重组融合蛋白具有抑制ADP诱导的血小板聚集活性.结论:发现了一个新的去整合素基因,该基因编码蛋白具有抑制血小板聚集的功能.
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蛇毒蛋白与血小板血栓形成
多种蛇毒蛋白具有与血小板表面整合素、膜糖蛋白I b(GP I b)或血管性血友病因子(VWF)相互作用而影响血栓形成的功能.影响血小板血栓形成的蛇毒蛋白目前分为3类:去整合素、VWF调节蛇毒蛋白及GPI b结合蛋白.其中,去整合素具有高效抑制血小板聚集的功能；VWF调节蛇毒蛋白具有体外介导VWF依赖型血小板聚集的功能；而GPI b结合蛇毒蛋白又分为2组:GPI b激动剂和GPI b拮抗剂,分别起诱导血小板聚集与抑制VWF介导的血小板聚集的功能.本文将对上述影响血小板血栓形成的蛇毒蛋白的结构、功能及其在临床上的研究与应用进行综述.
关键词： 蛇毒蛋白 血小板血栓形成 去整合素 VWF-调节蛋白 GP I b结合蛋白 -
精子去整合素和卵子整合素在受精过程中的作用
迄今为止的研究揭示了许多能介导精卵相互作用的分子.精子至少有三种去整合素(α-受精素、β-受精素和Cyritestrin)可介导精卵的结合;在卵子方面则有多种整合素.α-6/β-1整合素似乎能作为β受精素的受体发挥功能.同时,其它一些精子去整合素及精子表面的其它整合素也可能与α-6/β-1这一受体结合.而β受精素也能与其它一些受体结合.α受精素含有一个去整合素结构域,其胞外段的另一部分与卵子胞膜的相互作用有关,提示它也可能具有多个受体.
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基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对人肝癌细胞系SSMC7721增殖、凋亡和侵袭的影响
[目的]研究基因重组白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对SSMC7721 细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.[方法] 用Hoechst33258试剂盒染色,观察Adinbitor对细胞形态的影响;Western-blotting 检测浓度梯度Adinbitor作用下Caspase-3表达情况,分光光度法考察Caspase-3活化程度;MTT法检测Adinbitor对细胞增殖的作用,Transwell及Matrigel检测其对细胞侵袭的影响.[结果]Hoechst染色显示Adinbitor可明显促进细胞凋亡.在Adinbitor作用下,胞浆Caspase-3含量减少,活化程度增高,活化倍数2.24～3.85.Adinbitor可明显抑制SSMC7721细胞增殖,IC50为0.296 μmol,也可抑制细胞侵袭能力.[结论] 基因重组Adinbitor可明显抑制SSMC7721细胞的增殖及侵袭,并且可通过活化Caspase-3促进细胞凋亡.
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绿色荧光蛋白-去整合素融合蛋白的表达及其结合功能的研究
目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)-去整合素(disintegrin)融合基因,表达并分析该重组蛋白的生物学活性.方法:利用HF-PCR扩增Ⅱ型蛇毒出血性金属蛋白酶agacutin基因的去整合素区,并与绿色荧光蛋白基因进行拼接;将GFP-去整合素融合基因克隆入表达载体pQE-30,IPTG诱导重组蛋白表达;流式细胞术(FCM)与荧光显微镜分析重组蛋白与细胞的结合能力.结果:GFP-去整合素融合蛋白的表达载体在大肠杆菌M15中得到有效表达,菌体呈绿色.表达的蛋白量占菌体总蛋白的38%左右,免疫印迹证实分子量约为39kD;FCM分析显示该重组蛋白可与表达整合素的乳腺癌细胞MDA-MB-231和内皮细胞EA.hy926特异结合,在荧光显微镜下可见与重组蛋白结合的细胞发出绿色荧光.结论:GFP-去整合素融合蛋白可与表达整合素的细胞结合,并保留了各自的生物学活性,可用作肿瘤与血管生成等研究的新的分子标记物.
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去整合素Kistrin对兔眼LECs增殖的抑制
目的 探讨不同浓度的去整合素Kistrin对兔眼后发性白内障(Posterior capsular opacification,PCO)发生过程中晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)增殖的抑制作用,以明确Kistrin的眼内有效浓度.方法 制备兔眼PCO模型,行白内障摘除术,术毕3个实验组前房分别注入40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L的Kistrin,对照组前房注入林格氏液.术后在裂隙灯显微镜下观察PCO发生情况及形态,于术后14 d及3个月时取材,分别检测晶状体囊膜上LECs增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达.结果 术后第14天实验组LECs的PCNA表达均较对照组降低(P<0.05);第3个月时仅80 μg/L组较对照组明显降低(P<0.05);两个时间点80 μg/L组LECs的PCNA表达均较其余实验组明显降低(P<0.05),40 μg/L组与160 μg/L组间无显著性差异(P>0.05).同一浓度术后第14天与3个月时LECs的PCNA表达比较,仅80 μg/L组差异无显著性,余三组比较差异有显著性.结论 80 μg/L Kistrin术后早期及3个月均可有效地抑制兔眼PCO的发生,可作为进一步研究去整合素抑制PCO形成研究的较适宜浓度.
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蛇毒金属蛋白酶及去整合素的结构与功能
金属蛋白酶和去整合素是大多蛇毒的重要组成成分，大分子的金属蛋白酶简称MDC酶，其由N末端金属蛋白酶结构域、类去整合素结构域和一个C末端的富半胱氨酸结构域组成；去整合素是小分子量的含有RGD序列并富含半胱氨酸的非酶多肽。 MDC酶的去整合素结构域虽然不具有RGD模体，但其与去整合素有很高程度的结构同源性，并能识别细胞表面受体整合素、抑制整合素依赖的细胞之间的相互作用。 ADAM家族蛋白是发现与哺乳动物细胞的膜结合MDC酶，其与可溶性蛇毒MDC酶密切相关。这组膜锚定哺乳动物AD-AM家族蛋白在结构上同样具有一个去整合素结构域和一个金属蛋白酶结构域（ A Disintegrin And Metallopro-teinase domains ），故简称为ADAM家族蛋白。 ADAM家族参与细胞表面分子的脱落，一些蛇毒MDC酶也有这一属性。
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白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体的构建及其功能检测
目的 构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制.方法 重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列.表达并纯化突变体蛋白.血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响.结果 双酶切、PCR及测序证实突变体构建止确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上.野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能.结论 已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制.抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础.
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去整合素金属蛋白酶家族与肿瘤的关系的研究进展
去整合素金属蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteinase,ADAMs)为Ⅰ型跨膜蛋白(含锌蛋白酶总家族),也称为金属蛋白酶解聚素(metalloproteinase-like,disintegrin-like,cysteine-rich,MDC),是一类锚定于细胞膜表面的糖蛋白家族,可以促进肿瘤的增殖、侵袭及转移[1].目前发现的ADAM已超过30种[2].1 ADAM家族的结构特征该家族成员通常由800～1200个氨基酸组成,含有多个结构域,分别是N末端信号域、前导域、类金属蛋白酶功能域、去整合素功能域、半胱氨酸富集域、类表皮生长因子功能域、锚定于细胞膜上的跨膜域和C端的胞质尾区[3].
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白眉蝮蛇去整合素rAdinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞黏附与增殖的影响
背景与目的:蛇毒去整合素是一类从多种蛇毒和水蛭中分离到的含RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体的小分子蛋白质,其由于能竞争性地结合细胞表面的整合蛋白受体,阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,从而发挥抗肿瘤转移的作用.rAdinbitor是我实验室采用基因克隆方法从大连产白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffi brevicaudus)的毒腺中获得的一种含有RGD模体的去整合素.本实验的目的是探讨rAdinbitor对人肝癌细胞系SMMC-7721黏附、增殖的抑制作用,为rAdinbitor抗肿瘤转移的作用机制提供实验依据.方法:以细胞黏附实验观察纤连蛋白(FN)基质对SMMC-7721细胞黏附的影响.分别采用结晶紫染色法和MTT比色法测定重组蛋白rAdinbitor对SMMC-7721向FN黏附的影响,及对已黏附于FN上的SMMC-7721的影响.以MTT比色法检测不同浓度的rAdinbitor对SMMC-7721细胞增殖的影响;HE染色观察200μg/ml Adinbitor诱导SMMC-7721细胞36h凋亡的形态变化;采用流式细胞仪检测rAdinbitor对细胞凋亡的诱导作用.结果:① rAdinbitor对SMMC-7721细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用,并呈浓度依赖关系,25、50、100、200μg/ml浓度组rAdinbitor的黏附抑制率分别为4.90% 、11.73%、 22.84%、 37.28%,各组差异有显著性(P＜0.05).② rAdinbitor作用后,已黏附的SMMC-7721细胞变圆、脱落,各浓度组黏附细胞的存活率的平均值分别为98.89%、 90.01%、 63.37%、 35.13%,细胞的增殖受到明显抑制(P＜0.05).③ rAdinbitor对SMMC-7721细胞的增殖具有较强的抑制作用,且随着药物浓度的增加,其抑制作用增强(P＜0.05).rAdinbitor对SMMC-7721细胞作用48h的IC50值为177.83μg/ml.④ 200μg/ml rAdinbitor作用SMMC-7721细胞36h呈现早期细胞凋亡的形态改变,凋亡率达20.68%,明显高于未经处理的对照组的2.38%(P＜0.05).结论:重组白眉蝮蛇去整合素rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC-7721细胞在FN上的黏附,并促使已黏附的SMMC-7721细胞脱落,剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡.
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去整合素抑制体外培养人晶状体上皮细胞增殖的研究
目的探讨去整合素Kistrin(disintegrin kistrin)对体外培养的人眼晶状体上皮细胞(human lensepithelial cells,HLECs)增殖的抑制作用.方法对先天性白内障患者术中环行撕前囊膜,进行原代培养并传代,取第二代细胞用于实验.增殖抑制实验:将悬浮的活细胞接种于涂有鼠尾胶原的96孔培养板,16 h后,去掉旧培养液,换用不同浓度的去整合素(5 ng/ml、10 ng/ml、20ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml)37℃、5%CO2条件下共同孵育,7 d后,MTT法测定晶状体上皮细胞的数目.结果20ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml的去整合素对体外培养的晶状体上皮细胞的增殖进行干预后,OD值分别为0.254±0.008、0.224±0.009,0.202±0.010,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论去整合素可抑制体外培养的人眼晶状体上皮细胞的增殖.
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蛇毒金属蛋白酶及去整合素的结构与功能
蛇毒金属蛋白酶是蛇毒主要功能性蛋白质之一,它直接作用于局部组织的毛细血管,影响毛细血管内皮细胞与基底膜之间的相互作用;蛇毒去整合素与蛇毒金属蛋白酶来自共同的前金属蛋白酶原,这些酶原都含有4个共同的结构域:信号肽、前导肽、蛋白酶结构域、间隔区.去整合素因能特异性识别整合素而得名,蛇毒去整合素为低分子量蛋白质,含有多个Cys残基,它能阻断整合素与其配体的结合,抑制整合素介导的细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附反应,在血小板聚集、感染、炎症反应、肿瘤转移等病理过程中发挥重要作用.
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精子去整合素和卵整合素研究进展
精卵细胞间相互作用涉及精卵相互结合及配体膜的融合.在精卵表面存在多种分子参与配体膜的相互作用.总结介导哺乳动物精卵配体膜结合或融合的受精素α、受精素β、Cyritestin和卵细胞整合素α6/β1等分子的研究现状和趋势.
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重组人ADAM15去整合素区域蛋白抑制肿瘤细胞增殖作用的研究
观察重组人ADAM15去整合素区域蛋白干预肿瘤细胞增殖效应,为研究其作用机制提供基础.采用SRB法筛选重组人ADAM15去整合素区域蛋白敏感肿瘤细胞,分析其剂量依赖关系.利用流式细胞仪分析重组人ADAM15对肿瘤细胞周期的影响,并利用DAPI染色检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用.重组人ADAM15去整合素区域蛋白对于观察的8种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用,其中人宫颈癌细胞Hela及野生型乳腺癌细胞MCF-7为敏感,IC50分别为2.97,2.90 μmol/L,当其浓度低于8μmol/L时,细胞增殖抑制率与蛋白浓度呈剂量依赖关系.选择Hela细胞进行周期检测发现,重组人ADAM15去整合素区域蛋白浓度高于2μmol/L时,Hela细胞周期开始出现S期阻滞,G2/M期含量下降,并出现核凋亡现象.当蛋白干预浓度达6μmol/L时,(53.57±1.43)％的Hela细胞出现凋亡.重组人ADAM15去整合素区域蛋白通过阻滞细胞分裂和诱导凋亡抑制肿瘤细胞的增殖.
关键词： 去整合素 去整合素及金属蛋白酶家族15 增殖 细胞周期 凋亡 -
竹叶青素的基因合成、原核表达及生物学功能的初步研究
目的 合成竹叶青素trigramin基因,在原核系统中表达、纯化,对其功能进行初步研究.方法 缓慢退火-PCR法合成竹叶青素基因并克隆入原核表达载体;IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;常规柱层析和HPLC纯化天然竹叶青素;Born法测定竹叶青素对血小板聚集的抑制能力;CCK-8法测定竹叶青素对细胞增殖的影响;划痕实验分析竹叶青素对细胞运动的影响.结果合成了竹叶青素基因并在大肠杆菌中表达;获得纯度为89.1%的重组竹叶青素;重组竹叶青素抑制血小板聚集的IC50为0.78 μmol·L-1,而天然竹叶青素为0.35 μmol·L-1;竹叶青素不能抑制肿瘤细胞增殖,但可抑制细胞体外运动能力.结论 本研究成功合成竹叶青素基因并在大肠杆菌系统进行了有功能的表达和纯化,竹叶青素可抑制肿瘤细胞体外运动.
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整合素-β1在转化生长因子-β2诱导晶状体上皮细胞转化中的作用
目的 探讨整合素-β1(integrin β1)在转化生长因子-β2( TGF-β2)体外诱导晶状体上皮细胞(HLECs)向肌成纤维细胞转化中的作用.方法 体外培养的HLECs,选择传3代的细胞进行实验,以TGF-β2作为诱导剂.免疫荧光方法检测HLECs integrin β1、E-cadherin、α-SMA和F-actin的表达,RT-PCR方法检测E-cadherin和α-SMAmRNA的表达.其中部分细胞预先加入去整合素kistrin孵育1h,再加入TGF-β2刺激细胞48h.结果 TGF-β2处理晶状体上皮细胞后,integrin β1、α-SMA和F-actin的表达明显增强,细胞E-cadherin表达明显减弱.加入去整合素kistrin后,细胞α-SMA和F-actin的表达明显减弱,细胞E-cadherin表达明显增强.结论 TGF-β2诱导了HLECs转分化,整合素-β1参与了TGF-β2诱导的HLECs向肌成纤维细胞的转化过程.
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去整合素echistatin对糖尿病兔后发性白内障形成中信号通路PI3-K/Akt和ERK1/2的影响
目的 观察去整合素echistatin对糖尿病兔后发性白内障形成中信号通路PI3-K/Akt和ERK1/2的影响,从分子水平上探讨echistatin的作用.方法 建立糖尿病兔模型(n=24),随机分组并行透明晶状体囊外摘出术,术毕前房分别注入0.2mL灭菌蒸馏水(对照组,n=12)或0.2 mL 10.0 mg·L-1 echistatin溶液(echistatin干预组,n=12).术后10 d及6周(每个时间点6眼),裂隙灯显微镜观察两组术眼PCO分级情况,同时摘取术眼应用RT-PCR法检测后囊膜上信号因子Akt和ERK1/2 mRNA表达情况.结果 术后10 d对照组和echistatin干预组PCO分级比较差异无统计学意义(P =0.093),但echistatin干预组PCO1级眼数少于对照组;术后6周echistatin干预组PCO级别明显低于对照组(P =0.006).对照组和echistatin干预组Akt mRNA相对表达量术后10 d分别为0.981 7±0.380 4、0.481 7±0.1665,术后6周分别为0.651 7±0.2047、0.401 7±0.151 3,echistatin干预组均明显低于对照组(P=0.015,0.037).对照组和echistatin干预组ERK1/2 mRNA相对表达量术后10 d分别为0.948 3±0.227 5、0.6100±0.280 6,术后6周分别为0.921 7±0.299 4、0.465 0±0.180 0,echistatin干预组均明显低于对照组(P =0.045,0.009).结论 去整合素echistatin对糖尿病兔后发性白内障的发生和发展有一定的抑制作用,其发生的机制可能与抑制信号因子Akt和ERK1/2表达,进而阻断信号通路PI3-K/Akt和ERK1/2的转导有关.
