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假基因PTENP1通过调控PTEN蛋白的表达影响胃癌进展的研究
目的：长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们缺乏蛋白编码的潜能。近年来,大量证据表明lncRNAs能以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达，从而在细胞增殖、细胞周期、分化和凋亡等多种生物学进程中发挥重要的作用。假基因转录得到的RNA也属于lncRNA的一类，以前被认为没有生物学功能，然而近一些假基因被证实在肿瘤的发生中发挥着关键的作用。PTENP1被发现在几种肿瘤细胞中发挥着抑癌作用，然而它在胃癌中的表达和生物学功能仍不清楚。本文主要研究胃癌组织和细胞系中PTENP1的表达水平及其与临床病理资料的关系，并探索PTENP1在胃癌细胞中发挥的生物学功能及相关机制。方法：通过实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测68例胃癌组织及4个胃癌细胞系中PTENP1的表达水平；通过去甲基化药物处理，研究PTENP1启动子异常甲基化与其表达的关系；分别转染pLJM-3'UTR或pLJM空质粒进入胃癌细胞系MGC-803及SGC-7901，通过CCK-8及平板克隆实验研究PTENP1对胃癌细胞增殖能力的影响，通过流式细胞分析及Hoechst staining实验研究PTENP1对细胞凋亡的影响，通过细胞划痕实验和transwell研究PTENP1对细胞迁移和侵袭能力的影响；通过qRT-PCR及Western blot分析质粒转染后PTEN的表达变化。结果：qRT-PCR检测结果显示PTENP1表达在胃癌组织和细胞系中显著下调，其表达下调可能部分与DNA超甲基化有关。而且，PTENP1的低表达与肿瘤的大小、胃癌病人临床分期、胃癌浸润深度及淋巴结转移有关。另外，结果显示PTENP1能够调节胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。并且，PTENP13'UTR的表达升高能够提高PTEN蛋白的表达水平。结论：PTENP1在胃癌中表达显著下调，并能通过调节PTEN蛋白的表达发挥抑癌作用。
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Caveolin-1与 E-cadherin表达与胃癌临床病理特征及EMT关系
目的：研究Caveolin-1与E-cadherin与胃癌临床病理特征及之间的关系，分析Caveolin-1与E-cadherin表达水平与胃癌细胞EMT之间的相关性。方法：应用免疫组织化学技术检测组织芯片中胃癌及癌旁组织Caveolin-1与E-cadherin蛋白表达。对Caveolin-1、E-cadherin表达与胃癌临床病理特征(临床分期、病理分级及转移)进行回顾性分析。应用Real-time PCR技术检测70例胃癌组织、5例正常胃黏膜组织以及多种不同胃癌细胞系(SGC-7901、AGS、MKN-28、MKN-45、BGC-803、HGC-823、KATOⅢ、HGC-27)中Cav-1与 E-cadherin mRNA的表达。结果：在正常胃黏膜组织中Caveolin-1与E-cadherin蛋白表达较高，在胃癌组织中表达下调，其表达水平分别与肿瘤临床分期、病理分级及转移状态有关，即Caveolin-1与E-cadherin在Ⅲ期和Ⅳ期胃癌中比在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌中表达降低；在III级胃癌比在I级和II级胃癌中表达降低；在有淋巴结转移或远处转移的胃癌中比在未转移的胃癌中表达降低。并且Caveolin-1与E-cadherin在胃癌组织中的表达水平有明显的相关性(r=0.35，P=0.003)。与正常胃黏膜细胞系GES-1相比，Cav-1与E-cadherin在多种人胃癌系(SGC-7901、AGS、MKN-28、MKN-45、BGC-803、HGC-823、KATOⅢ、HGC-27)中表达明显降低，且Cav-1与E-cadherin在转移来源的细胞系(SGC-7901、MKN-45、BGC-803、KATOⅢ、HGC-27)比在非转移来源的细胞系(AGS、MKN-28、HGC-823)中的表达水平更低。Cav-1与E-cadherin在未分化细胞系KATOⅢ中表达比在高分化细胞系MKN-28中表达显著降低。在E-cadherin相对高表达的上皮表型细胞系AGS中，Cav-1表达相对较高，而在间质表型的E-cadherin相对低表达的间质表型细胞系HGC-27中Cav-1表达相对较低。结论：Cav-1和E-cadherin表达水平的降低在胃癌进展中具有重要作用；Cav-1与E-cadherin表达呈正相关，Cav-1可能通过调控E-cadherin表达参与胃癌EMT和转移。
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TRAF1基因干扰质粒的构建及其对胃癌细胞生物学功能的影响
目的:构建TRAF1基因干扰重组质粒及建立TRAF1基因干扰瞬时转染胃癌细胞模型,然后通过干扰目标胃癌细胞中的TRAF1基因来检测TRAF1对胃癌细胞的生物学功能的影响.方法:首先通过real-time PCR和Western印迹验证TRAF1在胃癌细胞系BGC823,SGC7901,MGC803中的表达,筛选出TRAF1表达量高的一株细胞作为干扰转染的目标细胞；设计及构建3个TRAF1的shRNA表达载体pLVX-shRNA-TRAF1-shRNA1～3,将其分别转染至目标胃癌细胞系中,应用real-time PCR和Western印迹筛选出干扰效率强的shRNA,后通过MTF及流式细胞术检测TRAF1对胃癌细胞凋亡能力的影响,通过Transwell小室迁移实验来检测对其迁移功能的影响.结果:与GES-1比较,TRAF1基因在BGC823,SGC7901,MGC803中的表达均有上调(P＜0.05),其中以BGC823表达高；3个TRAF1 shRNA对TRAF1基因均有抑制作用,以pLVX-shRNA-TRAF1-shRNA2干扰效果强；干扰胃癌细胞BGC823 中的TRAF1可使细胞生长活力减弱,凋亡明显增加,但对其迁移功能无明显影响.结论:TRAF1基因在胃癌细胞系BGC823中上调明显；pLVX-shRNA-TRAF 1-shRNA2可成功干扰BGC823中TRAF1的表达；TRAF1可抑制BGC823细胞的凋亡.
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幽门螺杆菌CagA+菌株对BGC-823细胞系Cx43表达及细胞增殖的影响
目的:观察体外实验中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)CagA+菌株对BGC-823细胞系Cx43表达和细胞增殖的影响,以及抗H.pylori药物干预后的变化,探讨H.pylori CagA+菌株与胃上皮细胞Cx43表达和细胞增殖的关系. 方法:将H.pylori CagA+菌株(国际标准毒力菌株NCTC J99)和CagA-菌株(NCTC 12908)分别与BGC-823细胞按细菌/细胞比例20:1,100:1,500:1共培养24,48h,以及细菌/细胞比例100:1组共培养16h后予抗H.pylori药物;对照组不加H.pylori或不加药物.用细胞免疫化学链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法及计算机图像分析技术检测细胞Cx43表达变化;溴化-3(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑比色法检测细胞增殖情况.结果:(1)未加H.pylori的对照组培养48h Cx43表达高于24h(P＜0.05);加CagA+菌株不同比例组48 h时的Cx43表达均低于24h,且低于对照组,24及48h 500:1组均低于100:1组和20:1组,48h 100:1组低于20:1组(P＜0.05);而加CagA-菌株不同比例组48h与24h的Cx43表达比较差异无统计学意义(P＞0.05),24h 100:1组和500:1组均低于对照组,24及48h 500:1组低于20:1组(P＜0.05);抗H.pylori药物干预后48h Cx43表达增强.(2)加CagA+菌株培养24h,100:1组细胞增殖增强;培养48h,20:1组和100:1组细胞增殖增强,500:1组细胞增殖受到抑制(P＜0.05).而加CagA-菌株对细胞增殖无明显影响.抗H.pylori药物干预对细胞增殖有抑制作用.结论:H.pylori CagA+菌株明显下调BGC-823细胞Cx43表达,并与作用时间及H.pylori密度有关,H.pylori密度较低时促进细胞增殖,密度较高时抑制细胞增殖;H.pylori CagA-菌株对细胞增殖无明显影响.抗H.pylori药物干预可上调Cx43表达,抑制细胞增殖.
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胃癌细胞表面ALDH1表达及ALDH1+ 细胞的"干性"鉴定
目的 检测胃癌细胞系的乙醛脱氢酶1(ALDH1)表达,鉴定ALDH1+细胞生物学特性.方法 采用Aldefluor实验方法,通过流式细胞仪检测胃癌细胞系MGC-803、BGC-823及MKN-45中ALDH1的活性表达;选取MGC-803细胞系,分选出ALDH1+和ALDH1-细胞,进行分化潜能、平板克隆、耐药性、干性相关基因检测及裸鼠成瘤实验.结果 MGC-803、BGC-823及MKN-45中ALDH1的表达比例为(13.00±1.34)％、(5.80±2.15)％ 及(36.5±5.4)％;分选出ALDH1+、ALDH1-细胞组,含血清培养1周后,ALDH1+的表达比例为21.2％ 和3.9％,ALDH1+细胞具有不对称分裂能力;ALDH1+细胞组克隆形成率为(42.63±0.63)％,高于ALDH1-细胞组(18.5±2.04)％,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);相同氟尿嘧啶浓度下,ALDH1+组生长抑制率均低于ALDH1-组,差异有统计学意义(P<0.05);接种5×103个ALDH1+及ALDH1-细胞于小鼠皮下成瘤,与ALDH1-细胞比较,ALDH1+细胞成瘤率高.两组肿瘤体积比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 胃癌细胞系普遍存在ALDH1的活性表达,ALDH1+细胞具有干细胞生物学特性,可能提供胃癌新的诊断和治疗途径.
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整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用
目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶( integrin-linked kinase,ILK)反义寡核苷酸( antisense oligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株 SGC- 7901后对胃癌细胞的作用.方法 ( 1)应用脂质体将 ILK 的 ASODN导入胃癌细胞系 SGC-7901,以 RT-PCR及 Western印迹方法检测作用后胃癌细胞 ILK的 mRNA和蛋白水平的变化;( 2)应用 MTS法及流式细胞术评价 ILK 的 ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响.结果 ( 1)转染后胃癌细胞 ILK的蛋白表达水平明显下降 ,但 mRNA水平无明显变化;( 2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡.结论 ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株 SGC-7901后可以降低细胞内 ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡.
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胃癌细胞系中甲基化与叶酸干预对多种基因的调控
目的:研究人胃癌细胞系癌基因及抑癌基因甲基化作用.方法:培养3种人胃癌细胞系MKN-45、MKN-28、HGC-27,分别以不同浓度的甲基转移酶抑制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)和叶酸干预细胞.以RT-PCR方法检测p16INK4A、p21WAF1、p73、c-myc、c-Ha-ras等多种基因的表达情况.结果:抑癌基因中p16INK4A在干预前MKN-45和HGC-27细胞表达,MKN-45细胞在10 mol/L浓度24 h及72 h后p16INK4A表达增强,HGC-27细胞在5μmol/L和10 μxmol/L组24 h后表达增强.p21WAF1达水平没有改变.所有胃癌细胞系中叶酸干预及叶酸联合5-aza-dc干预前后所有基因的mRNA表达没有明显变化.结论:在人胃癌细胞系MKN-45和HGC-27细胞系中,p16INK4A的表达受DNA甲基化调控,但在MKN-28细胞系不存在这种现象.
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反义hTR对人胃癌细胞株SGC-7901恶性表型的逆转作用
目的探讨反义hTR基因转染对胃癌细胞系SGC-7901恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值.方法构建包含端粒重复序列模板区的反义hTR基因真核表达载体,用脂质体法将其转染至胃癌细胞系SGC-7901,比较观察反义hTR基因转染后7901细胞的hTR RNA表达、端粒酶活性、体外生长增殖特性和裸鼠体内致瘤能力的变化.结果反义hTR基因转染的7901细胞hTR RNA表达和端粒酶活性明显降低、体外生长增殖能力降低、接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失.结论反义hTR基因转染能使7901细胞的端粒酶活性明显下调并逆转其恶性表型,提示端粒酶是肿瘤治疗的较理想靶点,端粒酶抑制剂具有良好的临床应用前景.
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胃癌耐药细胞系BGC-823/CDDP耐药机制初步研究
目的:建立体外胃癌耐药细胞系BGC-823/CDDP模型,初步探讨对其耐药机制进行初步研究.方法:采用体外逐步增加顺铂药物浓度反复间歇诱导法,建立人胃癌顺铂耐药细胞系BGC-823/CDDP模型,并冻存3个月后应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其药物敏感性,免疫细胞化学法检测P-gp、p53、bcl-2、TOP-Ⅱ、GST-π蛋白在耐药细胞系BGC-823/CDDP的表达.结果:MTT法检测其药物敏感性表明,与亲代细胞BGC-823相比较,冻存后耐药细胞对CDDP的耐药倍数为 11.17倍,对丝裂霉素C(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)均有不同程度的耐药性,但其耐药性无明显变化.与亲代细胞BGC-823相比较GST-π在BGC-823/CDDP中的表达明显增高;P-gp、p53、bcl-2在两者表达均为阴性,TOP-Ⅱ在两者表达无明显变化.检测表明GST-π与人胃癌顺铂多药耐药有关.结论:建立了体外稳定耐药的人胃癌顺铂多药耐药细胞系BGC-823/CDDP,其具有交叉耐药性;GST-π与人胃癌顺铂多药耐药有关.
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OCT4基因在胃癌细胞系中的表达及其意义
目的 检测八聚体结合蛋白-4 (octamer-binding protein-4,OCT4)基因在不同分化程度的胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823)及正常胃黏膜细胞株GES-1中的表达情况,研究OCT4基因表达水平与胃癌细胞分化程度和侵袭力的相关性.方法 RT-PCR确定GES-1、MKN-28、SGC-7901、BGC-823中OCT4基因的表达水平,OCT4 siRNA转染BGC-823细胞,分别通过荧光定量PCR和Western blot检测干扰OCT4基因表达的效果,并利用Transwell小室法研究OCT4在BGC-823细胞侵袭力中的作用.结果 正常人胃黏膜细胞中未检测到OCT4的表达,人胃癌细胞系分化程度越低,OCT4基因表达量越高,低分化人胃癌细胞系BGC-823中OCT4基因表达高,转染OCT4 siRNA的BGC-823细胞内的OCT4 mRNA和OCT4蛋白表达量明显下降(P＜0.05).干扰胃癌细胞BG-823中OCT4基因的表达,穿膜细胞数量减少(P＜0.05),侵袭力下降.结论 OCT4基因表达量与胃癌细胞的分化程度有关,OCT4基因可能在胃癌细胞的分化中起重要作用,影响胃癌细胞的侵袭能力,其表达程度有望成为胃癌患者恶性度预测的参考指标之一.
关键词： 八聚体结合蛋白-4基因 胃癌细胞系 RNAi 分化程度 -
重楼复方与氟尿嘧啶对胃癌细胞的体外协同作用研究
目的:探讨重楼复方(Chong Lou Fu Fang, CLFF)与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)对胃癌细胞有无体外协同作用及CLFF对胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)基因表达和细胞凋亡的影响.方法:MTT法检测细胞增殖能力;基于中位效应原则的联合指数法评估CLFF与5-FU对胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的相互作用;Annexin-Ⅴ-FITC和PI双染色法检测细胞凋亡率;荧光定量RT-PCR法测定TS和β-actin mRNA表达.结果:CLFF在两株细胞中与5-FU均产生较好的协同细胞毒性,两药合用亦以协同方式诱导肿瘤细胞凋亡;CLFF作用24 h后,SGC-7901和BGC-823细胞中TS mRNA表达水平分别为对照组的(0.30±0.03)倍和(0.46±0.03)倍,用药前后两株细胞中TS mRNA表达水平具有统计学差异.结论:CLFF与5-FU有较好的协同抗肿瘤作用,可能与二者协同诱导肿瘤细胞凋亡以及CLFF可下调胸苷酸合成酶基因表达有关.
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绿色荧光蛋白基因标记的胃癌细胞系的建立
目的建立能连续传代稳定高表达绿色荧光蛋白(GFP)的胃癌细胞株,探讨胃癌的生长与转移特征.方法利用脂质体将携带GFP-cDNA的真核表达载体质粒转染胃癌细胞株GC9811-P,经过G418筛选和克隆化培养,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染的EGFP基因在癌细胞体内外的表达,MTT比色法观察细胞生长,Western blot检测转染细胞和未转染细胞肿瘤相关抗原的表达.结果携带EGFP的真核表达载体能有效地转染胃癌细胞GC9811-P,转染的细胞能稳定、高效和持久地表达EGFP,与未转染细胞比较,他们的生物学特性未改变(P>0. 05).在裸鼠皮下肿瘤中,EGFP也能稳定、高效的表达.结论胃癌GC9811P-GFP的建立为研究肿瘤侵袭和转移的发生机制提供了理想的细胞株.
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MS-275通过上调ROS释放选择性杀伤胃癌细胞
目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275通过线粒体凋亡途径，选择性杀伤胃癌细胞的具体作用机制。方法：MS-275分别处理GES-1、MKN-45细胞，通过WST-1法检测细胞存活率，分析MS-275细胞毒性及选择性杀伤作用；通过流式细胞术检测线粒体膜电位变化，及ROS抑制剂对MS-275凋亡诱导作用的影响；Western blot、PCR分别检测处理后胃癌细胞中p21、p57、cyclin D1、cyclin E1、和TBP-2的mRNA及蛋白水平表达情况。结果：MS -275对正常胃黏膜上皮细胞GES -1存活率无显著性影响，但对胃癌细胞MKN-45影响显著（P＜0．05）。MS-275对胃癌细胞MKN-45线粒体膜电位影响不显著，但能够诱导ROS显著升高，ROS抑制剂显著降低由MS-275诱导的ROS释放。MS-275显著激活肿瘤抑制基因p21、p57、TBP-2以及细胞周期蛋白相关基因cyclin D1、cyclin E1的表达。结论：MS-275通过促进细胞周期阻滞因子、凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因的表达，诱导ROS生成，选择性杀伤胃癌细胞。
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人U6启动子表达载体的构建及在胃癌细胞中的活性鉴定
目的 构建人U6(hU6)snRNA启动子驱动的小RNA分子的表达载体,并在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞中鉴定其表达外源性小RNA分子的活性.方法 以人基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hU6 snRNA启动子序列,并将其克隆入PUC19载体中,命名为PUC-hU6-extra,经测序证明其序列的正确性;用脂质体法转染SGC-7901细胞;用RT-PCR检测U6启动子的转录活性,并测定培养细胞的生长曲线.结果 hU6 snRNA基因启动子和紧接转录起始点hU6 snRNA的前27个核苷酸被成功地克隆入PUC19质粒载体,重组载体在SGC-7901细胞中能高表达小分子RNA,并且未观察到后者对细胞体外增殖的影响.结论 成功构建了以hU6 snRNA启动子驱动的、能在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞内高效转录小分子RNA的表达质粒PUC-hU6-extra.
