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雌激素受体α在雄性生殖中的作用
雌激素受体(estrogen receptor,ER)作为一种转录因子,是核受体蛋白超家族中的一员,它包括ERα和ERβ两种亚型.ERα在雄性生殖系统中广泛分布,通过配体依赖和非依赖途径对雄性生殖功能起着重要的调节作用.本文主要综述ERα的分子结构、作用方式以及其在雄性生殖系统内的分布,并通过对ERα相关的动物模型的分析,探究ERα在调控雄性生殖系统中的作用机制.
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SD大鼠胚胎体外培养及TALEN质粒内源活性检测的研究
目的 建立Sprague-Dawley (SD)大鼠1-细胞胚胎体外培养体系,并用于TALEN质粒内源活性检测.方法 超排4～6周龄雌鼠,取0.5 dpc雌鼠受精卵.将构建的TALEN质粒体外转录为mRNA后显微注射于受精卵胞质中,将注射成功的受精卵培养于mR2ECM培养液中.巢式PCR扩增目的基因,送测序检测TALEN质粒的敲除效率.结果取出的1-细胞胚胎在mR2ECM培养液中大程度能发育到8-细胞胚胎;培养液的pH值影响了胚胎的发育程度,过滤前pH值7.18±0.12的培养液,胚胎8细胞发育率较高.本研究送检三批显微注射后体外培养的胚胎,检测结果表明胚胎发育至4细胞以上时,mRNA已经能够充分表达和发挥敲除作用,TALEN质粒的敲除效率为(9.3±2.8)％.结论 建立SD大鼠l-细胞胚胎体外培养的体系,且将其成功应用于TALEN质粒内源活性检测.
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雄激素受体敲除后雄性小鼠的泌尿生殖系统表型
目的了解敲除雄激素受体(AR)后雄性小鼠的泌尿生殖系统表型. 方法采用Cre-lox技术,雌性Flox-AR小鼠与雄性ACTB-Cre小鼠交配, PCR方法检测子代小鼠尾巴的基因型,筛选出AR敲除小鼠5只,5只AR未被敲除的小鼠作为对照.比较2组小鼠的泌尿生殖系统表型,测量肛门生殖器距离、睾丸重量、血清睾酮及雌二醇浓度. 结果 AR敲除(ARKO)组小鼠肛门生殖器距离为(0.5±0.1)cm,对照组为(1.1±0.1)cm.ARKO组前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌均缺如,睾丸显著缩小,重量(0.006±0.001)g;对照组前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌发育正常,睾丸重量为(0.086±0.002)g.ARKO组血清睾酮浓度(0.056±0.045)nmol/L,雌二醇浓度(1390.1±294.3)pmol/L,对照组睾酮浓度(0.843±0.736)nmol/L;雌二醇浓度(786.2±150.8)pmol/L.差异均有统计学意义(P<0.05). 结论敲除雄激素受体后,小鼠前列腺、精囊、附睾及球海绵体肌缺如,睾丸缩小,雄激素水平降低,雌激素水平升高,提示AR在雄性小鼠泌尿生殖系统发生及雄激素水平调节中发挥重要作用.
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雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能工能及63表达的改变
目的 研究雄激素受体(AR)敲除小鼠睾丸生精功能的变化及曲细精管的p63表达.方法 采用Cre-lox方法筛选出8只AR敲除小鼠,8只AR未被敲除的Wistar雄性小鼠作为对照,Makler评分测定睾丸曲细精管的生精功能,免疫组织化学方法检测小鼠睾丸曲细精管p63的表达.结果敲除组小鼠曲细精管内径为(60.0±2.5)μm,未敲除组为(92.0±2.0)μm,2组管周膜厚度分别为(4.0+0.7)和(2.8±0.9)pm,细胞层次分别为(2.0±0.3)和(4.05±0.2)层,生殖细胞成熟障碍评分分别为(3.05±1.2)和(5.0±0.5)分,Makler评分分别为(8.05±0.3)和(16.0±0.5)分,2组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).AR敲除组小鼠p63表达显著低于正常Wistar组,且表达定位于精原细胞及精母细胞阶段.结论 AR敲除小鼠睾丸生精功能受损,p63表达下降主要影响生殖细胞的早期分化.
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Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化
目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系，检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒，进行慢病毒包装，感染HCT116细胞，嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平，筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确，蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强，Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系，便于后期Apak功能的研究。
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利用免疫亲和色谱柱特异性敲除甘草酸的方法学研究
目的 制备特异性敲除甘草酸的免疫亲和色谱柱.方法 抗甘草酸单克隆抗体与CNBr活化的Sepharose 4BTM凝胶偶联制备甘草酸特异性敲除免疫亲和色谱柱,利用HPLC法测定敲除液与洗脱液中甘草酸质量浓度,考察甘草酸免疫亲和色谱柱的大载样量、敲出率、精密度、准确度及稳定性等参数.结果 甘草酸免疫亲和色谱柱的大载样量为1.326 11 mg;日内及日间精密度总RSD分别为0.65％,相对误差(RE)为0.37％;免疫亲和色谱柱稳定性实验显示32 d内甘草酸敲除率的RSD为1.37％,稳定性良好.结论 制备的甘草酸特异性敲除免疫亲和色谱柱能快速、高效、稳定地敲除甘草酸.
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利用CRISPR-Cas9系统鉴定丙型肝炎病毒感染必需的胞内宿主因子
目的 鉴定丙型肝炎病毒(HCV)感染过程必需的胞内宿主因子,为发现新的抗病毒靶点提供科学依据.方法 利用涵盖19 050个人类基因的CRISPR-Cas9文库小向导RNA(sgRNA)慢病毒感染人肝癌细胞Huh7.5(共计1×108个细胞),然后利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记筛选出成功敲除基因的细胞克隆群,再将细胞克隆群感染HCVJFH1株(感染复数为0.30),通过与未敲除的Huh7.5细胞(对照组)感染水平比较,筛选获得较对照组感染水平明显降低的细胞克隆群.后通过Illumina测序获得该克隆被敲除的基因序列,利用短发夹RNA(shRNA)技术对单个基因分别验证,明确HCV感染必需的胞内宿主因子.结果 利用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素抗性标记成功筛选出经CRISPR-Cas9文库敲除基因的细胞克隆,利用免疫荧光检测获得了与对照组相比HCV感染水平明显下降的细胞克隆,将这些克隆进行Illumina测序,结果提示至少存在10个可能与HCV感染水平降低相关的基因.shRNA敲低单个基因验证结果显示,与未敲除的Huh7.5细胞相比,单独敲低MTCP1和RPS14基因的Huh7.5细胞的HCV感染率均降低,差异均具有统计学意义(均P＜0.05),表明MTCP1和RPS14是HCV感染必需的两个胞内宿主因子.结论 建立了利用CRISPR-Cas9系统鉴定HCV感染必需的胞内宿主因子的新方法,筛选出了MTCP1和RPS14这两个HCV感染必需的胞内宿主因子,为深入研究其作用机制奠定了基础,也为发现新的抗病毒靶点提供了科学依据.
关键词： CRISPR-Cas9 丙型肝炎病毒 宿主因子 敲除 -
P-JNK在A2AR敲除新生小鼠HIBD细胞凋亡中的表达研究
目的:探讨腺苷A2A受体(A2AR)敲除的新生小鼠在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马CA1区磷酸化c-jun氨基末端激酶(P-JNK)激活的动态变化及其与神经细胞凋亡的关系.方法:参照经典Rice-Vannucci法建立7日龄新生小鼠HIBD模型.A2AR敲除(KO)小鼠及同窝野生型(WT)小鼠80只,设假手术(S)组,模型组(M)分1d,3d,7d,共8小组.采用三种发育反射(翻正反射、趋地反射和悬崖逃避反射)对小鼠进行短期神经功能评定,苏木精-伊红(HE)染色、尼氏染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUJNEL)染色法观察敲除A2AR对新生小鼠HIBD后神经细胞凋亡的影响,免疫组化检测P-JNK阳性细胞的表达.结果:敲除A2AR加重HIBD模型小鼠神经功能缺损、脑组织病理学损伤,增加神经细胞凋亡；HIBD后缺血侧海马CA1区P-JNK阳性细胞的表达迅速增加,与S组比较均有显著差异(P＜0.01),模型组于1d达高峰,且在相应的时间点(1d,3d,7 d)KO组P-JNK阳性细胞的表达显著高于WT组(P＜0.01,P＜0.05,P＞0.05)；直线相关分析表明新生小鼠HIBD后神经细胞凋亡与P-JNK阳性细胞的表达呈显著正相关(r=0.837,P＜0.01).结论:敲除A2AR增加新生小鼠HIBD神经细胞的凋亡及加重脑损害的过程,其作用机制可能与早期P-JNK的持续激活有关.
关键词： 腺苷A2A受体 敲除 磷酸化c-Jun氨基末端激酶 细胞凋亡 缺氧缺血性脑损伤 -
neuroplastin 65敲除对小鼠学习与记忆功能的影响
目的 研究neuroplastin 65(NP65)对小鼠学习与记忆功能的影响.方法 利用基因打靶获得NP65(-/-)的C57BL/6小鼠.培养新生鼠的海马神经元48 h,观察神经元神经突起的生长及免疫染色观察MAP-2、NP65的表达;培养海马神经元96 h,观察神经元活性;成年小鼠脑组织切片,尼氏染色、MAP-2及GFAP的免疫染色观察神经元及星形胶质细胞.Morris水迷宫实验观察小鼠的学习能力与空间记忆的改变.结果 培养的NP65(-/-)小鼠海马神经元仅表达MAP-2,不表达NP65;与野生型相比,NP65(-/-)小鼠的海马神经元的长的突起变短但初级突起的数目增加.脑组织切片尼氏染色显示,NP65(-/-)小鼠海马神经元的密度比野生型大,NP65(-/-)小鼠海马区MAP-2表达较野生型增加;GFAP阳性的星形胶质细胞数量比野生型多.NP65(-/-)小鼠的海马神经元不表达NP65.水迷宫实验显示NP65(-/-)小鼠的逃逸时间比野生型短、穿越平台次数的比野生型多.结论 NP65(-/-)影响海马神经元突起生长;NP65敲除提高了小鼠的学习与空间记忆能力.
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miR-34a敲除对小鼠大脑发育和行为的影响
miR-34a是一种进化保守并在脑中高表达的miRNA,已有研究显示其可能参与调控神经干细胞增殖和分化、神经元成熟和凋亡、恐惧记忆巩固等脑发育和功能的多个重要方面,但内源性miR-34a缺失是否显著影响脑正常发育和功能尚属未知.在本研究中,我们对miR-34a全敲除小鼠模型进行检测,发现miR-34a的缺失不影响成年鼠脑的重量、基本结构、大脑皮层的分层及其中几类主要类型的兴奋性和抑制性神经元的数量和分布,也不影响恐惧记忆的巩固及焦虑和抑郁样行为,但对小鼠的运动协调能力有一定影响.由于miR-34a在大脑皮层小清蛋白(parvalbumin,PV)亚型抑制性神经元中特异高表达,我们利用PV-Cre对miR-34a进行了条件敲除,但并未观察到这类神经元数量与分布的改变.我们的研究证明,miR-34a虽然参与调控小鼠大脑发育和行为的特定方面,但并非是调控大脑结构分区与皮层分层形成、皮层主要神经元类型产生与维持、恐惧记忆形成与巩固所必需的关键因子.
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微生物3-甾酮-△1-脱氢酶的研究进展
3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDH)属于黄素蛋白酶类,位于细胞膜上,能在3-甾酮化合物的C1和C2之间引入双键,提高原有底物的抗炎活性,在甾体药物的生产上发挥着重要作用.文章对已报道的不同微生物来源的KSDH进行比较分析,着重介绍了关于KSDH基因表达和敲除方面的研究,并对该酶在甾体转化方面的应用做一简要总结.
关键词： 3-甾酮-△1-脱氢酶 表达 敲除 甾体转化 -
粘细菌转录因子FruA结合蛋白敲除分析
目的:构建粘细菌发育特异性转录因子FruA相关蛋白FruB的敲除菌株,初步阐明FruB在粘细菌发育周期中的作用.方法:在fruB基因中央编码区插入四环素抗性基因,导入野生型粘细菌DZF1后通过双交叉同源重组途径阻断基因组内fruB的功能.结果:抗性筛选和PCR检测显示分离出了fruB基因阻断菌株fruB::TcΩ2.fruB功能缺失延缓子实体的发育及营养细胞向粘孢子分化.结论:fruB与粘细菌发育分化存在相关性.
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牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建
目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ (FtsZPg)体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.
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基因敲除模型与药物作用新靶点的发现
基因敲除技术是近年来发展起来的一种新兴的技术.它运用分子生物学的手段去除某一特定的基因制成基因敲除动物模型,通过这一模型来探究疾病的发病机制和病理特征,为疾病的预防、诊断和治疗提供依据.这一技术被成功地用于药物作用新靶点的发现,为疾病的治疗提供全新的机制.本文回顾了近年来基因敲除技术的新研究进展,指出基因敲除技术将对创新药物的发现产生极大的促进作用,具有巨大的潜力,在某些疾病的治疗手段方面可取得突破性进展.
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基于episomal CRISPR/Cas9载体的基因敲入方法
[目的]研究一种在哺乳动物细胞中高效的基因敲入方法,比较带有oriP-EBNA1序列的episomalCRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体的基因敲入效率是否有差别.[方法]首先利用慢病毒载体构建稳定表达红色荧光蛋白DsRedE2的人胚肾细胞系(293FT)与人诱导多能干细胞系(hiPS);利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计和合成靶向DsRedE2的向导RNA(sgRNA),分别克隆至带有oriP-EBNA1的episomal CRISPR/Cas9敲除载体与普通CRISPR/Cas9敲除载体中,测序筛选插入正确片段的克隆;然后设计靶向DsRedE2的同源臂,把同源臂连接在绿色荧光蛋白(GFP)的两端,构建GFP敲入片段的载体.把两种敲除载体分别导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间点通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲除效率,同时利用PCR检测靶基因的敲除情况;在筛选获得有效的sgRNA片段后,把两种敲除载体和同源臂同时导入到DsRedE2-293FT与DsRedE2-hiPS细胞系中,在不同时间通过荧光显微镜观察以及流式细胞分析比较细胞的敲入效率,同时利用PCR检测DsRedE2序列中GFP的敲入情况.[结果]成功构建表达DsRedE2的293FT与hiPS细胞系;获得靶向DsRedE2的episomal CRISPR/Cas9敲除载体、普通CRISPR/Cas9敲除载体及带有GFP的同源臂载体;荧光显微镜观察与流式细胞分析结果显示,转染两种CRISPR/Cas9质粒均可以使DsRedE2阳性细胞明显减少,而且episomal CRISPR/Cas9质粒组的DsRedE2阳性细胞数量显著低于转染普通CRISPR/Cas9质粒组.同时,敲入实验证实episomal CRISPR/Cas9组的GFP阳性细胞数量比普通CRISPR/Cas9组更多;TA克隆测序证实打靶位点有敲除与敲入片段.[结论]episomal CRISPR/Cas9载体与普通CRISPR/Cas9载体在细胞上都能实现基因的敲除与敲入;带有oriP-EBNA1序列的episomal CRISPR/Cas9载体敲除和敲入的效率均比普通CRISPR/Cas9载体高.以上结果为利用episomal CRISPR/Cas9载体进行人多能干细胞的基因敲入研究和谱系追踪动物模型的建立提供了重要的实验基础.
关键词： CRISPR/Cas9 Episomal载体 敲除 敲入 -
SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠
目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察大鼠的出生率,并测序判定出生大鼠的基因敲除阳性率.结果 4～5周和5～6周的雌鼠超数排卵见栓率[(74±9)％vs(77±6％)％]、取卵数量[(25±2)枚vs (23±2)枚]以及卵的受精率[(85±2)％vs(93±2)％]差异均无统计学意义(P＞0.05);结扎公鼠和受体雌鼠在8～10周时见栓率高[(23.02±5.26％)％],使用12周后见栓率明显下降[(11.66±2.40)％];单侧和双侧输卵管移植大鼠出生率差异无统计学意义(37.88％ vs 36.49％),但单侧移植大鼠存活率高于双侧移植(37.88％ vs 20.27％,P＜0.05),且单细胞移植大鼠出生率显著高于双细胞移植.质粒注射浓度在20 ng/μl组大鼠基因敲除阳性率高(7.5％).结论 应用TALEN技术成功构建基因敲除大鼠,显微注射质粒浓度20 ng/μl时大鼠出生率不受影响且基因敲除阳性率高.
关键词： Sprague-Dawley大鼠 TALEN 显微注射 敲除 -
革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用
目的 构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性.方法 构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ4paⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-Sac Ⅱ-BgtⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段.载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性.结果 成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株.结论 本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的 基凶的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用.
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Neuroplastin65敲除通过调控中枢5-HT影响小鼠的焦虑样行为
目的:研究neuroplastin65(NP65)敲除对小鼠焦虑样行为的影响并初步探讨其机制.方法:成年NP65敲除(NPD65-/-)小鼠和同基因型背景的野生型(wild type,WT)小鼠,通过Western Blot鉴定NP65-/-小鼠;用旷场实验、探洞实验和埋珠实验检测小鼠的焦虑水平;ELISA检测小鼠海马、前额叶皮质和纹状体谷氨酸和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的含量;5-HT合成酶色氨酸羟化酶2(tryptophan hydroxylase 2,TPH2)免疫荧光染色观察小鼠脑干中缝核5-HT能神经元;Western Blot检测小鼠脑干TPH2的蛋白表达.结果:与WT小鼠相比,在旷场实验中,NP65-/-小鼠进入中心区的次数显著减少(P ＜0.001),中心区停留时间显著降低(P ＜0.001),运动总距离和平均运动速度无显著变化.探洞实验中,NP65-/-小鼠探洞次数显著增加(P ＜0.001)、探洞时间增多(P＜0.05)、后肢竖立次数减少(P＜0.01)和排便次数增多(P ＜0.001).埋珠实验中,NP65-/-小鼠掩埋潜伏期延长(P＜0.05),埋珠个数显著减少(P＜0.05).神经递质检测结果显示:NP65-/-小鼠海马、前额叶皮质和纹状体谷氨酸的含量不变,海马5-HT的含量显著减少(P＜0.05),但前额叶皮质和纹状体5-HT的含量没有显著性差异.免疫荧光染色观察到NP65-/-小鼠脑干中缝核TPH2阳性细胞数目显著减少(P＜0.05).Western Blot分析显示:NP65-/-小鼠脑干TPH2的蛋白表达量显著降低(P＜0.05).结论:NP65敲除导致小鼠表现出显著的焦虑样行为,可能与脑干中缝核TPH2表达减少而导致海马5-HT含量降低有关.
关键词： Neuroplastin neuroplastin65 焦虑 敲除 5-HT 中缝核 小鼠
