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原发性肝细胞癌中诱捕受体3的过度表达及临床意义
目的 探讨诱捕受体3(DcR3)蛋白在原发性肝细胞癌(HCC)中的过度表达及其临床意义.方法 应用免疫组织化学(二步法)检测72例HCC,85例非癌肝组织中DcR3蛋白的表达情况,并分析其与HCC临床病理特征的关系.结果 ①DcR3蛋白明确定位于肝细胞胞浆内;②HCC组织中的DcR3蛋白的阳性率为70.8%(51/72),明显高于非癌组织组29.4%(25/85)(P＜0.01);③HCC中临床TNM分期Ⅰ,Ⅱ期DcR3阳性率为59.5%(22/37),明显低于Ⅲ,Ⅳ期82.9%(28/35)(P＜0.01);④HCC中无转移组DcR3阳性率为58.8%(20/34),明显低于转移组100%(30/30)(P＜0.01);⑤DcR3蛋白的表达与门脉癌栓、包膜浸润、肿瘤结节数有关(P＜0.01),与年龄、性别、有无肝硬化、AFP水平及HCC分化程度无关(P＞0.05).结论 DcR3高表达在HCC的发生发展中起重要作用;检测DcR3蛋白指标有助于HCC诊断和判断患者预后.
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诱骗受体-3和Caveolin-1在肝癌中的表达及临床意义
目的:研究诱骗受体-3(decoy receptor 3,DcR3)和Caveolin-1在原发性肝细胞癌(以下简称为肝癌)组织中的表达情况.初步探讨两者与肝癌生物学行为之间的关系.方法:用免疫组化检测40例肝癌组织及其癌旁组织中DcR3及Caveolin-1蛋白的表达,观察两者与肝癌生物学行为的关系.结果:肝癌组织中DcR3和Caveolin-1的阳性表达率分别为77.5%和70.0%,明显高于癌旁组织(17.5%、37.5%).有HBsAg阳性及肿瘤直径大于5 cm的肝癌组织中DcR3阳性表达率分别高于HBsAg阴性及肿瘤直径小于5 cm者,差异有统计学意义(P<0.05).Caveolin-1在肝癌高、中分化组的表达率明显低于低分化组(P<0.01).结论:DcR3及Caveolin-1蛋白的表达与肝癌的生物学行为密切相关,并在肝癌组织发生发展过程中起着不同的重要作用.
关键词： 肝肿瘤 DcR3 Caveolin-1 -
DcR3双抗体夹心ELISA法的建立及其在原发性肝癌中的应用前景
目的:建立一种新的双抗体夹心ELISA法,以检测血清中DcR3抗原的浓度.辅助诊断原发性肝癌.方法:探索建立DcR3双抗体夹心ELISA法适反应务件.结果:所建立方法线性范围广、灵敏度较高、精密度较好、回收率较高,批间和批内变异系数均＜10%.对50例正常对照组的检测结果进行统计学分析,确定参考值范围为1.59～60.71 ng/mL((x)±2s).原发性肝癌组同正常对照组血清DcR3抗原水平差异有显著性(P＜0.01).结论:该法是一种较好的定量测定血清DcR3抗原的ELISA法,它可以为原发性肝癌患者的诊断提供一种新的辅助指标.
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血清DcR3水平与胃癌TNM分期的关系
目的 探讨血清诱捕受体3(DcR3)水平与胃癌TNM分期的关系.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测34例胃癌患者、18例外科急性感染患者、28例正常人血清DcR3水平.结果 胃癌患者血清DcR3水平明显高于正常人(P＜0.01) 和外科急性感染患者(P＜0.01),外科急性感染患者与正常人比较无显著差异(P＞0.05).TNM Ⅲ期、Ⅳ期患者胃癌血清DcR3水平明显高于TNM Ⅰ期、Ⅱ期患者(P＜0.01),淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移患者(P＜0.01),远处转移患者明显高于无远处转移患者(P＜0.05),但与分化程度(P＞0.05)、浸润深度(P＞0.05)无关.结论 血清DcR3水平与胃癌TNM分期有关,为术前评估胃癌临床分期和判断淋巴结及周围脏器切除范围提供理论依据.
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DcR3基因检测在恶性肿瘤研究中的地位
目的:检测DcR3在肺癌细胞株的表达,为肿瘤的发病机制研究开辟一条新途径.方法:用半定量RT-PCR方法,初步检测正常人P外周血单核细胞(BMC)及NCH446肺癌细胞株中DcR3 mRNA的相对表达水平.结果:健康人PBMC中DcR3基因的相对表达水平较低(0.259±0.084,n=5),在NCH446肺癌细胞株中有高水平的表达(0.652).结论:DcR3基因表达水平可能与肿瘤的发病有关.
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RNAi技术抑制HepG2细胞中DcR3的表达
目的 探讨特异性DcR3-siRNA对人肝细胞癌细胞系HepG2的DcR3基因表达的影响.方法 设计并合成带FAM荧光标记的针对DcR3的siRNA 4条和非特异性siRNA 1条,用脂质体转染HepG2细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪判断转染效果;应用半定量RT-PCR和免疫细胞化学检测特异性DcR3-siRNA的对HepG2细胞中DcR3表达的抑制作用.结果 各特异性DcR3-siRNA均能抑制DcR3 mRNA表达(P<0.05),其中以siRNA4的作用更明显,干扰作用达62.9%;将siRNA4转染HepG2细胞,免疫细胞化学结果显示,siRNA4能明显抑制HepG2细胞中DcR3蛋白的表达(P<0.01).结论 特异性DcR3-siRNA在体外实验能抑制目的 基因的表达.
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血清DcR3在急性呼吸窘迫综合征预后评估中的价值
目的:探讨血清DcR3 (Decoy receptor 3)在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)预后评估中的价值.方法:采纳前瞻性巢式病例对照研究设计方案.观察42例急性呼吸窘迫综合征患者30 d预后,21例全因死亡患者纳入死亡组,21例存活患者纳入存活组.分析0～24 h血清DcR3与ARDS病情严重程度、MODS、全因死亡的关系.结果:30天全因死亡率为50.0％.轻、中、重度ARDS死亡率分别为23.1％、60.9％、66.7％.轻、中、重度ARDS患者血清DcR3浓度分别为1.8(1.3～2.9) ng/mL、2.4(1.2～4.8) ng/mL、4.0(2.9～5.5) ng/mL,P=0.048.死亡组与存活组血清DcR3浓度分别为3.1(2.4～5.5) ng/mL、1.8(1.1～2.7) ng/mL,P=0.014.并发MODS与未并发MODS患者基线血清DcR3浓度分别为3.6(2.4～5.5) ng/mL、1.8(1.1～2.9)ng/mL,P=0.011.Cox回归分析显示DcR3≥2.7 ng/mL(HR=2.557,95％CI=1.016～6.432,P=0.046)、并发MODS(HR=4.667,95％CI=1.751～12.443,P=0.020)、氧合指数≤165 mmHg(HR=2.737,95％CI=1.049～7.141,P=0.040)是ARDS患者30 d死亡的独立预后预测因子.结论:血清DcR3浓度高低与ARDS病情严重程度相关.ARDS患者早期血清DcR3浓度增高与发生MODS以及30 d全因死亡风险增高有关.
关键词： 急性呼吸窘迫综合征 DcR3 预后 多器官功能障碍综合征 -
人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达
目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.
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抗人DcR3单克隆抗体的制备、鉴定及应用
目的 制备抗DcR3单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性,并应用于ELISA、Western blot、How cytometry(FCM)检测.方法 以纯化的可溶性DcR3(sDcR3)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DcR3 mAb.用Ig亚类EHSA试剂盒鉴定抗DcR3mAb的亚类.用ELISA方法测定抗DcR3 mAb与sDcR3结合的特性,SDS-PAGE鉴定抗DcR3 mAb与SW480细胞上清中DcR3结合的特性,以鉴定mAb的特性.用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析.Western blot检测mAb的特异性及应用,并用所获抗DcR3单克隆抗体(mAb)通过流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结果 获得4株可分泌DcR3 mAb的杂交瘤细胞系ZZ-393、ZZ-394、ZZ-151和ZZ-268.其中DcR3 mAb ZZ-268(下文简称为ZZ-268)的Ig亚类为IgGl(k型);腹水效价为1×10-5;亲和常数为1.28×109水平;ZZ-268和ZZ-151可识别与其他2种抗体小同的抗原表位;Westem blot证实,获得的ZZ-268可特异性地识别DcR3;通过流式细胞术可敏感地检测到不同肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结论 获得4株抗DcR3的mAb,其中ZZ-268效价高、特异性强,将此抗体用于膜DcR3与sDcR3的检测分析.
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诱骗受体DcR3对佐剂型关节炎大鼠模型的作用分析
目的 研究诱骗受体DcR3 对佐剂型关节炎(AA)大鼠模型的作用及其机理.方法 注射弗式完全佐剂建立大鼠佐剂型关节炎(AA)模型,尾静脉注射DcR3蛋白,观察大鼠关节肿胀度、间接 ELISA 检测血清和滑膜液中细胞因子IL-1 β、TNF-α、IFN-γ的变化.RT-PCR检测滑膜和淋巴细胞中DcR3、Fas、FasL mRNA的表达以及脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA的表达.Western blot分析滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达.结果 DcR3 治疗AA大鼠后,足肿胀度降低;血液和滑膜液的IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平下降;脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-α mRNA 表达下调,IL-4、IL-10 mRNA表达上调;滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调. 结论 DcR3 可以用于实验性大鼠AA的治疗,其治疗机制与调节滑膜细胞FasL、Fas mRNA的表达和血液淋巴细胞中 Fas mRNA的表达,促进滑膜细胞和自身反应性淋巴细胞的凋亡;调节脾脏细胞Th1/Th2细胞因子平衡相关.本研究为进一步阐明RA的发病机理奠定了重要基础,为有效治疗RA提供了新思路.
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重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达
目的 克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础.方法 用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度.并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达.结果 正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL.在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达.结论 成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础.
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宫颈癌组织中DCR3表达与外周血T细胞亚群的相关性研究
目的 探讨宫颈癌组织中诱骗受体3(DCR3)表达与外周血T细胞亚群之间的相关性.方法 免疫组织化学法检测宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌(CC)及正常宫颈组织中DCR3表达情况,并检测宫颈癌组织中实质及间质内T细胞表面抗原CD3、CD4、CD8阳性细胞数量;应用流式细胞术分析患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+T数量变化情况,分析研究宫颈癌组织中DCR3表达与患者外周血T细胞亚群之间的相关性.结果 DCR3表达强度与宫颈病变严重程度有关;宫颈癌患者外周血中T细胞数明显降低,且宫颈组织中DCR3表达与患者外周血中CD3+T、CD4+/CD8+呈负相关;宫颈癌变后实质内T细胞数明显减少,T细胞主要聚集于肿瘤间质内.结论 DCR3参与了宫颈癌细胞免疫逃逸,外周血T细胞亚群联合DCR3检测可作为宫颈癌免疫诊断指标,为患者免疫治疗提供基础.
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肝癌发展中FasL及其受体Fas/DcR3的表达分析
目的 研究小鼠肿瘤发生早期肿瘤坏死因子超家族成员FasL及其受体的表达特点,及其与免疫调节相关分子表达的时空关系,探讨其存诱导肿瘤免疫耐受中的作用.方法 建立小鼠实体瘤模型,采用RT-PCR方法 检测肿瘤组织中可溶型FasL、Fas及DcR3、TGF-β、IL-10在肿瘤发生不同时相的表达,同时,应用ELISA方法 定量检测血清中TGF-β、IL-10的表达.结果 在早期的肿瘤组织中,Fas的表达先于DcR3,其后DcR3大量表达,而Fas的表达则下调直至丢失,DcR3、FasL同时表达并上调,TGF-β和IL-10也随肿瘤的表达而上渊.TGF-β同DcR3的表达具有空间位置的一致性.FasL、DcR3、TCF-β和IL-10的表达水平同肿瘤的生长呈正相关.结论 随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负凋节,FasL、DcR3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中可能发挥着重要作用.
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DcR3在免疫相关性疾病中的研究进展
诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员之一,是一种表面受体,也是一种凋亡抑制蛋白(IAP),主要通过竞争性结合Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子样配体(TL1A)及T细胞上可诱导表达的、与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争结合单纯疱疹病毒侵人介体的淋巴毒素类似物(LIGHT),从而阻断相应配体产生的细胞凋亡.
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DcR3、Livin、TRAIL在肿瘤中作用的研究进展
细胞凋亡与增殖的动态平衡是维系生长发育、内环境稳定和免疫调节所必需的基本过程,此平衡破坏所导致的细胞凋亡抵抗是肿瘤发生发展的重要原因之一.
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宫颈癌患者血清DcR3及Survivin水平及临床意义
目的 探讨血清DcR3及Survivin水平及对宫颈癌进展的判断意义.方法 选择到陕西中医学院第二附属医院妇产科就诊的91例宫颈鳞癌患者,Ⅰ期34例,Ⅱ期33例,Ⅲ期患者24例,对各期CA125、CA19-9、CEA、DcR3及Survivin进行检测.结果 Ⅱ期患者CA125、CEA较Ⅰ期均出现显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),Ⅲ期患者CA125、CA19-9、CEA较Ⅰ期、Ⅱ期组均出现显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅱ期患者DcR3、Survivin较Ⅰ期均出现显著升高差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅲ期患者DcR3、Survivin较Ⅰ期、Ⅱ期组均出现显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Survivin与CA125、CEA呈正相关(P＜0.05),与CA19-9未见相关性(P＜0.05),DcR3与CA125、CEA呈正相关(P＜0.05).结论 宫颈癌分期的进展与DcR3及Survivin的紊乱密切相关,与常规肿瘤标志物等结合有助于判断疾病的进展.
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诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定
目的: 构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因, 并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定.方法: 查得人DcR3 Cdna全序列, 将其分段设计引物, 通过重叠PCR获得DcR3基因.构建Pet-22b(+)/DcR3表达载体, 转化大肠杆菌Rosseta-gami, IPTG诱导表达, Ni柱纯化.采用ELISA进行特异性鉴定.结果: 通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 蛋白纯度达95%以上.ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合.结论: 诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化, 为进一步的功能研究奠定了基础.
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DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测
诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3)是新近发现的一种可溶性的肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor, TNFR)家族成员[1].研究表明它在某些肿瘤、自身免疫病等疾病中高度表达, 其蛋白的表达和基因的扩增与人类多种恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤的免疫逃逸密切相关[2].故我们研究DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中的表达, 阐明其与结肠癌的相关性.
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抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定
目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.
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人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化人大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定.结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mτ)为33 000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%.Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性.纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6.结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础.
