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ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响
目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2 (ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径.方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20 μmol/L组.在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达.结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798).溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P =0.826、P=0.298).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P =0.001、P=0.002).溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P =0.370、P=0.351).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P ＜0.001、P＜0.007).结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达.Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程.
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PI3K和MEK联合抑制增强对K-ras基因单突变肺癌细胞的生长抑制作用
目的 观察RAS/MEK/ERK通路单独抑制或联合PI3K/AKT/mTOR通路抑制对非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其相关分子机制.方法 常规培养A549细胞,分别以不同浓度的PI3K抑制剂GDC-0941和MEK抑制剂AZD6244单独或联合处理,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测抑制剂对细胞增殖的影响,根据MTT法检测结果确定联合给药的浓度.将A549细胞分为空白对照组、0.5 μmol/L GDC-0941处理组、低浓度联合组(0.5 μmol/L AZD6244+ 0.5μmol/LGDC-0941)、5.0 μmol/L GDC-0941处理组和高浓度联合组(5.0 μmol/L AZD6244+ 5.0 μmol/L GDC-0941),采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,采用Western blot法检测抑制剂靶点下游与细胞周期和凋亡相关的蛋白表达.结果 AZD6244对A549细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性,但浓度平台出现时,增殖抑制率仅为25.5％.AZD6244联合GDC-0941对A549细胞的生长抑制作用增强,但联合用药的效果与两种抑制剂联合使用的浓度有关.0.5 μmol/L GDC-0941处理组和低浓度联合组A549细胞的凋亡率分别为(20.70±0.99)％和(18.65±0.92)％,差异无统计学意义(P＞0.05);5.0μmol/L GDC-0941处理组和高浓度联合组A549细胞的凋亡率分别为(37.85 ±3.18)％和(52.27±4.36)％,差异有统计学意义(P＜0.01).低浓度联合组A549细胞的细胞周期没有明显改变;高浓度联合组中G0/G1期细胞增加,S期细胞减少.单独使用AZD6244可明显抑制pERK的表达水平,但pAKT的表达增加.单独使用GDC-0941可明显抑制pAKT的表达水平,但pERK的表达增加.低浓度联合组中,细胞周期和凋亡蛋白的表达均没有发生明显改变;高浓度联合组中,cyclin D1、cyclin B1表达量受到抑制,PARP剪切增加,Bcl-2/Bax比值下降.结论 对于K-ras基因单突变的非小细胞肺癌A549细胞,单独使用一条信号通路的抑制剂会反馈性激活另一信号通路.RAS/MEK/ERK和PDK/AKT/mTOR两条通路的同时抑制呈协同作用,这种协调作用受到抑制剂浓度的影响.靶向治疗时,联合使用两条通路的抑制剂是必要的.
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MEK小分子抑制剂的设计、合成与初步活性研究
基于已报道的MEK小分子抑制剂,运用Autodock 4.2研究其与MEK蛋白的作用方式,并以此设计、合成10个全新小分子化合物,其结构经1H NMR和13C NMR确定,并采用MTT法进行了体外抗肿瘤活性研究.结果表明,所设计的化合物大多对MCF-7、PANC-1、SY5Y和A549四种肿瘤细胞株有较好的作用.其中,化合物4、6、7、8、10表现了较好的活性.
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Ras Raf Mek Erk信号传导通路在肝细胞癌发生中的作用机制及在靶向治疗中的应用
肝细胞癌(HCC)是我国原发性肝癌常见的一种类型,也是全球癌性死亡中重要的一个因素.因此,研究肿瘤生长的细胞机制对于探索新的有效治疗方法非常重要.目前已知,所有真核细胞中均存在Ras/Raf/Mek/Erk这一高度保守的细胞信号传导通路,这一信号传导通路广泛参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡、转移等过程.Ras/Raf/Mek/Erk信号传导通路是"MAPK"众多通路中的一个,它在多种致瘤性疾病中通常是上调的.同样,该信号传导通路的异常激活与肝细胞癌的发生及恶性进展密切相关.Ras基因的突变,EGF、VEGF、PDGF等生长因子及相应的膜受体过度表达均可使其激活,诱导肝癌细胞异常增殖,侵袭生长和转移,从而参与和促进肝细胞癌的发生、发展.因此,抑制Ras/Raf/Mek/Erk信号通路的传导将成为肝细胞癌的一种有效治疗方法.
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GMF-β与MEK信号通路cross-talk介导榄香烯的抗胶质瘤作用
目的 探讨神经胶质成熟因子-β(Glia Maturation Factor-β,GMF-β)在榄香烯致人U87MG胶质瘤细胞增殖抑制中的作用.方法 以不同浓度榄香烯作用于人U87MG胶质瘤细胞,噻唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)法检测细胞活性.免疫沉淀联合Western blot法检测经榄香烯处理的U87MG细胞中总GMF-β及磷酸化GMF-β(p-GMF-β)蛋白的表达水平.通过RNA干扰技术使GMF-β的表达沉默,然后以MTT法检测榄香烯的抗胶质瘤增殖能力.Western blot法检测榄香烯对丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6(Mitogen-activated Protein Kinase Kinase 3/6,MEK3/6)的激活作用是否因GMF-β的沉默而受到影响.结果 榄香烯显著抑制了人U87MG细胞的增殖,并可使GMF-β、MEK3和MEK6的磷酸化水平上调.沉默GMF-β的表达导致MEK3和MEK6的磷酸化水平下调,榄香烯的抗胶质瘤细胞增殖作用减弱.结论 GMF-β与MEK信号通路的交互作用(cross-talk)介导了榄香烯的抗人胶质瘤细胞增殖作用.
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结核杆菌抗原特异性激发人γδT细胞活化信号涉及Ras/Erk途径
目的:探讨Ras/Erk通路是否参与结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)启动的γδT细胞活化信号转导途径.方法:分离获取PBMC,用佛波醇酯(PMA)和离子霉素(IM),CD3mAb或Mtb-Ag刺激不同时间,或PBMC先经PD98059处理后再刺激培养;用荧光单抗染色后在流式细胞仪测定细胞CD69分子的表达;计数培养扩增10天的细胞数量.结果:PBMC用PMA+IM刺激6小时,总T细胞和γδT细胞中的CD69表达均达高峰(均＞99%),用CD3mAb刺激24小时,均达高峰(均在55%左右),用Mtb-Ag刺激24小时,亦均达高峰,但总T细胞和γδT细胞中CD69分别为16.0%和75.2%;用PD98059预处理PBMC,可明显抑制Mtb-Ag激活的γδT细胞CD69表达和γδT细胞的增殖.结论:Mtb-Ag可特异性激活γδT细胞,其活化信号转导需通过Ras/Erk通路.
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下调IGF-1通过CREB信号通路失活间接加重大鼠脑缺血损伤
目的 探讨MEK/ERK/CREB信号通路是否介导IGF-1在大鼠脑缺血中的调控作用.方法 成年雄性SD大鼠使用MACO线栓法建立永久性局灶性脑缺血模型,进行mNSS神经功能缺损评分,脑缺血48 h时进行TTC染色观察脑梗死情况、末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,并利用实时荧光定量PCR和Western blot检测缺血同侧大脑皮质内IGF-1及下游信号分子MEK、ERK1/2和CREB的mRNA和蛋白表达变化,及其磷酸化水平的变化情况.结果 脑缺血组大鼠mNSS评分、细胞凋亡百分比均明显高于假手术组,缺血大脑皮质内IGF-1表达下调,MEK、ERK1/2和CREB的基因水平下降,MEK、ERK1/2的蛋白水平及其磷酸化蛋白水平均明显降低.结论 本实验结果表明永久性局灶性脑缺血早期大鼠皮质内下调的IGF-1,可以通过负调控MEK/ERK/CREB促存活信号通路,间接加重大鼠脑缺血性损伤.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对MEK蛋白信号转导影响的研究
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一,参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种细胞过程.
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BEZ235对 A549细胞增殖及 akt、mek、erk mRNA表达的影响
目的：观察BEZ235对人肺腺癌A549细胞增殖及akt、mek、erk mRNA表达的影响。方法：体外培养A549细胞，分为对照组和BEZ235低、中、高剂量组，分别加入0、2．5、5、10 mol/L的BEZ235体外培养24、48、72 h；MTT法检测BEZ235对A549细胞增殖的抑制率，RT-PCR技术检测处理48 h后akt、erk、mek mRNA表达水平的变化。结果：BEZ235能够抑制A549细胞增殖，且呈浓度和时间依赖性（ F浓度＝233．315， F时间＝171．598， F交互＝6．770，P＜0．001）。不同浓度BEZ235作用于A549细胞48 h后，akt mRNA的表达水平随BEZ235浓度的升高呈下降趋势（F＝14．922，P＜0．001），而mek、erk mRNA的表达水平无明显改变（F＝2．968、3．059，P＞0．05）。结论：BEZ235能够呈浓度和时间依赖性抑制A549细胞增殖，这种抑制作用可能与下调akt mRNA的表达有关。
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舒尼替尼联合多西他赛对A549细胞增殖、凋亡、细胞周期及c-met、mek、erk mRNA表达的影响
目的:探讨舒尼替尼单药以及联合多西他赛不同顺序给药对A549细胞增殖、凋亡、细胞周期及c-met、mek、erk mRNA表达的影响.方法:取对数生长期的A549细胞进行以下实验.实验Ⅰ:对照组加入RPMI 1640培养基;多西他赛单药组给予多西他赛(终质量浓度16 mg/L,下同);舒尼替尼单药组给予舒尼替尼(终浓度7.5 μmol/L,下同);舒尼替尼+多西他赛组,加入同时含两药的培养液.实验Ⅱ:多西他赛→舒尼替尼组(D→S组)先加入100 μL含多西他赛的培养液培养24 h,洗脱,再加入100 μL含舒尼替尼的培养液继续培养24 h;舒尼替尼→多西他赛组(S→D组),同上反向处理.采用MTT法检测以上各组细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡,RT-PCR检测A549细胞c-met、mek、erk mRNA的表达水平.结果:Ⅰ:联合用药组较单独用药组细胞增殖抑制率、晚期凋亡率和总凋亡率升高,S期细胞减少,erk表达上调(P＜0.05).Ⅱ:D→S组较S→D组细胞增殖抑制率和凋亡率升高,G0/G1期细胞减少,S期、G2/M期细胞增多,c-met、mek mRNA表达下调,erk mRNA表达上调(P＜0.05).结论:舒尼替尼和多西他赛均能抑制A549细胞的生长,联合用药优于单独用药;多西他赛后序贯舒尼替尼能产生明显的协同效应,效果优于舒尼替尼后序贯多西他赛.
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Notch信号阻断剂抑制鼻咽癌细胞增殖的作用及机制
目的 探讨Notch信号阻断剂抑制鼻咽癌细胞增殖的作用及其机制.方法 应用Notch信号特异性抑制剂GSI抑制Notch信号的表达,MTT法检测癌细胞的生长增殖变化；流式细胞及Hoechst 33258染色检测癌细胞凋亡；应用Western blot检测Notch信号受抑制后AKT、MEK信号通路的变化.结果 应用Notch抑制剂GSI作用后,癌细胞Notch1、2、4表达明显下降,而Notch3无明显变化.GSI作用后癌细胞增殖明显受到抑制,凋亡增加；该作用有浓度及时间双重依赖性(P＜0.05).Notch信号阻断后磷酸化AKT、GSK3β和ERK1/2显著下降,而总AKT、总GSK3β及总ERK1/2无明显变化.结论 阻断鼻咽癌细胞Notch信号可以显著抑制鼻咽癌细胞增殖及诱导癌细胞凋亡.该作用可能与下调ANT及MEK信号通路有关.
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红景天苷通过下调ERK1/2信号通路抑制肺癌A549细胞的增殖作用
目的 研究红景天苷(Salidroside,Sal)是否通过抑制ERK 1/2信号通路介导肺癌A549细胞的增殖作用.方法 体外培养A549细胞,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测不同浓度Sal对A549细胞增殖率的影响,筛选药物使用大剂量.细胞锚定增殖实验检测药物对细胞增殖的抑制作用.蛋白质印迹法(Western Blotting)检测MEK信号通路磷酸化水平的变化.体外激酶试验检测药物对丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK激酶)活性的抑制作用.CNBr-sepharose 4B Beads结合实验检测药物与MEK的结合.裸鼠荷瘤实验检测药物在体内对肿瘤增殖的抑制作用.结果 Sal在50 μmol· L-1以内时,细胞毒性较小,当浓度到100 μmol· L-1时,细胞死亡明显增加.A549细胞在细胞锚定增殖实验中形成的克隆数目,不同浓度Sal组明显少于阳性对照组(EGF)组,且具有剂量依赖性(P＜0.05).Sal处理A549细胞组,相对于阳性对照组EGF组,MAPK信号通路ERK及其下游p90RSK磷酸化水平明显下降,具有时间和剂量依赖性,差异具有统计学意义(P＜0.05),MEK的磷酸化水平差异无统计学意义(P＞0.05).体外激酶和CNBr-sepharose 4B Beads结合实验表明Sal可以结合MEK,并抑制MEK的活性(P＜0.05).裸鼠荷瘤实验显示,药物组肿瘤体积明显小于对照组,具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在肺癌A549细胞株中,Sal可以通过靶向MEK,抑制ERK1/2信号通路,进而在体内外起到抗肿瘤的作用.
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银杏叶提取物EGb761抗大鼠脑缺血损伤的作用机制研究
目的 通过实验研究P38/MAPK和MEK/ERK在大鼠大脑中动脉栓塞模型中的变化及其与EGB761发挥药理作用的关系,探讨银杏叶制剂EGb761治疗脑缺血的机制.方法 大鼠连续1Od口服EGb761 50、100mg/kg后建立大脑中动脉栓塞-再灌模型,通过TTC染色,免疫组化和Westem blot方法检测大鼠脑组织细胞的形态变化和大鼠皮质Caspase -9,Caspase-3,P38/MAPK,MEK/ERK相应蛋白的表达变化.结果 EGb761给药可以减少脑缺血大鼠脑组织梗死面积,显著性抑制脑缺血大鼠海马Caspase-9和Caspase-3表达,显著性抑制大鼠海马神经细胞P-P38,P-MEK和P-ERK的表达水平.结论 EGb761可以减轻脑缺血缺氧引起的细胞损伤,其神经保护作用通过抑制内源性凋亡信号通路激活和P38/MAPK和MEK/ERK信号通路激活引起的细胞凋亡有关.
关键词： 银杏叶提取物EGb761 P38 MAPK MEK ERK -
清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞SMMC-7721 MEK表达的影响
目的:观察清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞增殖和信号传导因子MEK影响.方法:采用血清药理学方法,以病理鼠血清作对照,应用MTT比色法观察清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用.用Western免疫印迹方法检测对MEK蛋白表达影响,RT-PCR方法检测对MEK1mRNA表达影响.结果:肝化瘀方含药血清对TGFα诱导的肝癌细胞SMMC-7721增殖有明显的抑制作用,抑制效应呈时间依赖性.清肝化瘀方含药血清能抑制MEK蛋白的表达和MEK1的mRNA的表达.结论:清肝化瘀方含药血清能抑制TGFα诱导的人肝癌细胞增殖,抑制MEK1的mRNA的表达和MEK蛋白的表达,阻断TGFα在细胞内的信号传导.
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补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜MEK/ERKmRNA表达的影响
目的:观察脾虚大鼠胃粘膜MEK、ERKmRNA表达变化及补中益气汤对其表达的影响,并探讨相关作用机制.方法:SD大鼠随机分为设空白对照组、脾虚损伤组、补中益气汤组、非脾虚损伤组.脾虚损伤组、补中益气汤组大鼠给予100％大黄水煎剂灌胃,一天2次,连续10天.第11天开始,补中益气汤组给予补中益气汤灌胃治疗7天.第18天,除空白对照组外的另外三组均灌服消炎痛造成胃粘膜损伤,采用荧光定量PCR(SYBR Green Ⅰ)检测MEKmRNA、ERKmRNA.结果:与非脾虚损伤组比较,脾虚损伤组大鼠胃粘膜MEKmRNA明显下降;与脾虚损伤组比较,补中益气汤20g/kg大鼠胃粘膜MEKmRNA表达明显上调,ETKmRNA显著升高.结论:补中益气汤可提高脾虚大鼠消炎痛攻击后胃粘膜MEKmRNA、ERKmRNA表达水平,提示该方的胃粘膜保护、降低胃粘膜易损性等作用可能与激活MEK/ERK信号转导途径有关.
