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穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化
目的 在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化.方法 以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSV G蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 在E coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的 蛋白主要存在于包涵体中.经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白.结论 已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础.
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HIV-Tat蛋白转导域的研究进展
HIV-Tat蛋白转导域具有穿膜活性,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,且对细胞无毒副作用,在药物转运及疾病治疗等领域有着广阔的应用前景.本文对HIV-Tat蛋白的结构、穿膜机制及转导域功能的应用作一综述.
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TAT-haFGF14-154对小鼠的急性毒性和免疫原性
目的 研究人酸性成纤维细胞生长因子(Human acidic fibroblast growth factor,haFGF)和穿膜肽(Transcriptional activator protein,TAT)融合蛋白TAT-haFGF14-154在小鼠体内的急性毒性反应和免疫原性,初步评价其安全性.方法 取昆明小鼠,单次经尾静脉注射10 mg/kg TAT-haFGF14-154,观察并记录14d内小鼠的一般行为、中毒死亡情况和体重变化,各组织脏器中毒情况,HE染色观察各组小鼠大脑组织病理学变化.将900μg/kgTAT-haFGF14-154分别经静脉和鼻腔免疫昆明小鼠,每隔2d给药1次,分别于给药后的第1、2、3、4周经眼眶采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价；分别将高(300 μg/kg)、中(100 μg/kg)、低(35μg/kg)剂量的TAT-haFGF14-154经鼻腔免疫快速老化小鼠(SAM P8),每隔2d给药1次,30 d后处死小鼠,经眼眶采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价.结果 在整个急性毒性试验过程中,小鼠无一例死亡,体重变化正常,大脑未见明显病理学改变；TAT-haFGF14-154对小鼠的大耐受剂量大于10mg/kg;昆明小鼠经鼻腔给予TAT-haFGF14-154后,第3周产生抗体,而静脉给药后第2周即有抗体产生；抗体产生的强度呈剂量依赖性.结论 TAT-haFGF14-154属于弱毒性药物,但具有免疫原性,静脉给药的免疫原性强于鼻腔给药.
关键词： 急性毒性 免疫原性 人酸性成纤维细胞生长因子 穿膜肽 鼻腔给药 -
穿膜肽与蛋白微球偶联物的制备及鉴定
目的:制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球(BSA-NP)偶联物,并检测其对膀胱癌EJ细胞的穿膜活性.方法:通过异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) 交联的方法制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电镜、荧光显微镜及共聚焦显微镜检测其共价连接及活性.结果:SDS-PAGE电泳鉴定TAT-EGFP与白蛋白微球是通过共价键连接;电镜显示二联偶联物(TAT-EGFP-BSA-NP)的构象;荧光显微镜及电镜显示了二联偶联物的穿膜活性.结论:成功的制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物-TAT-EGFP-BSA-NP,且偶联物对膀胱癌细胞有穿膜活性.
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新型经皮传递的外周脂肪细胞激动剂衍生物TAT-hNPY的实验研究及其临床意义
目的 为了术来开发和研制一类具有经皮肤或经粘膜途径给药的新型外周脂肪细胞激动剂及进行相关临床应用制剂等研究工作需要,本研究新设计并合成了一条氨基酸全序列为YGRKKRRQRRRYPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH2的TAT-hNPY,并对TAT-hNPY的纯度和质核比及分子量进行了测定分析与鉴定,为其在临床应用提供实验依据.方法 TAT-hNPY合成采用化学固相合成法,纯度测定采用高效液相色谱法(HPLC),分子量测定采用电喷雾离子化质谱法(ESI-IT-MS).结果 采用HPLC检测化学固相法合成的TAT-hNPY的纯度为95.85％;采用ESI-IT-MS法检测分析出3个带有不同质荷比的目标峰,它们分别为:[M+6H]6H+质荷比为969.2 m/z,其实测分子量为5 809.2道尔顿;[M+ 7H] 7H+质荷比为:831.4 m/z,其实测分子量为5 812.8道尔顿;[M +9H] 9H+质荷比为:646.8 m/z,其实测分子量为5812.2道尔顿,该目标多肽的理论分子量为5 814.6道尔顿.结论 采用化学固相合成法合成TAT-hNPY的实测分子量与理论分子量误差均在允许误差0.1％内,丽者结果相符,证明本实验成功实现了目标多肽的合成,这将为临床相关学科进一步探索hNPY与外周脂肪细胞之间的相关关系、特别是对深入探索研究经皮肤或粘膜给药途径传递hNPY对人体外周组织脂肪组织中脂肪前体细胞和脂肪干细胞的相互作用及其影响等奠定了一定基础.
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融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果
目的:观察融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效应.方法:采用编码11个精氨酸(11R)的穿膜肽序列融合HSP70基因序列,构建重组腺病毒载体AdCMV-HSP70s、AdCMV-HSP70(无穿膜肽对照)和AdCMV-EGFV(空载体对照).Western blotting、ELISA法检测重组腺病毒介导的HSP70基因在胃癌SCG-7901细胞中的表达,MTT检测重组腺病毒感染后HSP70分泌性表达对胃癌细胞的抑制作用.裸鼠移植瘤模型的抗瘤实验检测HSP70基因联合CIK细胞对胃癌移植瘤的抗瘤效应.结果:与AdCMV-HSP70感染细胞比,AdCMV-HSP70s感染细胞的HSP70表达量明显增加[胃癌SGC-7901细胞:(360.72±20.89) vs(121.01±15.94) ng/ml,P＜0.05;胃黏膜上皮GES-1细胞:(188.62±10.82) vs(135.00 ±13.96) ng/ml,P＜0.05].融合11R的HSP70蛋白能够穿膜并分泌到细胞外后对胃癌细胞产生一定的增殖抑制作用[MOI=100 pfu/cell时,细胞存活率(66.33±4.33)％vs(101.33±7.64)％,P＜0.01].AdCMV-HSP70s+ CIK联合治疗对胃癌移植瘤的抑制率显著高于AdCMV-HSP70+ CIK组[(66.5±7.3)％vs(43.6±5.6)％,P＜0.05],该组移植瘤组织间质中CD3+T细胞浸润数量也明显多于后者.结论:融合穿膜肽可明显促进HSP70蛋白的表达和分泌,和CIK细胞联合治疗能增强抗瘤免疫效应,从而显著抑制裸鼠胃癌移植瘤.
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Tat穿膜肽的临床应用研究进展
穿膜肽Tat(transcriptional activator protein)是一种带正电荷的短肽,可以协助大分子物质进入哺乳动物细胞.近的研究表明,多种与Tat融合的物质能够穿过细胞膜而且可以发挥其生物学功能.这项技术对结合物的大小没有严格的限制,即使是原本无法使用的大分子物质也有可能用于治疗疾病.Tat已经在肿瘤、糖尿病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景.
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人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究
目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力.方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIV Tat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A 2.1限制性CTL优势表位HPV16 E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性.结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上.与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P＜0.05).结论:在HPV16 E7HLA-A 2.1限制性CTl表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路.
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穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-Ⅰ类抗原提呈影响的初步研究
目的 研究穿膜肽(Tat49-57)对HPV16E7 MHC-Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位(E749-57)在抗原提呈细胞内经MHC-Ⅰ类途径被提呈的动力学影响.方法 应用多肽固相合成技术,分别合成含穿膜肽与HPV(人乳头瘤病毒)16E7惟一HLA-A2/H2-Kb+限制性CTL表位E749-57的融合多肽,同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽.采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测抗原提呈细胞(APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类提呈的情况.结果 在与APC孵育早期,Tat-E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径,提呈的效率略低于E749-57(P＞0.05);在孵育的后期,与Tat-E749-57组孵育的APC细胞表面,E749-57/Kb复合物存在时间较其他组明显延长(P＜0.05).结论 在外源性抗原肽中引入穿膜肽可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率,从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性.
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靶向载基因及穿膜肽超声造影剂转染缺氧人脐静脉内皮细胞的研究
目的 探讨P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂的制备及转染缺氧损伤型人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的可行性.方法 采用机械振荡法及碳二亚胺法制备P-选择素靶向载绿色荧光蛋白基因及穿膜肽超声造影剂,检测其形态分布、浓度、粒径,采用激光共聚焦显微镜观察基因和穿膜肽的分布,用荧光分光光度法计算基因及穿膜肽的包封率.体外培养HUVEC,用过氧化氢处理制备HUVEC缺氧模型,并分为靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组进行转染实验.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪检测转染率,并用SPSS 17.0统计软件进行t检验及直线相关分析.结果 制备的P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂平均粒径约(2.15±0.36) μm,计数为(1.58±0.23) ×107个/ml.激光共聚焦显微镜下观察到基因和穿膜肽均匀分布在造影剂壁上,基因和穿膜肽的包封率分别为28％[y=0.932x -0.09(r =0.993,P＜0.05)]和25％ [y =5.875x -0.81(r =0.987,P＜0.05)].转染24 h后,荧光显微镜下观察到靶向和非靶向载基因及穿膜肽造影剂组均有绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测靶向组和非靶向组平均转染率分别约为( 18.74±0.47)％和(15.34±0.22)％(t=10.923,P＜0.001).结论 P-选择素靶向载基因及穿膜肽超声造影剂能够转染缺氧损伤的HUVEC,这为靶向基因投递提供了新的思路.
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一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测
通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造,构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽.该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a-T1-GFP,重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白His-T1-GFP,经组氨酸亲和层析纯化后,用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His-T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用.经测序证实成功构建了表达型载体pET28a-T1-GFP,融合蛋白His-T1-GFP在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达率为20%.经组氨酸亲和纯化,得到纯度达85%的融合蛋白.SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP,动物实验表明融合蛋白His-T1-GFP能够有效跨过血脑屏障,主要分布在大脑皮层和海马回.该研究成功地构建了一种新的穿膜肽-T1,为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础.
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穿膜肽提高纳米银穿膜活性的研究
目的 合成纳米银,在其表面修饰穿膜肽(TAT),并检测修饰后纳米银粒对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)的穿膜活性.方法 通过化学还原法制备纳米银(AgNP),并通过Ag-S共价键与TAT连接修饰AgNP.通过粒度仪、透射电镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪以及二喹林甲酸法等仪器及方法对其表征、共价连接及TAT的介导活性进行测定.结果 成功制备了10 nm以下的AgNP,且修饰TAT后的AgNP(AgNP-TAT)表现出了比AgNP更强的穿膜活性.结论 TAT修饰AgNP后能显著提高其穿膜活性.
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穿膜肽R6促进低分子肝素大鼠肠道吸收的研究
目的 研究穿膜肽R6促进低分子肝素大鼠肠道吸收的作用.方法 以用药前后血液凝固时间的变化为指标,采用大鼠十二指肠给药的方法评价R6对低分子肝素的促吸收作用,采用肠袢法研究R6的主要促吸收部位.结果 R6作为吸收促进剂,低分子肝素十二指肠给药后凝血时间显著延长,R6在十二指肠、空肠、回肠部位均显示促吸收作用,且在回肠部位的促吸收效果显著.结论 R6能够显著促进低分子肝素的大鼠肠道吸收.
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穿膜肽引导核酸靶向性进入神经细胞的研究
目的 研究来源于狂犬病毒糖蛋白的一个新型衍生肽(RVG-derived peptide,RDP),是否能够引导DNA特异性地进入神经细胞.方法 首先,通过琼脂糖凝胶电泳阻滞实验和圆二色谱确定RDP与DNA复合物的佳比例以及相互作用,将佳比例的复合物转染入神经母瘤细胞;其次,将RDP包裹的DNA复合物(RDP/pDNA)通过静脉给药的方式给予小鼠,组织冷冻切片检测DNA在各组织的表达情况.结果 体外试验结果表明,目的 基因仅在神经细胞中表达;体内试验结果表明,RDP/pDNA组小鼠的脑、肾、肝可检测到目的 蛋白,其中脑内目的 蛋白含量高.结论 RDP可作为一种靶向神经细胞的基因载体,在未来的非病毒载体应用中可能具有较大的潜力.
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双功能融合蛋白RDP-BDNF对东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠学习记忆的影响
目的：研究融合蛋白 RDP-BDNF穿越血脑屏障和神经保护活性的双重功能，为脑部疾病的治疗提供一种新方法。方法我们将新型穿膜肽狂犬病毒糖蛋白衍生肽( RDP)基因与BDNF基因融合并在大肠杆菌中表达，融合蛋白经尾静脉注射入小鼠体内，用 ELISA 法检测 RDP-BDNF在脑和血清中的时效曲线；另外通过Morris水迷宫法研究融合蛋白对东莨菪碱所致的认知功能障碍小鼠学习记忆的影响，并探究其作用的机制。结果 RDP-BDNF可以穿过血脑屏障，且能提高东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠的学习记忆能力。结论通过载体RDP介导实现蛋白质的入脑转运可能为脑部疾病的治疗提供一种新方法。
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穿膜肽修饰的纳米颗粒抗胰腺癌的初步研究
目的 探究穿膜肽修饰的纳米颗粒介导的光动力学疗法(PDT)对胰腺癌SW1990细胞的杀伤作用.方法 将胰腺癌SW1990细胞分成4组,不光照不含光敏剂的细胞作为空白对照组,与细胞共孵育的游离Ce6组,NP/Ce6组及TAT-NP/Ce6组.首先分别制备出纳米颗粒TAT-NP/Ce6和NP/Ce6.利用流式细胞仪(FACS)检测各组被SW 1990细胞摄取的情况;荧光显微镜观察各组光照下在细胞内产生活性氧的情况;后用MTT或活死染色法检测光照下各组对细胞的杀伤效果.结果 FACS结果显示各组分别被细胞摄取4h后,TAT-NP/Ce6组胞内荧光显著高于NP/Ce6组(P＜0.001),同时NP/Ce6组明显强于free Ce6组(P ＜0.001).荧光显微镜显示光照下纳米颗粒TAT-NP/Ce6组在细胞内产生活性氧明显强于其他各组(P ＜0.001).MTT法显示在每一Ce6浓度下光照时,TAT-NP/Ce6组对细胞的杀伤效果明显强于NP/Ce6 (P＜0.01),Ce6浓度为0.5μg/ml时,活死细胞染色法同样证明了对细胞的这种杀伤效果.结论 TAT肽修饰的纳米颗粒能有效增加胰腺癌细胞对其摄取,其介导的PDT杀伤胰腺癌细胞效果明显增强.
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穿膜肽的研究进展
穿膜肽是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞,并对宿主细胞没有显著毒副作用.穿膜肽存在多种穿膜机制,诸如直接渗透到细胞膜,通过易位形成的一个暂时性的结构和内吞作用介导入膜等.具体的穿膜机制还不清楚,但普遍认为穿膜肽与细胞表面负电荷物质的直接接触是必不可少的.由于穿膜肽的穿膜性质,其在分子生物学、药学、细胞生物学、疫苗学甚至影像学上有广泛的应用前景.本文对近年来穿膜肽的结构、穿膜机制和应用方面的研究进展进行了综述.
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穿膜肽为载体的分子影像学应用研究进展
由于细胞膜的天然屏障作用,使得许多生物活性分子难以进入细胞发挥作用,这使人们在分子水平上诊治疾病受到了很大的限制.穿膜肽是1988年新发现蛋白转导肽,它可以高效地穿透细胞膜,并且在不依赖受体、能量、温度情况下可携带多种活性物质进入各种细胞.本文就穿膜肽的特点,在功能上转运蛋白、抗体、脂质体、基因以及作为分子成像新途径能结合荧光素,磁共振对比剂等进行细胞内显影作一个综述介绍.
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穿膜肽介导紫杉醇脂质体对肿瘤的治疗作用
目的：制备和表征 F3修饰紫杉醇脂质体，并进行细胞学和体内抗肿瘤评价。方法采用薄膜分散法制备脂质体，人肺腺癌细胞 A549进行摄取评价；小鼠肝癌细胞 H22荷瘤小鼠进行体内抗肿瘤活性评价。结果 F3修饰脂质体粒径为90 nm；该修饰后脂质体被细胞摄取能力明显增强，进而提高了药物的抗肿瘤活性，给药16天后，F3— Lipo 组瘤体增长仅为11倍，相比于生理盐水组26倍，Taxol 18倍，未修饰脂质体14倍，有更好的抗肿瘤效果。结论 F3穿膜肽可以明显提高载体入胞能力，进而改善药物治疗作用。
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穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物的制备及活性鉴定
目的 制备穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其穿膜活性和酶活性.方法 采用异型双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)将穿膜肽·增强型绿色荧光蛋白融合蛋白(CPPs-EGFP)、β-葡萄糖苷酶进行共价交联,经Ni-NAT Superflow Cartridge、Sephadex G-75层析柱分离纯化.采用还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对偶联物进行鉴定；偶联物与膀胱癌EJ细胞共同孵育,置于荧光显微镜下观察,鉴定其穿膜活性；采用β-葡萄糖苷酶测试盒(DBGD-100)鉴定其酶活性.结果 偶联物SDS-PAGE非还原型电泳高分子量端可见明显条带,而还原型电泳分别在穿膜肽和β-葡萄糖苷酶分子量相应位置可见明显条带；在荧光显微镜下与偶联物共同孵育后的膀胱癌EJ细胞内可见明显绿色荧光；用β-葡萄糖苷酶测试盒(DBGD-100)测定,偶联物仍然保持良好的酶活性,约为同等浓度β-葡萄糖苷酶活性的80％.结论 应用SPDP成功制备了穿膜肽-β-葡萄糖苷酶偶联物,并且偶联物保持良好穿膜活性和酶活性.该方法有助于解决酶·前药系统药物难以进入细胞内的问题.
