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人工合成多肽在生物材料上的修饰进展
生物材料表面通过合适的多肽修饰可以提高材料与细胞的亲和性.本文简要地介绍了一些具有生物活性的多肽,论述了它们的合成、在生物材料上的修饰、细胞在多肽修饰材料表面的行为等重要问题.
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多肽合成中"困难序列"的缩合研究进展
化学学科发展至今拥有极强的能力来获得高的合成效率,但是在多肽合成中"困难序列"的存在仍然成为成功缩合的巨大挑战.本文综述了影响多肽缩合效率的因素以及提高"困难序列"缩合效率的有效方法.所述方法均简便易行,适用于多肽的固相合成或液相合成.
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肽合成
药用多肽因其涉及范围广、药用活性高、生物利用性好、副作用少等优点正被越来越多的药学工作者列为将来药物发展的主要方向.目前多肽合成方面主要以液相合成为主,本文在查阅大量文献的基础上对肽合成过程中,氨基酸的保护、肽键缩合等常见的方法做了总结,希望为科研工作者对肽类药物开发提供参考.
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胸腺五肽的合成及临床应用进展
综述免疫调节剂胸腺五肽(TP-5)的合成方法及其临床应用新进展;分析固相法和液相法在TP-5合成应用中的特点以及TP-5在治疗恶性肿瘤、慢性乙型肝炎、重型病毒性肝炎、儿童病毒性脑炎、复发性尖锐湿疣、II型糖尿病和严重烧伤等方面的应用.
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多肽的固相合成
多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义,而且具有重要的应用价值.通过多肽的全合成可以验证一个新的多肽的结构;设计新的多肽,用于研究结构与功能的关系;为多肽生物合成反应机制提供重要信息;建立模型酶,以及合成新的多肽药物等.自Merrifield创立并发展了固相合成多肽的方法,使多肽合成领域取得了重大突破,对化学、生化、医药、免疫及分子微生物学等领域也都起了巨大的推动作用.
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肥胖代谢综合征治疗新靶点——神经肽Y衍生物的设计与合成及测定分析
目的 为了探索人神经肽 Y ( hNPY)与老年人肥胖及其代谢综合征之间的相关关系、新的发病机制以及其在老年临床医学治疗的新靶点, 我们进行了 hNPY 衍生物——聚乙二醇化神经肽 Y ( mPEG4 -hNPY)的设计与合成, 同时对合成的mPEG4 -hNPY进行测定分析, 以确定合成此多肽的纯度和分子量等.方法 mPEG4 -hNPY合成采用化学固相合成法, 纯度测定采用高效液相色谱法( HPLC) ,其分子量测定采用电喷雾离子化质谱法( ESI - IT - MS) .结果 采用 HPLC 检测化学固相法合成的mPEG4 -hNPY的纯度为96. 29% ; 采用ESI检测出3H+-7H+5 个目标峰的mPEG4 -hNPY, 分子量范围在4 532. 0 ~4 534. 2Da, 该分子量与其理论值4 534. 0Da高度吻合, 且小于允许误差范围0. 1% .它们的质荷比分别为: [M+3H] 3H+质荷比为1 512. 4 m/z, 实测分子量为4 534. 2Da; [M+4H] 4H+质荷比为1 134. 2 m/z, 实测分子量为4 532. 8Da; [M+5H] 5H+质荷比为907. 4 m/z, 实测分子量为4 532. 0 Da; [M+6H] 6H+质荷比为756. 4 m/z, 实测分子量为4 532. 4 Da; [ M+7H] 7H+质荷比为648. 6 m/z, 实测分子量为4 533. 2Da.结论 采用化学固相合成法可成功合成 mPEG4 -hNPY, 这为今后进行人体肥胖代谢综合征临床发病的分子机制研究, 以及未来老年医学临床采用新靶点治疗与干预等提供了科学依据和物质基础.
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抗人神经肽Y单克隆抗体的制备及鉴定
目的:建立抗人神经肽Y(NPY)的单克隆抗体细胞株,方法:用合成的hNPY多肽偶联KLH免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用ELISA法筛选出阳性克隆,经克隆化后建立抗人NPY杂交瘤细胞株,并对得到的单抗进行亚类、效价、纯度、亲和常数以及结合位点的测定和分析,结果:获得了3株稳定分泌抗hNPY单抗杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定分别为IgG3、IgG26、IgGI,腹水效价为1:20万～1.200万,纯化抗体效价为0.05 μg/ml～0.0005μg/ml,4A8抗体纯度达到95%以上,抗体亲和常数分别为5.27 x 106 L/mol,3.39 x 106 L/mol,1.05 x 107 L/mol,不同单抗配对经时间分辨免疫荧光法检测结果提示3株单抗是针对不同抗原决定簇,结论:成功制备了3株抗hNPY单抗,为研究NPY及其抗体在脂肪移植及肥胖治疗中的机制和应用奠定基础.
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新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备
目的:分析一个新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位并制备其多克隆抗体.方法:从人胎肝文库PCR扩增获得FRG4基因全长cDNA序列;通过生物信息学分析,预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域,并进行了多序列比对;采用固相多肽合成法合成了FRG4抗原多肽,并免疫家兔;用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达.结果:通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY,制备兔抗人FRG4多克隆抗体.高效液相色谱检测显示抗体纯度达82.79%,抗体滴度为1∶16 000,Western blot证实该抗体具有较好的反应性和特异性,免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达.结论:成功制备了新的人突触相关蛋白(FRG4)多克隆抗体.
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新型经皮传递的外周脂肪细胞激动剂衍生物TAT-hNPY的实验研究及其临床意义
目的 为了术来开发和研制一类具有经皮肤或经粘膜途径给药的新型外周脂肪细胞激动剂及进行相关临床应用制剂等研究工作需要,本研究新设计并合成了一条氨基酸全序列为YGRKKRRQRRRYPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH2的TAT-hNPY,并对TAT-hNPY的纯度和质核比及分子量进行了测定分析与鉴定,为其在临床应用提供实验依据.方法 TAT-hNPY合成采用化学固相合成法,纯度测定采用高效液相色谱法(HPLC),分子量测定采用电喷雾离子化质谱法(ESI-IT-MS).结果 采用HPLC检测化学固相法合成的TAT-hNPY的纯度为95.85％;采用ESI-IT-MS法检测分析出3个带有不同质荷比的目标峰,它们分别为:[M+6H]6H+质荷比为969.2 m/z,其实测分子量为5 809.2道尔顿;[M+ 7H] 7H+质荷比为:831.4 m/z,其实测分子量为5 812.8道尔顿;[M +9H] 9H+质荷比为:646.8 m/z,其实测分子量为5812.2道尔顿,该目标多肽的理论分子量为5 814.6道尔顿.结论 采用化学固相合成法合成TAT-hNPY的实测分子量与理论分子量误差均在允许误差0.1％内,丽者结果相符,证明本实验成功实现了目标多肽的合成,这将为临床相关学科进一步探索hNPY与外周脂肪细胞之间的相关关系、特别是对深入探索研究经皮肤或粘膜给药途径传递hNPY对人体外周组织脂肪组织中脂肪前体细胞和脂肪干细胞的相互作用及其影响等奠定了一定基础.
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艾塞那肽合成
目的:开发一种高效率、低成本合成艾塞那肽的方法以满足规模化生产需要.方法:以N-C延伸策略,将艾塞那肽的39个氨基酸分成13个小片段,先用液相法分别合成12个N端Fmoc保护小片段肽,用固相法合成第13个肽树脂片段,然后用固相法将12个小片段依次连接到第13个肽树脂片段上,得到艾塞那肽树脂,切割后得到艾塞那肽粗品.后经反相色谱纯化、冷冻干燥等过程,得到艾塞那肽.结果:合成的艾塞那肽质谱表征结构正确,液相色谱显示纯度大于98%.结论:本方法提高了合成效率,减少杂质累积,降低了纯化难度,适合规模化生产.
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一组基于Histatin5阳离子抗菌肽的设计、合成及抗菌活性
Histatin5是人类唾液腺分泌的一种阳离子抗菌肽.本文以Histatin5及其类似物Dhvar4和Dhvar5为模板,设计9个具有新颖序列的抗菌肽,并用固相合成法进行合成.采用肉汤稀释法测定了抗菌肽的抗菌谱和低抑菌浓度,结果显示有6个抗菌肽活性得到提高,呈现对细菌和真菌的广谱抗菌活性,并对临床常见耐药菌有效,值得进一步研究.本文还初步讨论了抗菌肽的抗菌活性与α-螺旋度、电荷、疏水性和两亲性的关系.
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蜂毒肽片段的合成及活性研究
为了保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,降低溶血性和致敏性,设计合成蜂毒肽的片段,观察它对兔免疫性关节炎的治疗作用.采用多肽合成法合成蜂毒肽结构中亲水性片段,经高效液相色谱及质谱分析,确定合成多肽片段的氨基酸组成.建立家兔卵蛋白性关节炎模型,进行溶血性试验、致敏性试验以及动物模型治疗实验.结果:蜂毒肽片段溶血率<5%,致敏率<8%,动物模型治疗有效率可达到70%.实验证明蜂毒肽片段的合成可有效地保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,减低蜂毒肽的强溶血活性及致敏活性.
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弗林蛋白酶(furin)多肽抑制剂的合成研究
目的 以绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)Lys活性片段22肽为模板,设计能抑制弗林蛋白酶(furin)的多肽抑制剂.方法 根据furin的专一性底物的特定氨基酸序列来改造设计抑制剂,用Fmoc法固相合成了两条多肽抑制剂(MBI 13和MBI 14). 结果纯化的MBI13和MBI14经HPLC和质谱鉴定合成正确,对furin的抑制常数分别为:5.6×10-7 M和2.3×10-7 M.结论 以MBTI Lys片段为模板经过突变和优化设计,得到了较为理想的furin抑制剂,为进一步的药物设计提供依据.
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泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备
目的 探讨制备泡沫细胞相关基因4多克隆抗体的方法.方法 将从人胎肝文库经聚合酶链反应扩增获得的泡沫细胞相关基因4基因全长cDNA序列,通过生物信息学分析,预测泡沫细胞相关基因4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域,并进行了多序列比对,并根据蛋白质的亲疏水性、二级结构、偶联难度及实验难度等,确定泡沫细胞相关基因4抗原13肽PKLVKEEVFWRNY,采用固相多肽合成法合成该抗原片段,偶联后经过基础免疫,6次加强免疫,经追踪检测,于第四次免疫后10～14天颈动脉放血,分离血清,冷冻抽干,-20℃保存而制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体.结果 用固相多肽合成法成功制备了泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体,该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1:16 000,Western blot检测可见40kDa处有目的带,用免疫组织化学方法从HepG2细胞中检测到泡沫细胞相关基因4蛋白表达,证实该抗体具有较好的反应性和特异性.结论 固相多肽合成法省时、省力、制备的抗体效价高;泡沫细胞相关基因4兔抗人多克隆抗体的制备,为进一步研究泡沫细胞相关基因4蛋白在动脉粥样硬化中的功能作用奠定了基础.
关键词： 病理学与病理生理学 泡沫细胞相关基因4蛋白 多肽合成 多克隆抗体 制备 -
一种新Pre-S(2)合成肽CTL表位糖基化方法
目的为研究HBV Pre-S(2)上糖基化(Glycosylation)结构差异(包括位置、种类、数量和糖链长度差异)与其生物学活性关系,建立一种N-或O-连接糖基化以外的合成肽α-和ε-氨基糖基化方法.方法用化学方法将单、双和聚糖共价连接在Pre-S(2)合成肽上的含α-和ε-氨基的氨基酸残基上,即具体连接在肽N端M1的α-氨基和K16的ε-氨基上.此二氨基酸残基位于或接近Pre-S(2)上公认的一个CTL表位,氨基酸残基1～15.结果Pre-S(2)合成肽聚糖(Mannan)、单糖(GalNAc)和双糖(Glc-Gal)糖基化的收益率分别为24.0%、24.5%和21.0%.经还原处理后,稳定性显著增加.HPLC图谱显示一包容峰.结论结果显示此方法具较高的糖基化效率,为研究Pre-S2糖肽免疫学活性提供了一种新手段.但存在糖基化的均一性欠佳,费时较长的缺点.
关键词： 糖基化 多肽合成 Pre-S(2) 高压液相色谱(HPLC) -
尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、筛选及鉴定
目的 预测、筛选及合成尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)表位,初步鉴定EWS-FLI1表位肽.方法 综合运用BIMAS、SYFPEITHI、Predep和IEDB方案对EWS-FLII蛋白进行HLA-A*0201限制性CTL表位的预测,应用多项式方案、量化基序方案对预测的CTL表位进行筛选,并将筛选的CTL表位与HLA-A*0201分子进行动力学模拟,应用标准Fmoc方案合成CTL表位肽;通过表位多肽刺激CTL释放颗粒溶素的检测,以及靶细胞杀伤实验验证表位多肽的免疫效应.结果 综合预测得出了8个可能的表位肽,进一步筛选确定其中4个肽为候选合成表位,应用分子动力模拟初步验证了4个候选表位肽与HLA-A2.1分子的结合力,合成的各条肽经色谱分析纯度均在98%1;2上,经质谱分析各肽的分子量测定值与理论值相符,颗粒溶素释放实验及靶细胞杀伤实验证实了筛选的表位均能产生刺激效应,其中,表位肽QIQLWQFLL(EWS-FLI1 304)的刺激效应为显著.结论 综合运用多个方案可提高预测效率,分子动力学模拟可初步验证表位肽与HLA-A*0201 的结合力,所合成的多肽为高纯度肽,通过免疫学实验初步鉴定了EWS-FLI1的表位.
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蜂毒肽片段的合成及其在治疗类风湿关节炎中的作用
为了保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,降低溶血性和致敏性,设计合成蜂毒肽的片段,观察它对兔免疫性关节炎的治疗作用.采用多肽合成法合成蜂毒肽结构中亲水性片段,经高效液相色谱(HPLC)及质谱(MS)分析.建立家兔卵蛋白性关节炎模型,进行溶血性试验、致敏性试验以及动物模型治疗实验.结果蜂毒肽片段溶血率<5%,致敏率<8% ,动物模型治疗有效率可达到70%.蜂毒肽片段可有效地保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,减低蜂毒肽的强溶血活性及致敏活性.
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噬菌体随机肽库筛选动脉粥样硬化相关多肽
目的 利用噬菌体展示技术筛选动脉粥样硬化疾病相关多肽,并验证所筛选的阳性噬菌体以及合成蛋白片段结合活性.方法 以动脉粥样硬化患者血清为靶分子,噬菌体12肽库亲和筛选与之结合的阳性噬菌体.经过3轮筛选,从滴度测定平板上随机挑取10个阳性克隆,ELISA鉴定其亲和性.提取阳性噬菌体单链DNA并测序得到12肽序列,通过生物信息学查找相似天然蛋白,合成24肽,后鉴定其结合活性.结果 ELISA显示阳性噬菌体均与患者血清有较强的结合力,序列为GPRPPSAPNMPL,合成24肽也呈现出较高的结合活性.结论 噬菌体展示可以获得动脉粥样硬化相关多肽序列,为该病的免疫研究奠定了基础.
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间接偶联法合成Aβ1-15多重抗原肽疫苗及其免疫学活性
目的:探索合成Aβ1-15多重抗原肽疫苗的方法,并对其免疫学活性进行鉴定.方法:采用间接偶联法合成8分支Aβ1-15多重抗原肽(MAP),通过高效反相液相色谱(RP-HPLC)、SDS-PAGE以及氨基酸成分分析对其进行初步鉴定.以合成的MAP Aβ1-15免疫C57BL/6小鼠,用ELESA法检测血清特异性抗Aβ抗体.结果:间接偶联法合成的MAP Aβ1-15,经RP-HPLC层析后,呈现为一宽大主峰.SDS-PAGE检测显示,共有8条蛋白带,条带梯度比较均匀,分别为1～8分支的MAP Aβ1-15,氨基酸组份及含量基本与Aβ1-15多肽的序列一致.以合成的MAP Aβ1-15疫苗免疫C57BL/6小鼠后,可产生高滴度的特异性抗Aβ抗体.结论:间接偶联法可成功地合成MAP Aβ1-15疫苗,且具有很好的免疫学活性,但合成的MAP产物难以纯化.
关键词： 间接偶联法 多肽合成 Aβ1-15多重抗原肽疫苗 免疫学活性 -
固相多肽合成法基本原理及其在抗体制备中的应用
抗体是研究蛋白质和检测基因表达的一个常用的工具,而用固相合成多肽的抗体制备技术正倍受关注.本文综述了固相多肽合成法的基本原理、实验过程、在抗体制备中的应用及与基因工程抗体制备术的比较,分析并展望了今后的发展趋势.
