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慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测
目的:探讨慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC的表型和功能及其与免疫耐受的关系.方法:选择慢性HBV感染者25例、HBV阳性肝癌患者11例及正常人15名,从外周血中分离单个核细胞,用细胞贴壁法富集DC,流式细胞术测定DC HLAⅡ和共刺激分子的表达,同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力,ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平.结果:慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者HLAⅡ和共刺激分子的表达水平、抗原提呈能力和Th1类细胞因子的水平均低于正常(P＜0.05)其中肝癌患者尤为明显,而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P＞0.05).结论:慢性HBV感染与HBV阳性肝癌患者免疫耐受与DC的缺陷有关.
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骨髓间充质干细胞在难愈性创面治疗中的研究进展
一、BMSCs的概念和来源骨髓间充质干细胞的观点先由德国病理学家Cohnhein提出.1976年Friedenstein等[1]报道,应用贴壁法从骨髓中分离出某种单核细胞,发现这种单核细胞在一定的条件下可分化成为多种来源于中胚层的间充质干细胞(MSCs)如:骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等,因而把这种细胞称为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs).它的含量在骨髓中为丰富,随着研究的深入,近年来越来越多的骨髓以外的间充质干细胞陆续被人们发现,在脐血、外周血、卵黄囊、脾脏、肾脏、牙髓、肌肉、脂肪、羊膜及真皮组织中均有间充质干细胞的存在.因此很多学者认为这种具有多分化潜能的间充质干细胞广泛存在于多种器官间质及结缔组织中[2～6].
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三种分离人外周血单核细胞方法的比较
目的:用3种方法从人外周血分离单核细胞,比较细胞纯度、得率、实验成本及所需时间,选择适宜的分离方法.方法:用密度梯度离心法获得外周血的单个核细胞,分别用贴壁法、免疫磁珠法和流式细胞术法进一步分离单核细胞.经CD14抗体标记,用流式细胞术检测细胞纯度,计算细胞得率、实验成本及所需时间.结果:用贴壁法、免疫磁珠法和流式细胞术法分离单核细胞,细胞纯度分别为18.8％、80％和73.4％;细胞得率为5％、11％和7.5％;每获得2×107个单核细胞,实验成本约500元、1 500元和2 100元,实验耗时约6h、6h和10h.结论:免疫磁珠法是适宜的分离人外周血单核细胞的方法,具有细胞纯度与得率较高,实验成本较低,耗时较短的优点.
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贴壁法和密度梯度离心法分离经血源性子宫内膜间充质干细胞的比较研究
目的：比较贴壁法和密度梯度离心法对经血源性子宫内膜间充质干细胞（MB-MSCs）的分离效果。方法：选择25～35岁月经周期正常的健康女性的月经血，分别采用贴壁法和密度梯度离心法分离MB-MSCs并进行传代。镜下观察原代细胞形态变化；对比原代及第2、3代细胞传代时间；流式细胞仪检测表面标志物；阿尔辛兰染色检测其成软骨能力。结果：贴壁法分离的原代细胞呈聚集样生长，密度梯度离心法分离的原代细胞6 d后也呈聚集样生长。贴壁法分离原代细胞的传代时间（14.58±1.31）d明显快于密度梯度离心法（19.17±1.34）d，差异有显著意义（P<0.05）；第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义（P>0.05）。经流式细胞仪检测，两种方法分离的MB-MSCs阳性表面标志物CD44、CD29、CD105、CD73含量和阴性表面标志物CD31、CD45含量比较差异无统计学意义（P>0.05），两种方法分离的第3代细胞经成软骨诱导后比较无显著差别。结论：采用贴壁法与密度梯度离心法分离MB-MSCs效果相似，但贴壁法更适用于早期快速获得纯度较高的细胞。
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贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证
背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.
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全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞
背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞，是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。
目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法，并观察其生物学特性。
方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养，贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征，绘制细胞生长曲线，检测细胞表面标记物，采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。
结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高，细胞生长形态呈长梭形，极性排列，细胞生长呈S形生长曲线，群体倍增时间为29 h，细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达，CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后，茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法，能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞，经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性佳，且具有多向诱导分化能力，适合作为后续实验的种子细胞。 -
蜗轴螺旋动脉平滑肌的培养及其鉴定
目的:本研究通过联合两种常用的细胞培养方法,建立了一个蜗轴螺旋动脉平滑肌细胞原代培养的模型.方法:分离的蜗轴螺旋动脉的平滑肌来自于豚鼠.切碎血管组织并且将其放入37度的0.1%胰蛋白酶溶液中消化20分钟.消化后,将这些消化后的组织块在35-mm的培养皿中贴壁.运用这种培养方法,混杂的成纤维细胞通过与血管平滑肌细胞不同的贴壁能力,可在传代的时候被去除.在7-10天后,细胞从组织块中长出来.大约3周,细胞可长满培养皿.在第三代培养的血管平滑肌细胞中,纯的并且活性好的细胞可以被活得.经过形态学,免疫荧光化学和电镜对这种方法得到的血管平滑肌细胞进行了鉴别.结果:显示了典型的平滑肌的细胞的特点:形态学的"峰-谷"样的生长形态,免疫荧光化学显示这些细胞表达平滑肌细胞的特异性标志物(α-SM-actin和myosin.结论:通过本文研究方法得到的大量的纯的蜗轴螺旋动脉血管平滑肌细胞是一个很好的研究血管平滑肌细胞在内耳循环紊乱过程生理功能的一个体外模型.除此之外,还可以是一些作用于血管平滑肌药物评价的体外模型.
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贴壁法与悬浮法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的对比研究
目的 对比研究直接贴壁法与悬浮法分别诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞所需的时间、分化成功率,以及分化后细胞的活性、抗缺氧凋亡刺激的能力.方法 人胚胎干细胞分别通过悬浮法和直接贴壁法诱导分化为心肌细胞.免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物cTnT;显微镜下计数比较两组细胞诱导分化出现跳动心肌细胞的时间、百分比和跳动频率;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例.结果 直接贴壁法诱导分化为心肌细胞的成功率更高(66.7％比20.8％,P＜0.05);大量的自发跳动心肌细胞出现时间直接贴壁法早与悬浮法,差异有统计学意义[(13.0±1.1)天比(13.9±0.9)天,P＜0.05];分化的心肌细胞cTnT染色均阳性,均检测到自发性动作电位;分化后的心肌细胞平均跳动频率范围两种方法相仿[(63.0±7.0)次/分比(63.8±5.6)次/分,P＞0.05];跳动心肌细胞缺氧24h后检测到的凋亡比例比较差异无统计学意义[(8.0±0.5)％比(8.1±0.4)％,P＞0.05].结论 两种方法均能成功诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,直接贴壁法分化成功率更高,所需分化时间较短;两种方法分化出的心肌细胞在细胞活性方面以及抗凋亡能力方面无明显差异.
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不同培养条件对骨髓基质细胞贴壁及增殖的影响
银屑病是一种以T细胞为主、多种免疫细胞共同参与发病的慢性炎症性皮肤病.经过数年研究并结合国内外研究结果,推测骨髓造血细胞可能参与了银屑病的发病<'1-3>,为进一步研究骨髓造血细胞在银屑病发病中的作用,我们拟将银屑病患者和正常人骨髓移植于SCID鼠,用贴壁法培养骨髓基质细胞,并将其注射于经骨髓移植的SCID鼠腹腔内.在实际培养过程中发现一些问题,现将结果报道如下,供同仁们借鉴.
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贴壁法体外培养小鼠神经干细胞
神经干细胞是神经组织特异性的具有多向分化潜能的一类干细胞[1].国内外对神经干细胞的分离、培养已有较多研究,不同的实验室有不同的培养方法及培养条件.但用贴壁法体外培养神经干细胞的研究很少见报道,本实验成功地用贴壁法对小鼠的神经干细胞进行了分离、培养和细胞鉴定,并对其生长方式进行了观察.现报告如下.
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无血清条件下骨髓间充质干细胞增殖及分泌VEGF的实验研究
目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同无血清培养时间下增殖及分泌血管内皮生长因子(VEGF)的规律.方法 采用贴壁培养法纯化BMSCs,流式细胞仪鉴定第3代(P3)BMSCs的细胞表型;比较BMSCs在不同无血清培养时间下的细胞凋亡率;将BMSCs分为无血清培养12、24、36、48及72 h组,用ELISA方法检测VEGF的分泌.结果 原代BMSCs培养24 h后贴壁生长良好;经流式细胞仪检测,BMSCs表面CD34、CD45阴性,而CD29、CD44、CD90阳性,符合BMSCs特征;无血清培养12、24、36、48、72 h后细胞凋亡率组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),培养96 h后凋亡率与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05);随着无血清培养时间的延长,BMSCs分泌VEGF 逐渐增多(P<0.05),无血清培养72 h组分泌VEGF水平高.结论 大鼠BMSCs在无血清培养条件下,72 h内细胞凋亡无明显增多,且随着无血清培养时间的延长,分泌VEGF 逐渐增多.
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Nycodenz-密度渗透压介质离心分离人外周血单核细胞研究
目的 研究人外周血单核细胞分离方法.方法 采集24名健康志愿献血者外周血,分别以EDTA-K2、肝素钠、枸橼酸钠抗凝,将抗凝全血或单个核细胞悬液缓慢加入不同密度和渗透压组合的Nycodenz-NaCI溶液上层,离心分离单核细胞;EDTA抗凝血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的单个核细胞,再分别用Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法、Percoll密度梯度离心法、贴壁法、MACS(抗CD-14磁珠)分离单核细胞.结果 如上4种方法 获得的单核细胞纯度和收获率中位数(M)分别为98.9%和68.5%、89.6%和64.5%、64.8%和60.5%、94.1%和73.5%,比较显示Nycodenz法获得的单核细胞纯度高(P<0.01);吞噬指数和趋化指数分别为188.8±11.2和26.8±5.9、187.8±12.2和26.1±5.1、144.4 ±24.8和15.4±7.3、177.1 ±18.3和18.9±6.7.统计表明Percoll法和Nycodenz法获得的单核细胞的吞噬指数、趋化指数高于贴壁法和MACS法(P<0.05);单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平(pg/ml)分别为2 545±341、1 216±397、3.999±418,2 489±425、1080±277、3 891±446,2 147±223、794±180、3268±411,35±12、142±81、407±199,比较得知MACS的单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平非常显著低于其他方法 (P<0.01);单核细胞经典亚群CD14+CD16-HLA-DR+百分比和非经典亚群CD14+CD16+HLA-DR+百分比(M)分别为89%和5%、88%和1%、73%和1%、51%和36%,统计表明MACS法的单核细胞经典亚群百分比明显低于其他分离方法 (P<0.01),而非经典亚群百分比明显高于其他方法 (P<0.01).结论 Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法能够分离获得较高纯度、较多经典型的单核细胞.
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骨髓间充质干细胞的体外培养
目的 建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离纯化的方法,探索MSCs体外培养的佳方法.为细胞工程学提供细胞来源.方法 ①MScs的分离、培养:在无菌条件下取3～4周龄Wistar雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞,采用裂解红细胞后的贴壁培养法分离MSCs,利用MSCs与其他贴壁细胞的贴壁差异性,严格控制传代时酶的量和消化时间.传代纯化MSCs;②MSCs的鉴定:取第4代(P4)MSCs,用免疫荧光染色的方法检测MSCs的表面抗原CD44、CIM5和CD90.结果 ①采用裂解红细胞分离骨髓细胞得到的骨髓单个核细胞形态较多样,分布不均,含杂细胞多,随换液和传代次数增多,细胞纯度提高,P4后细胞形态一致,分布均匀,几乎不见杂细胞;②免疫荧光染色结果显示:P4代MsC8经加入一抗、二抗及荧光染料后见CD44、CD90染色呈阳性,CD45染色呈阴性反应.结论 采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离、纯化MSCs,可得到活性和纯度均较好的MSCs.
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一种改进的人脐静脉平滑肌细胞培养方法
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle,VSMC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位.采用培养的VSMC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法.由于人体组织取材限制,很难获取大量原代培养的人VSMC.本室以健康胎儿脐静脉血管为材料,建立起一套完整的人脐静脉平滑肌细胞(human umbilical vein smooth muscle cells,hUVSMC)培养方法,具有周期短,细胞长出率高,可大规模培养等特点.
