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血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞体外侵袭转移的影响
目的:探讨血管内皮生长因子165基因(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)对胃癌侵袭转移的影响及可能的机制.方法:通过体外培养人胃癌细胞BGC-823,分别转染Ad-GFP及Ad-VEGF165*应用Millicell小室分析VEGF165转染前后胃癌细胞迁移能力的变化:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究VEGF懈转染前后BGC-823细胞MMP-2、u-PAmRNA表达变化.结果:迁移实验结果显示Ad-VEGF15组胃癌细胞迁移能力高于Ad-GFP组及对照组(217.53±15.77vs174.07±13.83,167.5±11.5,P＜0.05);RT-PCR结果显示VEGF懈转染后促进了BGC-823细胞MMP-2、u-PA的mRNA表达,Ad-VEGF165组MMP-2、u-PA的mRNA水平明显高于对照组及d-GFP组((MMP-2mRNA:0.6646±0.0486 vs 0.3803±0.0254.0.4096±0.0668;u-PA mRNA:0.8216±0.0798vs0.4043±0.0620,0.406±0.1158,均P＜0.05).结论:经VEGF165转染后,胃癌细胞迁移能力增强,MMP-2、u-PA的mRNA表达增加,MMP-2、u-PA表达的增加可能为VEGF促进胃癌侵袭转移机制.
关键词： 血管内皮生长因子165 胃癌 迁移 转移 -
转染VEGF165的大鼠血管内皮细胞与胰岛共移植对糖尿病大鼠的治疗作用
目的:探讨VEGF165转染大鼠血管内皮细胞诱导移植胰岛再血管化及对功能的影响.方法:受体糖尿病大鼠随机分为3组,对照组于肾被膜下移植300当量(1当量相当于1个直径为150 um的胰岛)胰岛,转染组和内皮细胞组分别加入1×106转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165的血管内皮细胞和正常血管内皮细胞.移植后监测血糖及血清胰岛素水平.术后10 d行静脉糖耐量实验(IVGTT).术后14 d,取受者肾脏HE染色及Insulin-6,VEGF和CD34免疫组化染色,计算微血管密度.结果:实验组大鼠于移植术后3 d血糖及胰岛素水平恢复正常.对照组和内皮细胞组虽有所改善,但未恢复到正常水平.IVGTT显示实验组K值(K=2.69)与正常大鼠相似,对照组和内皮细胞组K值分别为1.9和1.87,两组间无明显差异,而与实验组有明显差异(P＜0.05).实验组大鼠肾被膜下可见成团胰岛,Insulin-6免疫组化呈阳性,周围及内部有大量内皮细胞.VEGF1635免疫组化及CD34免疫组化染色呈阳性.对照组和内皮细胞组肾被膜下的细胞团中心细胞较少,部分被纤维组织代替,内部仅有少量CD34染色阳性的内皮细胞.Insulin-6免疫组化仅有少量细胞染成棕黄色.VEGF165免疫组化呈阴性.对照组(11.43±2.22)和内皮细胞组MVD(10.9±2.45)无显著差异,而与实验组间(74.3±6.74)有明显差别(P＜0.05).结论:VEGFi65转染大鼠血管内皮细胞可以诱导移植胰岛新生血管生成,促进再血管化,降低移植胰岛早期死亡率,减少供胰用量.
关键词： 胰岛移植 再血管化 血管内皮生长因子165 基因转染 血管内皮细胞 -
血管内皮生长因子165基因对人胃癌细胞凋亡的影响及机制
目的: 本实验探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)对体外培养的胃癌细胞株BGC-823凋亡的影响和机制.方法: 将BGC一823细胞分为对照组、感染复数(MOI=20)病毒Ad-GFP的Ad-GFP组,重组腺病毒Ad_VEGF165转染的Ad-VEGF165组,应用流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率,R11-PCR方法检测凋亡抑制基因Bc1-2mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测Bc1-2蛋白的表达情况.结果: 流式细胞仪测定显示Ad-VEGF165组的细胞凋亡率明显低于Ad-GFP组和对照组(4.6%±0.31% vs 8.37%±1.06%.7.73%±0.86%,P.<0.01):RT-PcR和细胞免疫化学结果显示VEGF165转染BGC.823细胞后促进了细胞Bc1-2mRNA和蛋白的表达,Ad.VEGF165组Bc1-2 mRNA和蛋白均高于对照组和Ad-GFP组(Bc1-2 mRNA:0.761±0.05 vs 0.363±0.12,0.356±0.08:Bc1-2蛋白:1.010±0.08 vs 0.865±0.07,0.901±0.05;P<0.01).结论: VEGF165通过上调凋亡抑制基因Bc1-2及其蛋白的表达,来抑制血浆饥饿诱导的胃癌细胞的凋亡.
关键词： 腺病毒 血管内皮生长因子165 胃癌 凋亡 Bd-2 逆转录聚合酶链式反应 -
VEGF165b在肝细胞癌中的表达及其作用机制
目的:研究血管内皮生长因子165b(vascular endothelial growth factor 165b,VEGF 165b)在肝细胞癌和正常肝组织中的表达情况,初步探讨其与肝细胞癌的关系和作用机制.方法:用免疫组织化学法检测28例肝细胞癌组织和30例正常肝组织中VEGF165b蛋白的表达情况;用RT-PCR法分别检测肝细胞癌和正常肝组织中VEGF165b和VEGF165mRNA的表达情况.用Western blot法检测上述肝细胞癌组织和正常肝组织中VEGF165b和VEGF165蛋白的表达情况.用Western blot法检测上述肝细胞癌和正常肝组织中FAK和P-Akt蛋白的表达情况.结果:正常肝脏组织中VEGF165b蛋白表达率为96.67％(29/30),肝细胞癌组织中VEGF165b蛋白的表达率为21.4％(6/28),表达差异有统计学意义(P＜0.05).VEGF165b mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达明显低于正常肝脏组织的表达(P＜0.01).VEGF165 mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织的表达(P＜0.01).FAK和P-Akt蛋白在肝癌组织中的表达明显高于正常肝脏组织的表达(P＜0.01).结论:VEGF165b在肝细胞癌组织中的表达明显低于正常肝组织的表达,而VEGF165和FAK、P-Akt在肝细胞癌组织中的表达明显高于正常肝组织的表达.提示VEGF165b与肝癌发生、发展有关,其机制可能是VEGF165b抑制VEGF165、FAK和P-Akt表达及他们的促进血管生成、肿瘤生长作用.
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经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究
目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于SD大鼠深度创面(实验组),对动物创面愈合情况进行观察.单纯脱细胞异种真皮替代物移植大鼠作为对照组.结果:构建的真核表达载体pcDNA31(+)-VEGF165可成功转染至鼠成纤维细胞,移植后实验组皮片成活率(9376±340)%,对照组皮片成活率(8501±174)%,两者差异有显著性(t=8873,P＜001).组织学观察显示,移植第4周实验组毛细血管数量明显多于对照组.结论:成功构建了经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,且其具有明显的促进动物创面愈合作用.
关键词： 血管内皮生长因子165 脱细胞异种真皮 转染 接种 移植 -
血管内皮生长因子165转染血管内皮祖细胞治疗大鼠脑创伤的研究
目的 探讨血管内皮生长因子165基因(VEGF165)转染血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)并通过鼠尾静脉移植对脑损伤大鼠行为学以及脑创伤区神经-血管再生的影响.方法 选用4月龄雄性SD大鼠,由河南省实验动物中心提供,体重约200 g,分离培养大鼠外周血来源的血管内皮祖细胞,进行VEGF165转染.选取健康雄性大鼠90只按随机数字表法分为转染组、普通EPC组和正常对照组.各组动物均行中度颅脑损伤打击,术后转染组给予VEGF165转染的EPC鼠尾静脉移植,普通EPC组给予未转染的EPC移植,对照组注射等量细胞培养液,3组大鼠每日腹腔注射Brdu,分别于3、7、14 d每组随机抽取10只大鼠,处死前各组动物均按改良神经功能损伤严重程度评分(mNSS)评定神经功能,后断头取脑,做石蜡切片,行CD34+、Brdu免疫组化染色,在200倍光镜下观察创伤侧海马齿状回并计数阳性细胞,评估每组大鼠神经及血管再生情况.将所得各组实验数据采用单因素方差分析,LSD法检验,输入软件分析其数据差异是否有统计学意义.结果 在脑损伤后3、7、14 d各时间点测定的mNSS评分中,可得出转染组得分<普通EPC组得分<对照组得分,三组间差异有统计学意义(F=469.40、287.21、286.64,P均<0.05).各个时间点转染组大鼠脑片创伤侧海马齿状回CD34+、Brdu+细胞均显著高于普通EPC组及对照组,三组间有统计学差异(CD34+:F=321.88、82.62、284.02,P均<0.05;Brdu+:F=125.79、226.82、220.27,P均<0.05).结论 VEGF165转染血管EPC经鼠尾静脉移植能有效促进大鼠脑创伤侧神经血管再生,从而改善其预后.
关键词： 脑损伤 干细胞 免疫组织化学 神经行为学表现 血管内皮生长因子165 -
抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析
目的获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)抗体的轻重链可变区基因.方法从分泌具有中和抗血管内皮生长因子165活性的单抗杂交瘤细胞株VmD11中提取总RNA,经RT-PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析.结果抗体的轻链可变区基因321 bp,属于小鼠第V亚群;重链可变区基因354 bp,属于小鼠第Ⅱ(B)亚群.结论所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因.
关键词： 血管内皮生长因子165 可变区基因 RT-聚合酶链反应 核苷酸序列分析 -
VEGF165和SDF-1双基因共表达腺病毒载体的构建及其在大鼠缺血脑组织中的表达
目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)165与基质细胞衍生因子 (SDF)-1双基因共表达腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1,并观察其在缺血大鼠脑组织中的共表达情况.方法 将VEGF165和SDF-1基因通过内部核糖体进入位点(IRES)进行定向连接,以同源重组的形式构建双基因共表达重组穿梭质粒pDC316-VEGF165-IRES-SDF-1,将其与骨架质粒pBHGlox_E1以脂质体转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,经多轮扩增后获得纯化的腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1;以线栓法构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,并以立体定向微量注射的方法将构建的病毒载体注入大鼠侧脑室,以RT-PCR和免疫印迹法观察其介导VEGF165和SDF-1基因在缺血脑组织中的共表达情况.结果 PCR、双酶切和基因测序等结果显示,重组质粒和腺病毒载体构建正确,并能够介导VEGF165和SDF-1两种基因在缺血的大鼠脑组织内共表达.结论 成功构建了携带VEGF165和SDF-1双基因的腺病毒载体Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1,Ad5-VEGF165-IRES-SDF-1可以介导VEGF165和SDF-1双基因在缺血大鼠脑组织内共表达.
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采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建
目的 构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T,避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应.方法 根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒],再将这两个质粒共转染HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况.结果 实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较,共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18,均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05,均P<0.01),EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16,均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06,均P<0.01).该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中,并干扰了EZH2的表达.结论 采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系.
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JAK2/STAT 3通路对大鼠脑出血周围组织VEGF165等的保护作用
目的 测定蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)、信号通路特异性拮抗剂α-氰基-(3,4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG-490)对大鼠脑出血周围组织血管内皮生长因子165(VEGF165)、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2(P-JAK2)、磷酸化信号转导和转录激活子3(P-STAT3)表达的影响,分析VEGF165与P-JAK2、P-STAT3的相关性,探讨VEGF165对大鼠脑出血后的神经保护作用是否由JAK2/STAT3信号通道介导.方法 将健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只随机分为假手术组、脑出血组和AG-490组.采用大鼠自体血注入法建立脑出血模型;各组按造模成功后时间分为6h、24 h、48 h、72 h、7d5个亚组,比较各组大鼠进行神经功能缺损评分(NSS);免疫组化染色检测血肿周围VEGF165表达,采用Western blotting检测大鼠血肿周围脑组织P-JAK2、P-STAT3的表达.结果 脑出血组和AG-490组VEGF165、P-JAK2、P-STAT表达均高于假手术组(P＜0.05),并于造模后48 h达高峰(P＜0.05);AG-490组VEGF165、P-JAK2、P-STAT表达较脑出血组低(P＜0.05);脑出血组VEGF165的表达与神经功能的缺损评分呈负相关(r=-0.511,P＜0.05),VEGF165与P-JAK2、P-STAT3的表达呈正相关(r=0.562,P＜0.05;r=0.479,P＜0.05).结论 VEGF165对大鼠脑出血后的神经保护作用可能是由JAK2/STAT3途径介导.
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骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染小鼠骨髓基质干细胞的体内诱导成骨
目的:观察骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染的小鼠骨髓基质干细胞是否具有异位诱导成骨能力.方法:脂质体介导下将pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达;将转染双基因的小鼠骨髓基质干细胞植入裸鼠大腿后群肌袋内,4周后用影像学和组织学方法观察体内诱导成骨效果.结果:转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞扩增出1.2 kb及590 bp两条带,胞浆中有棕黄色颗粒阳性信号.该细胞植入裸鼠大腿后群肌袋4周后有大量异位骨形成.结论:转染骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因的小鼠骨髓基质干细胞具有较强诱导异位成骨能力.
关键词： 骨髓基质干细胞 异位骨 骨形态发生蛋白2 血管内皮生长因子165 -
细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体
背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.
关键词： 腺病毒载体 血管内皮生长因子165 构建 -
骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植促进缺血皮瓣血管的生成
背景:如何促进大块组织工程骨早期血管化是目前研究的热点.通过细胞共培养以及添加生物活性因子来促进血管生成均是很好地促进早期血管化的方法.目的:探讨骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染的人脐静脉内皮细胞共移植在体内促进血管生成的能力,为构建血管化组织工程骨修复大段骨缺损提供理论依据和实验基础.方法:50只SD大鼠完全随机分入5组,每组10只,于SD大鼠背部中线上建立一个4 cm×1.5 cm大小的缺血皮瓣模型,分别移植骨髓间充质干细胞与 VEGF165基因转染的人脐静脉内皮细胞(A 组)、单独转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(B组)、骨髓间充质干细胞与未转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(C组)、未转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(D组)、DMEM培养基(E组).ELISA检测外周血VEGF水平,组织学观察其皮瓣存活状况及微血管密度.结果与结论:①术后A组皮瓣存活质量较其他4组高;②A组、B组术后第2,4,7,14天外周血中的VEGF持续高表达且逐渐升高,第7天时达到峰值,第14天时较术后第2天明显下降.不同时期A组外周血中VEGF水平明显高于其他4组,差异有显著性意义(P < 0.05);③术后第11天,A组皮瓣存活率高于其他4组,差异有显著性意义(P < 0.05);④术后第11天,A组微血管密度远远大于其他4组,差异有显著性意意义(P < 0.05);⑤结果表明,骨髓间充质干细胞与VEGF165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植可促进缺血皮瓣血管化,提高缺血皮瓣存活率.
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血管内皮生长因子165转染脐静脉内皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养在血管形成中的作用
背景:组织工程骨早期血管化是目前亟待解决的难题,细胞共培养以及添加生物活性因子来促进血管生成均是很好地促进早期血管化的方法.目的:探讨人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cels,HUVECs)过表达血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)后与小鼠骨髓间充质干细胞共培养在血管形成中的作用.方法:腺病毒介导VEGF165转染HUVECs,并分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,进行共培养.实验分组如下:①转染共培养组:AdVEGF165-HUVECs+骨髓间充质干细胞;②转染非共培养组:AdVEGF165-HUVECs;③空载体共培养组:AdGFP-HUVECs+骨髓间充质干细胞;④空载体组:AdGFP-HUVECs;⑤未转染共培养组:HUVECs+骨髓间充质干细胞;⑥空白对照组:HUVECs.采用CCK8法检测HUVECs的增殖能力,结晶紫染色检测HUVECs的迁移能力,Matrigel法检测HUVECs的血管形成能力.结果与结论:①与空白对照组相比,转染共培养组、转染非共培养组、空载体共培养组、未转染共培养组的细胞增殖能力均明显增加(P<0.05);②与空白对照组相比,转染共培养组人脐静脉内皮细胞数量多(P<0.05);③与空白对照组相比,转染共培养组形成的小管数目更多形成时间更早,更稳定(P<0.05);④结果表明,VEGF165转染HUVECs和骨髓间充质干细胞共同作为种子细胞能更好地促进早期血管生成.
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血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化
背景:骨髓间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞,具有多向分化潜能,可通过腺病毒转染等方法对其进行基因修饰,使其能够产生多种生长因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)、血管生成素1(angiopoietin 1,Ang-1)等,从而应用于组织工程研究中.目的:探讨VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞诱导分化的可能性.方法:采用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行流式细胞术和成骨、成脂诱导分化能力鉴定.以巨细胞病毒(CMV)作为启动子,构建2个腺病毒载体,其一为双顺反子载体,携带hVEGF165及Ang-1基因(Adv-Bic);其二为携带NT-3基因载体,即AdvNT-3.以不同感染复数值将Adv-Bic(绿色荧光)及AdvNT-3(红色荧光)同时转染大鼠骨髓间充质干细胞,转染2 d后根据荧光显微镜下绿色及红色荧光蛋白表达情况确定佳感染复数值.将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分为2组,实验组以适感染复数值转染Adv-Bic(无荧光标记)及AdvNT-3(无荧光标记);对照组以相同感染复数值转染空白对照病毒.两组分别于体外培养7 d后进行免疫荧光及qPCR检测.结果与结论:①间质干细胞表面分子CD29、CD44呈阳性表达,造血干细胞表面分子CD34、CD45呈阴性表达.骨髓间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞及脂肪细胞;②病毒转染骨髓间充质干细胞48 h后荧光显微镜下观察有绿色及红色荧光蛋白表达,随着感染复数值增大荧光表达量逐渐增强,感染复数值为100时荧光表达强烈;③免疫荧光及qPCR结果显示,实验组VEGF165、NT-3、Ang-1表达水平高于对照组,且血管内皮特异性标记物CD31、CD34表达水平高于对照组,神经元特异性标记物NSE、Nestin表达水平高于对照组;④结果提示,VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染骨髓间充质干细胞,使其过表达VEGF165、NT-3、Ang-1生长因子,能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经元及血管内皮细胞.
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慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化
背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义.目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能.方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:①未转染组;②空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;③BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);④BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP).转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性.结果与结论:①空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;②转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);③BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);④BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;⑤结果表明,慢病毒介导的hBMP-2和hVEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化.
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血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖
背景：目前自体脂肪移植已广泛运用于美容整形和修复创伤导致的软组织缺损的修复，有研究表明，移植后1年移植脂肪存活率为20%-80%，因此，在移植后的早期及时、充分的血供建立，对于移植脂肪的存活是非常重要的。目的：观察血管内皮生长因子165转染人脂肪间充质干细胞的增殖情况。
方法：体外传代培养人脂肪间充质干细胞，将重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒液和空病毒液转染至脂肪间充质干细胞内，分别设为实验组和对照组，另设正常培养的细胞为空白组。
结果与结论：RT-PCR，Western blot，MTT 检测显示，与对照组和空白组相比，实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达及细胞增殖均增高(P<0.05)。结果证实，腺病毒承载的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达目的蛋白，同时也能显著促进脂肪间充质干细胞的增殖。 -
人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial ；cel line - derived neurotrophic factor， GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165， VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。
目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-GDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。
方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因，然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES 2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。
结果与结论：DNA测序显示，提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带，经 Bam HI/Not I 双酶切后切出IRES-VEGF 165片段，经Bgl II/Not I双酶切后切出 GDNF-IRES-VEGF 165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。 -
pIRES 2-BDNF-VEGF 165真核表达载体的构建与鉴定
背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。
目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。
方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因，然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建为pIRES 2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。
结果与结论：DNA测序显示，提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES-VEGF 165基因片段，经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 -
人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定
背景:人向血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标:构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法:是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论:DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.
