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缺氧对人胰腺癌细胞整合素α5、β1表达的影响
目的 探讨缺氧环境对人胰腺癌细胞株PANC1诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、整合素α5(integrinα,INFα5)和整合素β1(integrinβ1,INTβ1)表达及侵袭力的影响.方法 以5%氧条件下培养PANC1,采用RT-PCR和Western blot 检测 HIF-1α、INTα5、的mRNA 和蛋白表达;采用Matrigel胶观测人胰腺癌细胞黏附侵袭能力的变化.并加入HIF-1α抑制剂YC-1缺氧培养PANC1,观察上述各指标的变化.结果 HIF-1α蛋白表达从常规培养时0.497±0.011逐渐上升到缺氧培养24h的1.455±0.133(P＜0.05),应用YC-1后蛋白表达下降到0.465±0.073(P＜0.05),而HIF-1α mRNA 表达无明显变化;INTα5蛋白从常规培养时0.964±0.032逐渐下降到缺氧培养24h的0.465±0.073(P＜0.05),应用YC-1后蛋白表达又上升到0.883±0.013(P＜0.05),INTα5mRNA的表达从0.212±0.023下降到0.018±0.002(P＜0.05),应用YC-1后再上升到0.069±0.011(P＜0.05);INTβ1的蛋白和mRNA 表达于缺氧培养及YC-1处理后均无明显变化.细胞侵袭力从常规培养时69.9±30.5逐渐上升到缺氧培养24h的105.0±14.9(P＜0.05),应用YC-1后又不降到79.7±20.9(P＜0.05).结论缺氧微环境下HIF-1α过表达可能通过下调INTα5来调控胰腺癌细胞间和细胞与基质间的黏附能力,有利于进一步侵袭转移.
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白介素-9促进人胰腺癌裸鼠移植瘤生长及其机制研究
目的 白细胞介素-9(IL-9)是机体重要的免疫因子,参与不同肿瘤的发生发展,而其在胰腺癌的生物学效应尚不清楚,为此探索IL-9对人胰腺癌裸鼠移植瘤的作用及其机制.方法 应用人胰腺癌细胞株PANC-1建立裸鼠皮下移植瘤模型.应用随机数字表法将64只裸鼠平均分成4组(16只/组),对照组予瘤内注射生理盐水0.1 mL,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别予瘤内注射90(低剂量组)、180(中剂量组)和360 ng(高剂量组)IL-9,各组均隔天干预1次,共注射8次.末次用药3d后,各组随机处死8只裸鼠,取各组移植瘤组织并测质量.采用免疫组织化学染色法检测瘤组织中STAT3、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达.蛋白质印迹法检测瘤组织中STAT3、p-STAT3.其余小鼠观察生存时间.结果 低剂量组、中剂量组和高剂量组移植瘤的平均质量分别为(216.01±37.15)、(261.63±39.85)和(323.12±46.71) mg,明显高于对照组移植瘤的(196.75士25.32) mg,F=17.447,P＜0.001;中(t=3.410,P=0.002)、高剂量组(t=6.643,P＜0.001)与对照组相比差异有统计学意义.与对照组相比,IL-9干预后裸鼠的生存期缩短(x2=18.850,P=0.003),高剂量组的平均生存时间显著降低(x2=11.347,P=0.001).蛋白质印迹法和免疫组化染色法检测结果显示,与对照组相比,IL-9干预后瘤组织内STAT3表达水平未见明显改变,而p-STAT3与表达水平显著升高,差异有统计学意义,均P＜0.001.免疫组织化学染色结果还显示,在不同剂量IL-9干预后的瘤组织中,与对照组相比Bcl-2表达无明显变化(x2=1.067,P=0.956),Cyclin D1表达升高,组间差异有统计学意义,x2=10.416,P=0.018.结论 IL-9能明显促进人胰腺癌裸鼠移植瘤生长,同时降低裸鼠的生存时间,该作用可能是通过激活STAT3磷酸化实现的.
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鼠抗人hMIC-l单克隆抗体抑制裸鼠移植人胰腺癌体内研究
目的：初步研究鼠抗人hMIC-l单克隆抗体对胰腺癌体内给药的抗肿瘤活性，为hMIC-l抗体应用于肿瘤治疗提供实验依据。方法2种人胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990各腋窝皮下接种24只Balb/c裸鼠，共计48只皮下接种荷瘤裸鼠分别随机共分为8组，每组6只荷瘤鼠。模型对照组荷瘤裸鼠腹腔注射0.9％氯化钠注射液（10 mL/kg，NS，Biw，ip ×8），阳性对照组荷瘤裸鼠腹腔注射键择（50 mg/kg，qw，ip ×4），鼠抗人hMIC-l单克隆抗体组分别荷瘤鼠尾静脉内注射鼠抗人hMIC-l单克隆抗体（10 mg/kg，Biw，ip ×8）共4周或（2 mg/kg，Biw，ip ×8）共4周。观察荷瘤裸鼠日常表现、肿瘤生长、实验后肿瘤组织切片HE染色后光镜下的组织形态学改变。结果荷瘤裸鼠尾静脉内注射鼠抗人hMIC-l单克隆抗体组裸鼠（10 mg/kg，Biw，iv ×8）肿瘤生长缓慢，瘤体明显小于模型对照组，并呈现量效关系。镜下观察鼠抗人hMIC-l单克隆抗体组实验后肿瘤组织切片胰腺结构破坏，有大量淋巴细胞浸润，肿瘤细胞明显坏死，细胞溶解。结论尾静脉内注射鼠抗人hMIC-l单克隆抗体（10 mg/kg，Biw，iv ×8）能有效抑制裸鼠移植人胰腺癌PANC-1肿瘤生长，使瘤组织坏死、结构破坏。
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胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的体外耐药性研究
探讨胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的体外耐药性。方法：经胰腺癌肿瘤干细胞表面标记途径和侧群(SP)细胞途径，分离人胰腺癌细胞株PANC-1内SP/NSP(非SP)细胞、CD44+CD24+/CD44-CD24-细胞亚群，采取MTT方法检测亚群细胞体外化疗药物耐受性，经实时荧光定量PCR检测耐药基因 ABCG2、ABCB1和 PLK-1表达情况。结果：人胰腺癌细胞株PANC-1内SP细胞构成比为(7.58±0.54)%，CD44+CD24+细胞构成比(2.58±0.85)%；SP、CD44+CD24+细胞化疗耐受性更强、抗凋亡效果更为明显；经荧光定量RT-PCR表明，SP、CD44+CD24+细胞耐药基因 ABCG2、ABCB1和 PLK1具有较高表达。结论：人胰腺癌细胞株PANC-1内SP 及 CD44+CD24+细胞存在明显化疗耐受性。
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华蟾素联合健择对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及细胞周期的影响
目的 观察华蟾素联合健择对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及细胞周期的影响.方法 ①采用MTT法检测华蟾素联合健择对人胰腺癌PANC-1细胞的增殖作用；采用流式细胞仪检测不同浓度华蟾素对人胰腺癌细胞PANC-1的细胞周期的影响；采用Western Blot检测PANC-1细胞pRb和Bax的蛋白表达水平.②将人胰腺癌PANC-1移植瘤裸小鼠随机分为对照组、健择组、华蟾素组、华蟾素加健择组,予药物干预后观察移植瘤生长情况,计算各组的抑瘤率.结果 人胰腺癌细胞株PACN-1预先给予浓度为0.5 U/ml的华蟾素2h后,再加入不同浓度的健择后的IC50为0.00 275 μg/ml；随着华蟾素浓度的增加,细胞周期停滞于S期；pRb的蛋白表达逐渐增强,而Bax的蛋白表达变化不显著.健择组、华蟾素组、华蟾索加健择组的抑瘤率分别是59.79％、64.96％,65.75％；华蟾素联合健择组与健择组、对照组之间有显著性差异(P＜0.05).结论 华蟾素联合健择对人胰腺癌细胞PANC-1增殖有明显抑制作用,效果优于单纯健择组；华蟾素可使PANC-1细胞中的pRb高表达,将细胞周期阻滞于S期,这是其协同作用的机制之一.
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胰腺癌细胞PANC-1中LSD1负向调控抑癌基因SIRT3的实验研究
背景与目的：组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是重要的染色质修饰蛋白之一，可以通过调节染色质的结构调节基因的转录调控，进而影响肿瘤的发生、发展、侵袭、转移以及代谢异常等恶性潜能，是判断肿瘤预后的生物标志物。Sirtuins家族去乙酰化酶3(sirtuin3，SIRT3)基因是位于线粒体内的抑癌基因，通过调控肿瘤代谢异常以及氧化损伤行使抑癌基因的功能。本研究通过基因转录调控的手段，研究胰腺癌细胞PANC-1中LSD1与SIRT3的关系。方法：通过RNA干扰(RAN interference， RNAi)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CoIP)、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)及启动子活性分析等分子生物学实验手段，探讨LSD1与SIRT3在PANC-1细胞中的关系。结果：通过RNAi的手段干扰LSD1的表达，发现SIRT3基因转录水平和蛋白水平明显上升；通过蛋白相互作用的手段，发现LSD1可以与SIRT3转录调控的重要转录因子过氧化物酶增殖体激活受体辅激动子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,coactivator 1 alpha，PGC-1α)相互作用；通过ChIP方法，发现LSD1与PGC-1α共同募集到SIRT3基因的启动子区域染色质上；通过启动子活性分析，发现LSD1基因可以显著抑制PGC-1α对SIRT3基因的转录调控。结论：LSD1可以表观遗传调控抑癌基因SIRT3的转录，为深入研究LSD1与肿瘤代谢异常以及氧化应激提供了理论依据。
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Notch2表达与胰腺癌干细胞相关
目的:以Notch2为表面标志对胰腺癌干细胞进行分离鉴定.方法:采用磁性细胞分选(magnetic activatedcell sorting,MACS)技术纯化胰腺癌Bxpc-3和Panc-1细胞株中的Notch2+细胞,通过NOD-SCID小鼠皮下移植评估其致瘤能力.在无血清条件下培养观察细胞的球体形成能力,应用免疫荧光检测法检测干细胞相关标志八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,0ct4)、Nanog和胰十二指肠同源异型盒1(pancreatic andduodehal homeobox 1,PDlX1)的表达,并通过测序检测其K-ras基因突变的情况.结果:Notch2+细胞具有显著致瘤性.胚胎干细胞核心转录因子Oct4、Nanog和胰腺干细胞标志PDX1阳性表达.在无血清条件下培养能形成细胞球体,并存在K-ras基因的突变.结论:人胰腺癌Notch2<'+>Bxpc-3和Panc-1细胞具有肿瘤干细胞特性.
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脑胶质瘤相关癌基因1对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响
目的:探讨脑胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene 1,GLIl)对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响.方法:构建靶向GLIl基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒重组载体pLVTHM-GLI1-shRNA(以空载体pLVTHM-GFP为对照),经包装后感染胰腺癌PANC-1细胞,应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法检测各组细胞中GUI1、bcl-2、bcl-xl和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA和蛋白的表达;CCK8(cell counting kit-8)法分析各组细胞的生长情况.结果:成功构建了稳定低表达GUI1的GLI1-shRNA-PANC-1细胞,与PANC-1细胞和GFP-PANC-1细胞比较,GLIl-shRNA-PANC-1细胞中GLIl mRNA和蛋白表达水平分别下调了(82.1±3.2)%和(76.7±2.2)%(P<0.01),bcl-2 mRNA和蛋白表达分别下调了(49.7±5.4)%、(43.5±9.4)%(P<0.01);而blc-xl和PCNA mRNA和蛋白表达水平无明显变化.GLI1-shRNA-PANC-1细胞的增殖抑制率明显高于GFP-PANC-1、PANC-1细胞(P<0.05).结论:干扰GLI1基因的表达可抑制人胰腺癌PANC-1细胞的增殖,其机制可能与下调bcl-2的表达有关.
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miRNA-10b在胰腺癌细胞PANC-1中的表达及瞬时转染后对PANC-1生物学功能的影响
目的：探讨人miRNA-10b在胰腺癌细胞PANC-1中的表达及其对PANC-1生物学功能的影响。方法采用荧光定量PCR检测miRNA-10b在PANC-1中的表达情况。化学合成成熟型人miRNA-10b模拟体瞬时转染至PANC-1后，分别通过MTT法、流式细胞仪、细胞划痕实验和Transwell小室检测对PANC-1增殖、凋亡、迁移和侵袭功能的影响。结果荧光定量PCR显示miRNA-10b在PANC-1中的相对表达量为（3.606±0.423）。瞬时转染后，miRNA-10b转染组中miRNA-10b表达量明显增多。MTT法和流式细胞仪示miRNA-10b转染组、阴性对照组和空白对照组细胞的增殖活性和早期凋亡率均无明显差异，细胞划痕实验示miRNA-10b转染组划痕间距缩小明显，侵袭实验示miRNA-10b转染组PANC-1细胞穿膜数明显多于对照组。结论 miRNA-10b在胰腺癌细胞PANC-1中明显高表达。成熟型miRNA-10b转染后能显著提高转染细胞中miRNA-10b的表达量，对PANC-1的体外迁移和侵袭能力有显著的促进作用，但对其增殖和早期凋亡无明显影响。
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人体胰腺癌细胞株PANC-1中四环素可诱导的周期素D1表达抑制系统的建立
[目的]在人体胰腺癌细胞株PANC-1中建立一个四环素可调控周期素D1表达系统,研究抑制周期素D1对胰腺癌细胞的影响.[方法]反义周期素D1质粒通过两次稳定转染进入胰腺癌细胞株PANC-1细胞中,其表达调控系统采用Tet-Off系统(四环素调控系统).通过抑制周期素D1表达对PANC-1细胞生长、集落形成能力以及周期素蛋白表达的影响,评价此系统的可调控性和有效性.[结果]通过第一次转染pTet-Off质粒,选择两个佳表达克隆行第二次转染pTRE-反义周期素D1质粒,并通过免疫印记测定挑选出能在Tet-Off系统中有效地表达反义周期素D1的克隆.通过Tet-Off系统对反义周期素D1的调控,发现周期素D1的表达抑制可明显地抑制胰腺癌细胞生长和集落能力,并可导致胰腺癌细胞形态学改变.其抑制作用与四环素调控浓度和时间有关.[结论]此研究在PANC-1胰腺癌细胞株中建立了一个高效、可诱导的反义周期素D1的表达系统.通过这个系统的建立,可进一步在体内和体外研究周期素D1的抑制对胰腺癌细胞的影响,并可结合其它治疗手段如化疗来探讨联合治疗在临床的潜在应用价值.
关键词： 周期素D1 反义Tet-Off系统 胰腺肿瘤 PANC-1 -
DPF2基因RNA干扰对人胰腺癌细胞PANC-1增殖、凋亡和细胞周期的作用研究
目的 已知DPF2参与白血病以及肿瘤的发生,但是DPF2是否参与胰腺癌发生和进展还不清楚,因此观察了DPF2基因RNA干扰对胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 采用慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低PANC-1细胞的DPF2表达,通过克隆形成实验和MTT实验检测DPF2基因RNA干扰对PANC-1细胞增殖的作用,通过流式细胞术检测DPF2 基因RNA干扰对PANC-1细胞凋亡和细胞周期的作用.结果 慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰中剂量和高剂量(2 μL和4 μL)使PANC-1细胞的DPF2表达明显降低.与阴性对照组比较,DPF2基因RNA干扰明显抑制PANC-1细胞活力和克隆形成,还促进PANC-1的凋亡.此外,DPF2基因RNA干扰引起细胞周期的S期阻滞,明显减少G2/M周期的细胞数量.结论 DPF2可能参与胰腺癌细胞PANC-1的增殖、凋亡过程和细胞周期的调控,通过慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低DPF2蛋白表达,可能为寻找潜在的抗胰腺癌的新方法提供实验依据.
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PDX1真核表达载体的构建及其对PANC-1细胞PI3K/AKT信号途径的影响
目的 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX1)基因真核表达载体并转染至PANC-1细胞,观察其对PI3K/AKT信号通路的影响.方法 从Hela细胞中提取总RNA,逆转后PCR扩增PDX1编码区片段,然后将PDX1的CDS插入PCMV6-Entry质粒构建PCMV6-Entry-PDX1表达重组体.重组体转染至PANC-1细胞中通过G418筛选出稳定表达细胞株.Western blot分析PDX1蛋白水平表达及p-AKT水平变化.结果 PDX1基因成功在PANC-1中表达.利用West-ern blot检测验证获得了稳定的PDX1过表达细胞株.West-ern blot结果显示:过表达PDX1的细胞株AKT表达含量与正常细胞及对照细胞没有区别而p-AKT水平降低.结论 PDX1基因过表达能够降低PANC-1细胞的p-AKT水平.
关键词： Pdx1 基因重组 PI3K/Akt信号通路 PANC-1 -
Mcl-1和多药耐药蛋白基因在胰腺癌耐药细胞株中表达研究
目的 探讨淋巴瘤细胞株的Mcl-1和多药耐药蛋白(multi-drug resistance protein,MRP)基因在吉西他滨诱导的胰腺癌耐药细胞株PANC-1、SW1990中的表达情况,及其与胰腺癌耐药的关系.方法 胰腺癌细胞株PANC-1(PANC-1组)和SW1990(SW1990组),采用吉西他滨浓度递增法持续诱导建立耐药细胞株PANC-1/GZ(PANC-1/GZ组)和SW1990/GZ(SW1990/GZ组),采用MTT法测定4组细胞在1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/L吉西他滨作用24 h后半数致死量(median lethal dose,LDs0),采用透射电镜技术观察吉西他滨诱导12h后细胞线粒体内部结构改变情况,采用流式细胞技术检测4组细胞在5.64 mg/L吉西他滨作用12h后线粒体膜电位情况,采用RT-PCR检测4组细胞在5.64 mg/L吉西他滨作用12h后Mcl-1和MRP mRNA表达情况,采用流式细胞仪分析PANC-1/GZ组和SW1990/GZ组Mcl-1和MRP基因敲除前、后线粒体膜电位变化情况.结果 随吉西他滨浓度增加和作用时间延长,PANC-1/GZ组和SW1990/GZ组细胞存活率高于PANC-1组和SW1990组(P＜0.05);PANC-1/GZ组和SW1990/GZ组细胞Mcl-1 mRNA(0.780±0.008、0.840±0.006)和MRP mRNA(0.870±0.005、0.920±0.012)表达水平均明显高于PANC-1组(0.580±0.008、0.530±0.010)和SW1990组(0.390±0.005、0.420±0.003) (P＜0.05);Mcl-1表达水平与MRP呈正相关(r=0.872,P=0.034);透射电镜下PANC-1组和SW1990组胰腺癌细胞线粒体内部结构发生剧烈改变;5.64 mg/L吉西他滨作用12 h后,PANC-1组和SW1990组线粒体膜势能[(45.86±3.38)％、(39.40±2.25)％]明显高于PANC-1/GZ组[(14.52±0.92)％]和SW1990/GZ组[(22.56±2.28)％](P＜0.05);PANC-1/GZ组和SW1990/GZ组细胞Mcl-1和MRP基因敲除后线粒体膜电位[(34.09±1.32)％、(42.06±2.85)％]明显高于基因敲除前[(14.52±0.92)％、(22.56±2.28)％](P＜0.05).结论 胰腺癌耐药细胞株PANC-1/GZ和SW1990/GZ中Mcl-1和MRPmRNA呈高表达,其作用机制与线粒体的凋亡信号通路相关.
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微小RNA-140靶向高迁移率族蛋白B1调控胰腺癌细胞生长增殖
目的 探讨微小RNA-140(miR-140)靶向高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对胰腺癌细胞增殖的影响.方法 本文选择miR-140及HMGB1作为研究对象.首先我们在胰腺癌细胞中转染miR-140 mimics或miR-140 inhibitor以实现miR-140过表达或miR-140沉默,并检测了miR-140过表达或沉默时HMGB1蛋白的表达水平;其次构建了在HMGB1的3'端非编码区(3'UTR)含有或不含有6对碱基突变的荧光酶报告基因质粒(mut-HMGB1/wt-HMGB1),与miR-140 mimics或miR-140 inhibitor共转染后检测荧光酶活性变化;接着构建pcDNA3.1/HMGB1质粒,与miR-140 mimics或miR-140 inhibitor共转染后检测HMGB1及RAGE蛋白表达水平变化;后检测pcDNA3.1/HMGB1和mimics NC/miR-140 mimics共转染后对胰腺癌细胞生长和增殖的影响.结果 miR-140过表达抑制HMGB1蛋白表达(0.406 3 ±0.018 9,t=11.250,P=0.000),miR-140沉默促进HMGB1蛋白表达(1.975 8±0.069 3,t=9.121,P=0.001);miR-140可靶向结合HMGB1调控其表达;pcDNA3.1/HMGB1可实现HMGB1过表达(5.458 9±0.463 7,t=16.140,P=0.000),并可减弱miR-140对HMGB1和晚期糖基化终产物受体(RAGE)的抑制作用;miR-140可抑制胰腺癌细胞的生长和增殖(P=0.042),HMGB1可促进胰腺癌细胞的生长和增殖(P=0.008),HMGB1可恢复miR-140对胰腺癌细胞生长和增殖的抑制作用(与miR-140 mimics+ pcDNA3.1组比较,P=0.020).结论 miR-140靶向HMGB1基因抑制胰腺癌细胞的增殖.
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铜绿假单胞菌注射液诱导人胰腺癌细胞PANC-1的凋亡
目的 观察铜绿假单胞菌注射液对体外培养的PANC-1细胞生长抑制及凋亡的影响.方法 体外培养人胰腺癌细胞PANC-1,采用MTT法检测不同浓度PA-MSHA(铜绿假单胞菌)对PANC-1细胞的抑制情况,透射电子显微镜观察药物作用后细胞超微结构变化,TUNEL法观察细胞凋亡,采用流式细胞术检测PA-MSHA与对照组(药物浓度为0)的细胞凋亡率,Westen blot检测促凋亡蛋白caspase-3,caspase-7,caspase-8,caspase-9,PARP的表达.结果 MTT观察到不同浓度PA-MSHA(10×108/ml,5×108/ml,2.5×108/ml,1.25×108/ml,0.625×108/ml)分别作用24、48、72 h后和对照组相比(P=0.006)可使PANC-1细胞生长明显抑制,抑制率呈浓度、时间依赖关系；电子显微镜下PAMSHA作用后形成凋亡小体,细胞内空泡形成；TUNEL法观察细胞核深染,细胞发生早期凋亡.流式细胞术观察PA-MSHA处理组(2.5×108/ml)与对照组分别作用48 h后处理组的细胞凋亡率明显增高,PA-MSHA作用24 h后和对照组相比,随药物浓度增高,凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-7,caspase-8,caspase-9,PARP表达随之增强.结论 PA-MSHA可诱导人胰腺癌细胞PANC-1细胞凋亡进而抑制肿瘤生长.
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5-Aza-dC对胰腺癌细胞系Panc-1中TFPI-2基因甲基化水平及表达的影响
目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-A2a-dc)对胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)甲基化水平及基因表达的影响.方法 用不同浓度5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系Panc-1.用甲基化特异性PCR(MS-PCR),反转录聚合酶链(RT-PCR)及蛋白印迹实验(Western blot)检测药物处理前后Panc-1细胞TFPI-2基因的甲基化状态,mRNA及蛋白表达的改变.结果 MSP检测Panc-1细胞TFPI-2基因药物作用后异常甲基化得到逆转,RT-PCR检测到不同浓度5-Aza-dC处理后TFPI-2基因mRNA重新表达,相对表达量分别为(0.211±0.087),(0.327±0.068),(0.609±0.017),Western blot检测TFPI-2基因蛋白重新表达,相对表达量分别为(0.429±0.121),(0.675±0.044),(1.132±0.124),以上作用呈时间、剂量依赖性(P＜0.05),差异具有统计学意义.结论 胰腺癌细胞系Panc-1中抑癌基因TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因.5-Aza-dC能够较成功的逆转胰腺癌细胞Panc-1中TFPI-2基因的高甲基化状态,并能恢复TFPI-2基因的mRNA及蛋白重新表达.
关键词： 胰腺癌 PANC-1 TFPI-2基因 甲基化 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
RNAi抑制胰腺癌细胞株VEGF表达的实验研究
0 引言血管内皮细胞生长因子(VEGF)是体内一种内皮细胞特有的有丝分裂原,调控血管内皮细胞的增殖、迁移、水解基膜和血管构建,诱发血管期的启动[1,2] .RNA干扰(RNAi)是一种重要的转录后基因沉默机制[3].本实验拟构建以VEGF基因为靶向的RNA干扰质粒,沉默胰腺癌Panc-1细胞株中VEGF基因的表达,为抑制胰腺癌血管生成提供基础.
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参芪扶正注射液联合顺铂对人胰腺癌PANC-1细胞增殖及凋亡的影响
目的:研究参芪扶正注射液联合顺铂对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、诱导凋亡的影响,并讨论其作用机制.方法:常规培养细胞,采用参芪扶正注射液和顺铂分别单独及联合作用于PANC-1细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态的变化;MTT法检测不同浓度的参芪扶正注射液和顺铂单独及联合作用PANC-1细胞后的抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测凋亡因子Caspase-9、Fas和Survivin的含量.结果:参芪扶正注射液和顺铂均能有效抑制PANC-1细胞增殖,并诱导其凋亡,两药联合应用具有协同效应,可促进Caspase-9、Fas的表达,抑制Survivin的表达.结论:参芪扶正注射液联合顺铂能协同抑制PANC-1细胞的增殖,并诱导其凋亡,其作用机制与上调Caspase-9、Fas及下调Survivin因子的表达有关.
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蛹虫草菌丝体与冬虫夏草抑制人胰腺癌PANC-1细胞株增殖作用的比较研究
目的 比较人工培养的蛹虫草菌丝体与天然冬虫夏草抑制人胰腺癌PANC-1细胞株增殖的活性,并探讨其作用机制. 方法 MTT法分析蛹虫草菌丝体和天然冬虫夏草对PANC-1细胞的增殖抑制作用,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,Western blot分析细胞凋亡和自噬相关蛋白变化. 结果 蛹虫草菌丝体和天然冬虫夏草都能通过诱导细胞自噬而非凋亡途径,呈浓度依赖地降低胰腺癌PANC-1细胞的存活率.癌基因STAT3的总蛋白和磷酸化水平均明显降低.蛹虫草菌丝体处理后PANC-1细胞促存活蛋白Mcl-1和Survivin的表达水平明显降低,而冬虫夏草并无此作用. 结论 人工培养的蛹虫草菌丝体与天然冬虫夏草相比,具有相似或更强的体外抗胰腺癌细胞增殖活性.
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质粒介导LAPTM4B过表达胰腺癌细胞株PANC-1的构建及鉴定
目的 筛选低表达LAPTM4B-35细胞株并构建质粒介导的LAPTM4B过表达胰腺癌细胞株并进行鉴定.方法 通过RT-PCR及Western-Blot方法检测3种胰腺癌细胞LAPTM4B的表达,筛选出现低表达LAPTM4B细胞株.通过质粒稳定转染胰腺癌细胞PANC-1,pcDNA3.0-AE过表达LAPTM4B基因,应用RT-PCR,Western-blot进行鉴定.结果 成功扩增提取pcDNA3.0-AE质粒,转染并筛选稳定细胞株.RT-PCR及Western-Blot显示相对空白对照,稳定株的过表达LAPTM4B-35明显.结论 成功构建筛选低表达细胞株,并建立稳定过表达LAPTM4B的胰腺癌细胞株.
