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多杀菌素产生菌的高通量诱变选育
目的 利用高通量筛选方法进行刺糖多孢菌诱变选育获得多杀菌素高产菌株.方法 以ASAGF73为出发菌株,通过亚硝基胍(NTG)诱变,并利用96孔板发酵培养结合快速生物测定进行高通量筛选.结果 诱变剂量为2mg/mL,诱变时间50min时突变株多杀菌素产量有较大幅度提高.通过3轮复筛验证终获得8株产量分别比出发菌株提高了43.94％、33.76％、29.41％、28.61％、27.40％、26.42％、25.59％和20.40％的突变株.结论 利用高通量筛选方法可以快速获得多杀菌素高产菌株.
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以FK506结合蛋白52为靶点的高通量药物筛选模型的建立及应用
目的 发现新的FKBP52抑制剂类药物,建立以人FKBP52为靶点的高通量药物筛选模型.方法 通过大肠埃希菌表达系统重组表达FKBP52蛋白,并进行纯化.基于FKBP52的肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase)的活性特性,建立FKBP52高通量药物筛选体系.对本公司化合物库中的31558个放线菌及真菌次级代谢产物粗提物进行筛选.结果 成功构建重组表达菌株BL21 (rosetta)/pET-30a/FKBP52.纯化后的重组表达人FKBP52蛋白纯度大于90％,并具有很好的PPIase活性.阳性药FK506能剂量依赖地抑制FKBP52活性,IC5o为12.035ng/mL.筛选得到121个抑制率大于80％的样品,其中11株放线菌的次级代谢产物中含FK506,6株放线菌的次级代谢产物中含FK520,7株放线菌的次级代谢产物中含雷帕霉素.对随机抽取的100块96孔板筛选数据进行统计,模型的信号/本底比平均值为2.35±0.26,Z'因子平均值为0.78±0.1.结论 本研究成功建立了人FKBP52抑制剂高通量药物筛选模型,该方法具有快捷、灵敏度高、稳定性好的特点,不仅可以快速进行新FKBP52抑制剂的筛选,还可以实现对FKBP52已知抑制剂如FK506、FK520和雷帕霉素等产生菌的定向筛选.
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人亲环素A抑制剂高通量筛选模型的建立及在微生物药物筛选中的应用
目的 亲环素A是免疫抑制剂环孢菌素A的胞内受体,与多种重要生理和病理过程密切相关,已经成为如免疫抑制、病毒感染和炎症等多类疾病的重要研发靶点.为了筛选新型小分子CypA抑制剂药物,本研究建立了一个基于荧光偏振方法的CypA抑制剂药物高通量筛选模型.方法 应用PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增cypA基因,通过大肠埃希菌系统重组表达CypA蛋白,并利用镍离子螫合亲和层析柱进行蛋白纯化,以FITC标记CsA为示踪剂建立CypA抑制剂的筛选方法.结果 SDS-PAGE检测重组表达的CypA蛋白纯度大于95％.经过荧光偏振测定体系中示踪剂FITC标记CsA和重组CypA浓度的优化,确定了佳的荧光偏振反应条件,使其信号本底比大于2.0,Z因子为0.71.阳性药CsA能剂量依赖地与荧光标记的CsA竞争结合于CypA,其IC50值为221.3nmol/L.利用建立的筛选模型,对28215个微生物次生代谢产物粗提物进行了初筛和复筛,从中筛选得到43个抑制率大于80％的样品.经液相-质谱方法进一步分析,其中17个真菌的发酵产物中含有环孢菌素类似物.结论 本研究采用荧光偏振方法定量测定微生物代谢产物与荧光标记探针竞争结合CypA,可以简单、快捷地进行CypA抑制剂药物或环孢菌素产生菌的高通量筛选,为后期的药物研发奠定基础.
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新型NDM-1酶抑制剂的筛选与研究
目的 建立肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)新德里β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)抑制剂的高通量筛选模型,从不同来源的样品中筛选该酶抑制剂,以期获得作用于NDM-1的新型抗耐药阴性菌的药物或药物先导物.方法 克隆、表达并纯化肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146的NDM-1酶;基于在NDM-1作用下头孢硝噻吩溶液由黄色变成红色,且在486nm波长下具有光吸收的原理,建立酶活测定体系,构建和评价NDM-1抑制剂的高通量筛选模型;应用此模型筛选NDM-1抑制剂,评价其作为抗耐药阴性菌药物的可行性.结果 得到了重组NDM-1酶,构建了NDM-1酶抑制剂高通量筛选模型,筛选得到5个NDM-1抑制剂,其中化合物IMB-XW2为该酶的非竞争性抑制剂,其Ki值为4.6μmol/L,IC50为10.3 μmol/L;该化合物在4μg/mL时可以使表达NDM-1的大肠埃希菌对美罗培南的敏感度提高8倍.结论 成功构建了稳定性好、灵敏度高的NDM-1酶抑制剂的高通量筛选模型,应用该模型可筛选到NDM-1抑制剂,该抑制剂有可能成为新型的抗耐药革兰阴性菌的药物或药物先导物.
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以FtsZ为靶点的抗结核药物筛选模型的建立及应用
目的 发现结核分枝杆菌FtsZ的特异性抑制剂,为开发针对该靶点的新型抗结核化合物奠定基础.方法 克隆和表达结核分枝杆菌FtsZ蛋白并优化其酶活测活方法,构建FtsZ抑制剂的高通量筛选模型;对化合物库中2万个化合物进行筛选,将筛选得到的抑制剂212H进行IC50以及分子水平活性测定;用菌液稀释法评价212H对结核标准株、临床分离株以及耐药株的抗结核活性.结果 得到了较纯的结核分枝杆菌FtsZ蛋白,建立并优化了FtsZ酶活测定体系以及其抑制剂的高通量筛选模型,筛选得到1个具有较高抑制率的抑制剂212H,该抑制剂具有显著的体外抗结核活性.结论 建立了稳定的结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的高通量筛选模型,应用该模型筛选得到的抑制剂具有抗结核活性.
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人高密度脂蛋白受体CLA-1上调剂9179D的分离、结构鉴定和活性研究
目的 从微生物代谢产物中分离能够上调人高密度脂蛋白受体(CLA-1)表达的新型活性化合物,并对其活性进行研究.方法应用己建立的CLA-1表达上调剂的模型,对阳性菌株链霉菌I04A-9179发酵产物的活性成分进行分离纯化,获得活性化合物9179D;通过理化性质、质谱、紫外和核磁等波谱学数据进行结构鉴定;利用RT-PCR和Western Blot方法检测9179D对HepG2中CLA-1表达的影响;利用流式细胞仪检测其对小鼠巨噬细胞RAW264.7结合DiI-HDL的影响.结果从链霉菌I04A-9179发酵产物中得到活性化合物9179D,并确定了其结构为曲古柳菌素D(Trichostatin D); 9179D在CLA-I上调剂模型上的EC50为46.02μmol/L,表达活性高值为934％；9179D能增加HepG2中CLA-1的mRNA和蛋白表达；增加RAW264.7对DiI-HDL的结合.结论得到一个微生物来源的具有强的上调CLA-1的表达活性的化合物-9179D(曲古柳菌素D),属首次报道.
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白介素-1β转化酶抑制剂的高通量筛选
目的 筛选具有白介素-1β转化酶(ICE)抑制活性的化合物.方法 通过体外克隆ICE原酶全长基因、质粒原核表达及蛋白纯化等方式,应用酶与特异性底物的荧光反应,建立ICE抑制剂高通量筛选平台:通过紫外、质谱及核磁等理化数据分析对所筛选的化合物进行结构鉴定,同时进行了初步的药理毒理学活性验证.结果 筛选得到1种具有较强ICE抑制活性的化合物LX1986,该化合物与已知化合物棕曲菌素D(Aspochalasin D)结构相同.结论 LX1986为活性较强的微生物来源ICE抑制剂,其抑制活性为首次报道.
关键词： 白介素-1β转化酶 白介素-1β转化酶抑制剂 高通量筛选 纯化 -
青霉素高产菌株高通量检测和筛选方法的研究
目的:建立高通量筛选青霉素高产菌株的方法.方法:采用青霉素酶水解青霉素形成青霉噻唑酸,产物与碘液反应,以淀粉为指示剂,青霉素含量与碘液用量呈现良好的线性关系.结果:在室温条件下,不超过10min,可并行检测多个发酵液样品的青霉素含量,该方法简便、迅速、微量并且不受发酵液中其他杂质成分的干扰,也可在10min内对超过200个发酵液样品中的青霉素含量进行相对评估,淘汰90%以上的低效价菌株.结论:提供了高通量筛选青霉素高产菌株的方法.
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人高密度脂蛋白受体CLA-1表达上调剂4776B和4776C的分离、结构鉴定及生物活性研究
目的 从微生物代谢产物中筛选和分离能够上调人高密度脂蛋白受体(CLA-1)表达的新型活性化合物.方法 应用本实验室已经建立的CLA-1表达上调剂的高通量筛选模型,从6000多株微生物中筛选出8株能使CLA-1表达上调的阳性菌株.对其中一株阳性菌株放线菌04-4776发酵产物的活性成分进行活性跟踪分离纯化,从中获得CLA-1表达上调的化合物4776B和4776C,并测定了化合物的理化特性和波谱学数据及相关的生物活性.结果 通过理化性质、质谱、紫外和核磁等波谱学数据的分析,确定了化合物4776B和4776C的结构;4776B和4776C对CLA-1的上调率分别在2.08和3.26μmol/L时达到大,与对照相比分别上调了60%和78%.结论 放线菌04-4776产生的两个活性化合物分别与文献报道的红车轴草素和(9R,13S)-7-脱氧-13-二氢道诺霉素酮结构一致;两个化合物均具有强的上调CLA-1的表达活性,属首次报道.
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高通量血液透析对尿毒症患者血清钙磷代谢及微炎症指标的影响
目的:探讨高通量血液透析(HFHD)对尿毒症患者血清钙磷代谢的影响.方法:66例尿毒症患者均分为对照组和观察组,在常规治疗的基础上,观察组采用HFHD治疗,对照组采用血液透析(HD)治疗,均为3次/周,连续治疗6个月;分别于透析前和透析6个月时,检测2组患者血清甲状旁腺素(iPTH)、钙、磷、血清肿瘤坏死因子-a(TNF-a)及超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,检测患者左室舒张/收缩末期内径(LVEDD/LVESD),计算左室射血分数(LVEF),计算患者透析6个月时血清iPTH、钙及磷的达标率;观察2组透析期间营养不良及各种心血管事件发生率,采用简明健康检查量表(SF-36)评评估患者生活质量.结果:透析前,2组尿毒症患者血清iPTH、钙、磷、TNF-α、hs-CRP水平及LVEDD、LVEDS、LVEF比较,差异无统计学意义(P>0.05);透析6个月时,2组患者血清iPTH、磷、TNF-α及hs-CRP水平较透析前显著降低,观察组降低更明显(P<0.05),血清钙水平无明显变化(P>0.05);透析6个月时,观察组患者血清iPTH、钙及磷的达标率显著高于对照组(P<0.05);与透析前比较,2组LVEDD、LVEDS、LVEF水平仅观察组LVEF升高(P<0.05),其余指标无明显变化(P>0.05);透析期间,观察组营养不良发生率及总不良反应发生率显著低于对照组(P<0.05);透析6个月时,观察组SF-36评分高于对照组(P<0.05).结论:HFHD可有效降低尿毒症患者血清iPTH、磷及炎性因子水平,改善患者心功能,提高患者生活质量.
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Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性
目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法.方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中.经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定.后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性.结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白.用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性.我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97) nmol/L,与报道值一致.结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害.此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究.
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药物创新与高通量筛选
药物研究是关系人类健康的事业,开发新药可以产生巨大的经济和社会效益,创新药物的研究和开发已经成为医药领域长期的重要课题.新药研究不仅需要依赖坚实的基础研究成果,其自身也具有独特的规律和要求,掌握这些规律和要求,有助于促进创新药物的发现和研究.
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高通量筛选大容量抗体库的方法学研究进展
抗体工程技术是指利用重组DNA技术和蛋白质工程技术,对目标抗体的基因进行改造和重新装配,经转染相应的受体细胞后,表达出相应的抗体分子,或用细胞融合、化学修饰等方法改造抗体分子的生物技术.现在的抗体工程技术一般均建立在噬菌体表面展示技术之上.它把抗体基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区构建抗体基因文库,使抗体表达并展示于噬菌体表面,进而通过生物淘洗的方法得到针对特定抗原的抗体基因[1-2].
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Scopus与药学科研热点跟踪
简要介绍Scopus的内容与功能,利用Scopus对高通量药物筛选与天然药物研发技术研究领域的论文发表情况、研究基础、新进展、热点趋势、研究机构、高被引作者等方面进行分析,总结该领域的研究现状,展示Scopus数据库及其评价功能的特点和优势.
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人源HepaRG肝细胞毒性与遗传毒性高通量筛选方法的初步建立
目的 利用正常人源肝细胞(HepaRG)和高内涵技术检测肝毒性标志物,并结合微核试验和单细胞凝胶电泳试验建立体外细胞毒性和遗传毒性的快速筛选平台.方法 选取适当的荧光探针Hoechst33342、DCFH-DA、Fluo4-AM、MitoTracker(R) Red CMX Ros联合高内涵技术研究不同大黄蒽醌类单体(AQs)对HepaRG细胞活性氧簇(ROS)、胞内Ca2+含量及线粒体膜完整性等肝毒性标志物的影响,并开展高内涵法胞质分裂阻断法微核试验和高通量彗星电泳试验,综合评价AQs致肝细胞毒性及染色体、DNA损伤情况.结果 与对照组比较,HepaRG细胞经25.0 μg/mL大黄素、12.5和25.0μg/mL芦荟大黄素、50和25.0 μg/mL大黄酚处理24h后,胞内ROS含量显著增多;12.5和25.0 μg/mL芦荟大黄素和50.0μg/mL大黄酸可引起胞内Ca2+含量显著增多;大黄素25.0 μg/mL、芦荟大黄素25.0 μg/mL、大黄酚50.0和25.0 μg/mL、大黄酸50.0和25.0 μg/mL组导致线粒体明显损伤(P＜0.05、0.01).与对照组比较,25.0 μg/mL大黄素诱导微核率、尾DNA含量和彗星尾距(OTM)数值均显著升高(P＜0.05、0.01);50.0 μg/mL大黄酚给药72 h后微核率显著升高(P＜0.01).结论 AQs的研究结果与现有文献报道基本相符.本研究成功建立肝细胞毒性和遗传毒性的联合快速筛选模型,有助于药物研发早期的毒性筛选.
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微型细菌回复突变试验方法的建立及验证
目的 建立高通量评价药物遗传毒性的微型细菌回复突变(Ames)试验.方法 采用平皿掺入法进行标准Ames试验,采用6孔板掺入法进行微型Ames试验,两试验均设置阴性对照组和阳性对照组,2组又分别分为代谢活化和非活化2个亚组,各组培养基中分别加入菌液(鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型菌株:TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535),活化组加大鼠肝微粒体酶(S9)混合液,阳性对照组再加入阳性诱变剂:Dexon(-S9),应用于TA97、TA98和TA102;NaN3(-S9),应用于TA100和TA1535;2-AA(+S9),应用于TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535.凝固后37℃温箱培养约48 h,计数各组回变菌落数.结果 在标准Ames试验中,阴性对照组各个菌株回变菌落数均在本实验室自发回变菌落数正常值范围内.在两试验中,阳性对照组所诱导的回变菌落数均是阴性对照组的2倍以上,标准试验细菌回变菌落数约为微型试验的5倍.结论 在6孔板上进行微型细菌回复突变试验,大大减少了受试物的用量,提高了筛选速度.本实验室建立 的微型细菌回复突变试验背景数据,用于遗传毒理的检测是高效可靠的.
关键词： 微型细菌回复突变试验 高通量筛选 遗传毒性 建立 验证 -
热降解辅助表面解吸常压化学电离质谱对阿莫西林的分析
目的:建立一种阿莫西林热降解辅助表面解吸常压化学电离质谱(TD - SDAPCI - MS)快速检测新方法.方法:利用阿莫西林抗生素的易降解并产生特定降解产物的特性,以潮湿空气作为试剂,通过电晕放电产生大量试剂离子,对阿莫西林抗生素总离子流质谱图与特征降解产物离子流图进行比对.并通过串联质谱对阿莫西林抗生素产生的特征降解产物进行了确认.结果:无需样品预处理,实现一级质谱法对阿莫西林抗生素的高通量筛选.结论:单个样品检测不超过30 s,可实现不稳定抗生素阿莫西林的高通量筛选.
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表达和纯化人巨噬细胞弹性蛋白酶的催化区以高通量筛选酶抑制剂
目的:获得具有催化活性的人巨噬细胞弹性蛋白酶的催化区(hMECD),并建立有效的高通量筛选方法筛选其抑制剂.方法:在大肠杆菌中表达hMECD,并根据酶活性以比色法建立高通量筛选模型.对一批共8560个纯化合物和混合物进行了高通量筛选.结果:构建了有效的大肠杆菌表达系统.存在于包涵体中的表达蛋白在体外重折叠复性,经阴离子交换柱层析的方法纯化,l L大肠杆菌培养物可得到23mg纯化的活性蛋白.该蛋白的重折叠复性和酶活性需要钙锌离子,但高浓度的锌离子则抑制其重折叠复性和活性.hMECD剪切合成底物包括一个硫酯和几个荧光发生的肽类底物,并在pH 8.0显示强的活性.对8560个化合物和混合物的高通量筛选发现了2了个纯化合物和14个天然产物在20mg/L的浓度下具有大于80%的抑制活性.结论:建立了有效的人巨噬细胞弹性蛋白酶的催化区表达和纯化的方法.该重组蛋白抑制剂的高通量筛选模型具有有效、可信和快速的特点.
关键词： 基质金属蛋白酶 人巨噬细胞弹性蛋白酶 基因表达 高通量筛选 -
人--型胶原酶抑制剂的高通量筛选
目的：以重组胶原酶催化区建立高通量药物筛选模型，筛选胶原酶抑制剂.方法：在大肠杆菌中表达了人的一型胶原酶的催化区，并以此建立了高通量药物筛选模型.对一批共2720个纯化合物进行了高通量筛选.结果：胶原酶催化区的高通量筛选中，完成2720个纯化合物的筛选只用了2小时10分，每个化合物的用量是4μg.高通量筛选发现66个化合物在20mg/L的浓度下具有大于60％的抑制活性，其中有44个化合物的抑制活性被随后的多浓度测试所证实.筛选发现的好化合物的IC50为4.3 μmol/L，共有IC小于20μmol/L的化合物15个.结论：重组胶原酶催化区的高通量药物筛选模型具有快速、微量、准确的特点.
