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高通量筛选之痛——泛活性筛选干扰化合物
高通量筛选技术在新药发现中已经成为常规的方法,该技术可以有效地筛选出作用于特定靶点的化合物,同时,这一方法也引入了一些干扰筛选的特殊化合物分子.泛活性筛选干扰化合物以干扰生化实验检测、对蛋白进行共价修饰、自身形成聚集体等方式干扰药物筛选,故清除此类化合物是重要的研究内容.本文对泛活性筛选干扰化合物的概念和分类进行了介绍,并对其产生原因以及相关对策进行综述,以期提高高通量药物筛选的技术水平和命中率.
关键词： 泛活性筛选干扰化合物 高通量筛选 药物发现 命中率 -
极化荧光在高通量药物筛选中的应用
1前言基于荧光技术的检测分析方法是近年来被应用于药物高通量筛选(high-throughput screening,HTS)的重要方法之一,荧光检测方法具有灵敏度高、方法简便的优点,目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光分析法(homogeneous time resolved fluorescence,HTRF),荧光共振能量传递分析法(fluorescence resonance energy transfer,FRET),荧光关联光谱法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS),极化荧光分析法(fluorescence polarization,FP).
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生物分配胶束色谱用于评价药物膜转运及其活性
药物必须通过许多生物膜才能到达作用部位,其在细胞内的活性要求其必须透过目标细胞的细胞膜才能起作用,且药物的活性、毒性、在体内的分布及其他生理过程都取决于其在膜上的分配状况.因此,药物的膜通透性考察可以作为药物活性分析的可靠依据,是筛选组合化学库和中药天然成分库的新亮点和新角度.由于药物细胞膜通透性对于其有效性和安全性起着关键作用,新化合物的膜通透性筛选应在其活性筛选之前或者两者同时进行,以利于确定哪个化合物适合作为先导化合物.组合化学的发展使得合成的候选化合物的数目大大增加,这要求生物药剂学家应具有一种快速筛选出具有适宜体内药代动力学特征的候选药物的工具.传统药物筛选在动物模型上完成,劳动密集,耗时长,成本高,且只能是小规模筛选.考虑到伦理和经济的因素,药物学家一直在努力尝试新的高效、快速、准确的体外药物筛选方法.
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中药药代动力学研究的难点和热点
中药的药物代谢动力学(简称中药药代动力学)是借助于动力学原理,研究中草药活性成分、组分、中药单方和复方体内吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的动态变化规律及其体内时量-时效关系,并用数学函数加以定量描述的一门边缘学科.它是中药药理学与药物代谢动力学相互结合、相互渗透而形成的.
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药物研究的有效途径:组合化学与合理药物设计相结合
新药研究领域正孕育着一场以研究和应用分子多样性为核心的方法学革命,一方面它迅速吸收分子生物学、计算机科学和现代有机合成的新研究成果,成为各种新技术、新方法荟萃的焦点;另一方面它又为各种新原理和新概念问世提供必要条件.近出现的高通量筛选(high throughput screening,HTS)、组合库(combinatorial library)、组合合成(combinatorial synthesis)和组合化学(combinatorial che-mistry);分子多样性(molecular diversity)与分子相似性(molecular similarity)策略、化合物信息库(chemical information database)和生物信息学(bioinformatics)等一系列新概念将对新药研究方法产生深刻而广泛的影响,21世纪的新药研究将进入一个崭新的发展阶段.
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流感病毒神经氨酸酶抑制活性测定方法的标准研究
建立流感病毒神经氨酸酶(NA)活性测定和酶抑制剂评价标准方法,并评价其准确性、稳定性.确定标准方法为:在96孔板内加入样品Vsam=10μL、酶溶液VNA=30μL、底物Vsub=60μL,混匀,37℃反应1h,用NaOH终止反应,测定荧光强度.定义该反应条件下1h内反应生成1nmol 4-MU的NA酶量为一个活性单位.对测定结果,引入不确定度考察其准确性和稳定性.酶活性抑制率的合成相对不确定度为6.51×10-2,连续10天测得的活性化合物奥司米韦酸抑制活性结果稳定.本研究系统评价了NA抑制活性测定方法,为其在新药发现中的应用提供了实验依据,并探讨了对生物学指标测定的不确定度评价.
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基于极化荧光方法的人LOX-1配体高通量筛选
目的建立以极化荧光为检测方法的高通量筛选技术,通过大规模筛选发现氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的天然配体.方法密度梯度超速离心获得正常人血中低密度脂蛋白(LDL),然后用CuSO4(5 μmol·L-1)修饰为氧化型低密度脂蛋白(oxLDL).FITC标记hLOX-1,以受体(LOX-1)和配体(oxLDL)的相互作用为基础建立筛选模型,用极化荧光检测方法,在激发光485 nm、发射光525 nm,对3 200个样品进行高通量筛选,并用Z′因子值评价实验.结果 Z′因子值为0.75,根据建立的基于极化荧光的高通量筛选实验方法,发现3个化合物与hLOX-1有较高的结合活性,IC50值小于31.6 μmol·L-1.结论极化荧光检测方法适合于高通量筛选技术,具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性.
关键词： 极化荧光 高通量筛选 氧化型低密度脂蛋白受体-1 动脉粥样硬化 -
化合物IMB-1680体外抗动脉粥样硬化的活性研究
探讨化合物IMB-1680的体外抗动脉粥样硬化活性.利用己构建的高表达人CD36细胞株Sf9[hCD36]和CHO[hCD36]测定量效曲线,荧光显微照相法和流式细胞实验检测细胞对变性低密度脂蛋白(modified low density lipoprotein,mLDL)的摄取,巨噬细胞泡沫化实验检测细胞内脂质积聚.结果表明:IMB-1680在Sf9[hCD36]、CHO[hCD36]模型上IC50值分别为2.80及8.79 μmol·L-1; IMB-1680能显著抑制细胞摄取DiI-AcLDL,同时能显著减少巨噬细胞RAW264.7摄取脂质.本研究为开发新型抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.
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人源蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂的高通量筛选
本研究拟建立体外人源蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂高通量筛选模型,用于PTP1B抑制剂的发现.利用大肠杆菌重组表达PTP1B,以对硝基苯磷酸二钠(PNPP)为特异性的底物,建立了基于酶反应速率的384孔微板为载体的PTP1B抑制剂高通量筛选模型Z'=0.78).选择24 240个样品进行筛选,对抑制率大于70%的80个样品作为活性样品进行复筛,终确定6个具有较强的抑制活性的化合物J5753、J10550、J10551、J10583、J10585和J11101,其IC50值分别为21.58、18.39、15.37、11.92、37.27和36.61 μtg·mL-1.结果表明,所建立的PTPIB抑制剂高通量筛选模型具有快速、灵敏、稳定、重复性好的特点.
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人膜转运蛋白ABCA1表达上调剂的筛选与鉴定
人ATP结合盒转运体A1 (ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)可介导细胞内磷脂和游离胆固醇转运至贫脂或无脂的载脂蛋白A-I (apolipoprotein A-I,apoA-I),从而促进高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)生成,启动胆固醇逆转运过程,在机体清除多余脂质的过程中发挥重要作用.因此,本研究以ABCA1为靶点,前期建立了ABCA1上调剂抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)药物筛选模型,以期寻找具有新作用机制的抗AS药物.在此研究中,利用该模型对1 600个化合物进行筛选,发现2030421B上调活性大于50％,其EC50为0.50 μg?mL-1.进一步研究发现,2030421B不仅能上调ABCA1的mRNA以及蛋白水平,而且能使小鼠巨噬细胞RAW264.7内胆固醇流出增加,脂滴量减少,是具有较好效果的ABCA1上调剂.
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基于荧光图像的抗肿瘤细胞迁移药物筛选方法
本文建立了一种基于荧光图像的抗肿瘤细胞迁移药物筛选方法.应用Hoechst 33342荧光染料染色和96孔Transwell板,通过细胞荧光图像采集与分析平台对正常组和加药组细胞荧光图像进行定量分析,建立了一种快速筛选抗肿瘤细胞迁移药物的新方法.对本方法的稳定性、精密度、荧光染色时间和迁移时间进行了考察和优化,并对抗肿瘤药紫杉醇的肿瘤细胞迁移抑制作用进行了定量分析,计算得到紫杉醇抗肿瘤细胞迁移的IC50为0.717μmol·L-1.采用该方法对中药泽泻24个组分进行筛选,发现1个活性组分.结果表明,该方法快速、准确、重现性好,能够用于抗肿瘤细胞迁移药物的快速筛选.
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谷胱甘肽转移酶抑制剂的高通量筛选
谷胱甘肽转移酶(glutathione Stransferase,GST)是一组具有多种生理功能的同工酶家族,广泛分布于动植物体内,作为机体的II相解毒酶,参与机体的解毒作用[1].研究表明,GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关[2～4].因此,GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点.目前已知的GST抑制剂大多因毒性较大,限制了临床应用.研究发现,一些动植物体内含有对GST有抑制剂作用的成分[5～8].为了广泛寻找GST特异性抑制剂,本研究旨在建立一种快速、高效、稳定、经济的高通量筛选方法,以GST为靶点,通过高通量筛选技术,对自然界广泛存在着的抑制GST活性的物质进行筛选,以期为开发安全有效的、提高耐药肿瘤临床化疗敏感性的药物提供新的技术方法.
关键词： 谷胱苷肽转移酶 谷胱苷肽转移酶抑制剂 高通量筛选 -
仓鼠糜酶2抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用
本研究拟建立重组仓鼠糜酶2 (chymase 2)抑制剂的体外高通量筛选模型,寻找新型的糜酶2抑制剂.首先,利用大肠杆菌表达、制备成熟的重组仓鼠糜酶2蛋白,以384孔微板为媒介,建立基于荧光方法测定酶活性的抑制剂筛选模型,结果表明所建立的糜酶2抑制剂高通量筛选模型具有灵敏、稳定、重复性好的特点(Z′=0.84).利用建立的模型对40 080种样品(包括28 060种化合物和12 020种天然产物提取物)进行抑制活性筛选,取抑制率大于90％的613种样品进行复筛.终确定化合物J16647和J16648具有较强的抑制活性,其IC50值分别为0.823和0.690 μmol·L-1.
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用甲基噻唑蓝筛选抗铜绿假单胞菌药物方法的建立
目的:建立适合铜绿假单胞菌的定量、快速、体外高通量药物筛选方法.方法:优化甲基噻唑蓝法检测活细菌数量的实验条件,用MIC方法与MTT法比较2种已知抗生素的抗菌作用.结果:微量培养对细菌生长无影响,佳MTT浓度和反应时间分别为5 mg·mL-1和1 h.在同一培养时间,菌浓度在1×107～1×1010CFU·mL-1范围内,甲臜的吸收度与菌浓度呈线性相关.用2种抗生素比较MIC方法与MTT法药敏测定的结果一致.结论:MTT微量法进行抗铜绿假单胞菌新药筛选操作简便,省时省力,成本较低,结果稳定,具有可重复性,适宜体外高通量药物筛选.
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糖原磷酸化酶抑制剂高通量筛选模型的建立
目的:建立糖原磷酸化酶(GPa)抑制剂的体外高通量筛选模型.方法:用梯度离心方法提取大鼠肝脏GPa,以葡萄糖-1-磷酸作为底物,通过测定反应中磷酸根的释放量,间接反映肝脏GPa的活性.通过对反应体系的优化,调整反应条件,建立96孔微孔板的高通量筛选模型,用咖啡因对此模型进行验证,并评价高通量技术参数[Z'-因子(Z'-factor),信号本底比(signal to background,S/B),信噪比(signal to noise,S/N)].用此模型对5000个样品(包括合成化合物、天然提取物)组成的随机库进行体外筛选,考察这些样品对GPa的抑制作用.结果:确定反应体系条件是:反应温度25℃,反应时间30 min,底物浓度0.5 mmol·L-1,大鼠肝脏GPa的用量为250 ng.用此条件测定咖啡因对GPa的抑制曲线,计算其半数抑制浓度(IC50)为(285.3±39.6)μmol·L-1,与文献报道(IC50=240μmol·L-1)基本一致;本模型技术参数Z'-因子=0.79,S/B=0.45,S/N=11.32,表明此模型可以用于高通量筛选.应用此模型筛选得到有活性的化合物9个,其IC50在3.56～45.75/μmol·L-1.结论:建立的体外GPa抑制剂高通量筛选模型具有快速、微量、准确的特点,可以作为研究降糖药的工具.
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以耻垢分枝杆菌为模式菌快速筛选新型抗结核药物
目的:评价以耻垢分枝杆菌(Msm)进行抗结核药物筛选的可行性与局限性,并应用该菌快速筛选新型抗结核药物先导物.方法:测定抗结核药物对Msm的小抑菌浓度(MIC);用基于微孔板的高通量方法筛选抑制Msm和结核分枝杆菌(MTB)的化合物;用MTT法测定抗结核化合物的细胞毒性.结果:靶向于分枝菌酸和蛋白质合成、能量和核酸代谢的药物,在抑制Msm和MTB方面具有平行性;从7万余样品中筛选到5个对MTB(H37Rv)的MIC小于10 μg·mL-1的化合物;其中的IMBYH2232为喹啉胺类化合物,对MTB(H37 Rv)的MIC为0.125 μg·mL-1,该化合物对巨噬细胞J774A.1、人肝细胞L02和人肾上皮细胞293T的ID50分别为12.5,15.2和10.5 μg·mL-1.结论:本研究确定了Msm高效快速表型筛选模型的可行性与局限性,发现了具有极强的抗结核活性的化合物.
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丁酰胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选
目的:建立丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BuChE)活性的高通量检测方法,用以筛选BuChE抑制剂及乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)和BuChE的双重抑制剂.方法:人血浆以0.05μmol·L-1PBS稀释作为BuChE反应液,采用DTNB法检测BuChE活性.化合物样品与酶反应液预孵30min,加入底物氯化丁酰巯基胆碱(BuSch)和显色剂5,5'一二硫双硝基苯甲酸(DTNB),室温孵育60 min后,于412 nm检测吸收度.结果:通过对反应体系的优化,建立了可靠的筛选模型,并对76 730个样品进行筛选,得到22个具有良好量效关系的活性化合物,命中率0.029%.结论:建立了操作简单、反应灵敏、结果稳定的适用于高通量筛选的BuChE抑制剂体外筛选模型,并发现了一些具有较好活性的化合物.
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GPR120选择性剪切异构体2的高通量药物筛选细胞模型的构建
目的:建立GPR120选择性剪切异构体2的功能性筛选模型,筛选GPR120的激动剂和抑制剂,开发防治糖尿病等疾病的药物.方法:从健康人胎脑cDNA文库中得到缺失了第3外显子的GPR120选择性剪切异构体2(hGPR120-s)的cDNA,将其克隆到pcDNA3载体中,构建pcDNA3/hGPR120-s重组表达质粒,继而转染HEK293细胞,通过G418筛选,获得稳定表达该异构体的真核重组细胞系.利用特异性配体亚麻酸和GW9508探索和优化了筛选条件.并初步应用该模型研究各种天然脂肪酸的构效关系.结果:建立了稳定可靠的高通量筛选模型,Z'因子=0.69.结论:该系统适合于GPR120激动剂的高通量筛选.
关键词： GPR120 功能性钙流检测 高通量筛选 G蛋白偶联受体(GPCR) -
以微管蛋白为靶的高通量药物筛选方法的建立与应用
目的:以微管蛋白为靶建立高通量筛选(HTS)模型,以便有效地发现抗肿瘤化合物.方法:细胞培养与免疫荧光技术.结果:以常规的免疫组化(玻片)方法为基础优化实验条件,在96孔板上建立了以微管蛋白为靶点的高通量药物筛选模型;抗肿瘤药物紫杉醇和秋水仙碱作用于人肝癌HepG2细胞后,细胞的免疫荧光强度发生了明显的可检测的变化,间接反映药物对细胞微管蛋白聚合/解聚作用的影响,与理论预测结果一致.结论:基于人肿瘤细胞的以微管蛋白为靶点的高通量筛选方法可用于抗肿瘤化合物的筛选.
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基于UPLC-Q-TOF/MS分析枇杷叶抑制EGFR激酶的活性部位研究
目的:筛选具有EGFR激酶抑制活性的中药提取物,分析和鉴别其活性部位.方法:枇杷叶药材经石油醚渗滤、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后得到4个相应的提取部位.采用均相时间分辨荧光(HTRF)法检测抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激酶活性,计算提取物对EGFR激酶的抑制率.采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱,以0.1％甲酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱,210 ～ 400 nm扫描,使用ESI离子源,在正离子模式下采集数据.结果:枇杷叶乙醇部位显示较强的EGFR激酶抑制活性,IC50值为4.339 μg· mL-1.Q-TOF/MS测定的一级、二级质谱信息及结合文献鉴定枇杷叶乙醇提取物中16个化合物,包括12个已知成分与4个未知成分,其中主要成分为山香二烯酸、2α-羟基熊果酸、熊果酸和儿茶素.结论:枇杷叶乙醇提取物中的三萜类和酚类为其抑制EGFR激酶活性的主要活性成分.本研究为抗肿瘤新药提供依据.
