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乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选方法的优化及应用
目的:优化乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选方法,筛选发现结构新颖的抗阿尔茨海默病药物活性化合物.方法:采用DTNB法,建立乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型,考察了反应体系的大吸收波长、底物浓度、酶浓度、pH值、孵育温度和时间对系统的影响,终确定反应体系的佳条件,并通过Z'因子分析,考察模型的稳定性.结果:酶反应体系的佳条件为检测波长412 nm,底物浓度5 mmol·L-1,酶稀释倍数20倍,孵育温度37℃,孵育时间30 min,pH 7.4～8.0;测得该模型的Z'因子为0.654.通过乙酰胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选,发现了一批乙酰胆碱酯酶抑制剂.结论:优化后的乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型稳定可靠,适于高通量筛选.
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流感病毒核酸内切酶抑制剂高通量筛选模型的建立
目的:建立适于高通量筛选的流感病毒核酸内切酶(PAN)抑制剂筛选模型.方法:在大肠杆菌中诱导表达质粒,经蛋白纯化和浓缩,得到目的蛋白PAN.提取噬菌体M13K07的单链环状DNA为底物,应用荧光定量方法建立PAN抑制剂高通量筛选体系,并对应用虚拟筛选技术挑选的100个样品进行PAN抑制活性筛选.结果:反应体系在底物质量浓度0.2 μg· mL-1,pH 9.0,Mn2+浓度1 mmol·L-1,37℃温孵60 min的条件下酶活性佳.此时Z'因子为0.77,可用于高通量筛选.筛选结果发现7个样品对PAN具有抑制活性.结论:本研究建立的流感病毒核酸内切酶抑制剂高通量筛选体系可用于PAN抑制剂的筛选.
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结核分枝杆菌泛酸合成酶抑制剂的实验研究
目的:获得特异性靶向结核分枝杆菌泛酸合成酶的抑制剂,为开发针对该靶点的新型抗结核药物奠定基础.方法:重组表达结核分支杆菌H37Rv的泛酸合成酶,以酶活测定体系为基础构建高通量筛选模型,对筛选到的酶抑制剂进行酶促动力学研究,并运用分枝杆菌微量直观快速药敏试验法测定其体外抗结核活性.结果:得到了具有天然活性的泛酸合成酶,建立并优化了酶活测定体系及筛选模型,应用模型筛选得到了具有新结构的抑制剂.评价结果显示,该抑制剂具有显著的体外抗结核活性.结论:获得了具有显著体外抗结核活性的新型泛酸合成酶抑制剂.
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Cdk5/p35抑制剂高通量筛选方法的建立及应用
目的:建立适于高通量筛选的Cdk5/p35抑制剂筛选模型.方法:Cdk5/p35与其底物Histone H1反应时需消耗ATP,通过测定体系中ATP的剩余量,考察ATP浓度、酶浓度、底物浓度、反应温度、反应时间及体系pH等因素对酶促反应的影响,进而确定酶与底物反应的佳条件,并采用Z'因子评价该模型的可靠性和可行性.应用已建立的Cdk5/p35抑制剂高通量筛选模型筛选和发现活性化合物.结果:反应体系的佳反应条件为:ATP终浓度3μmol·L-1,Cdk5/p35终浓度30 nmol· L-1,Histone H1终浓度70 μmol·L-1,孵育温度37℃,孵育时间60 min,体系pH 7,Z'-因子为0.66.应用该模型对222个虚拟筛选挑选出的化合物进行筛选,发现了13个对Cdk5/p35抑制活性较好的化合物.结论:实验结果表明,该模型具有稳定、灵敏、高效等特点,可用于Cdk5/p35抑制剂的高通量筛选.该模型的建立,为Cdk5/p35抑制剂的发现以及Cdk5/p35调控AD的机制研究奠定基础.
关键词： 阿尔茨海默病 Cdk5/p35抑制剂 Tau蛋白磷酸化 高通量筛选 -
体外模型在药源性肾毒性评价中的研究进展
由于肾毒性物质的靶器官选择性,药物诱导的肾毒性是目前新药开发和临床应用中存在的重要问题,高通量肾毒性体外评价模型可以提高大量化合物的筛选效率,节约时间和成本,已经逐渐成为肾毒性研究的主要研究方法.虽然肾毒性体外评价模型的研究热度不断升温,但由于肾毒性的特异性,仍未能建立标准的体外评价模型.目前,肾毒性体外评价的研究主要基于传统的2D细胞模型,3D细胞模型尚在初级阶段.本文对近年来高通量肾毒性体外评价模型的研究进展做一综述.
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以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究
目的:筛选靶向结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyhransferase,IspD)的新型抗结核化合物,研制具有全新作用机制的新型抗多药耐药MTB药物.方法:应用高通量的微生物体外微量、直观快速的药敏试验方法,筛选得到具有抑制MTB生长的阳性化合物;同时在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中重组表达MTB的IspD,建立酶活测定方法,构建IspD酶抑制剂筛选模型,从具有抑制MTB生长的阳性化合物中筛选IspD抑制剂;对在酶水平上具有良好抑制活性的化合物进行作用机制研究,确定其对MTB (H37Rv)的低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),评价其抗菌谱,测定其对非洲绿猴肾细胞(Vero)和人肝癌细胞(HepG2)的毒性.结果:从4万多个化合物中初步得到了159个具有抑制MTB生长的阳性化合物,从中筛选得到了5个IspD的抑制剂,其中的IMB-4901显示出较好的IspD抑制活性(50％ inhibiting concentration,IC50=19.3 μg· mL-1)和抗MTB活性(MIC=1.6 μg· mL-1).结论:成功获得了以IspD为靶点的新型抗MTB药物先导化合物.
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细胞色素P450酶诱导和抑制效应高通量筛选系统研究进展
细胞色素P450酶(CYP450)活性的诱导或抑制,是引起临床药物代谢性相互作用的主要作用机制.目前确定候选药物出现此类相互作用可能性的主要方法是通过体外CYP450诱导和抑制潜能的快速筛选.现从CYP450诱导机制、目前发展的综合活性筛选系统和诱导筛选系统、抑制效应筛选系统以及硅上虚拟筛选系统等几个方面,对CYP450诱导和抑制效应高通量筛选系统的研究进展作一综述.
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创新药筛选早期阶段的药物生物转化研究
组合化学和高通量筛选技术的出现,大大加快了创新药研究的进度。但要避免先导化合物中出现口服吸收不佳、生物转化多态性、伍用药物出现交互反应等缺点;药物生转研究须提前采用高通量方法在早期阶段进行,这是当今国际上的主导趋势。本文对这一领域的进展，作一综述。
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我国新药筛选研究的回顾与展望
对大量化合物进行筛选,发现具有生物活性的先导化合物,是研究开发新药的源头和起点,对整个创新药物的研究具有决定性意义.由于我国长期以仿制国外药品为主,使新药筛选与相关基础研究成为新药研究系统工程中薄弱的环节."八五"期间,我国开始重视新药筛选工作,在国家计委支持下,由中国科学院上海药物研究所新药研究国家重点实验室、北京医科大学天然药物及仿生药物国家重点实验室、中国医学科学院药物研究所组成<国家医药筛选协作组>,向全国征集样品,免费筛选,并研究建立了若干新的筛选模型与方法,发现了一些值得深入研究的先导化合物.
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《图解毒性病理学》书评
人类进入21世纪后,由于以基因组学为代表的生命科学、组合化学、高通量筛选和信息技术的飞速发展,各种类别迥然不同的新型药物和生物技术产品不断问世.
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生物芯片技术在药物研究与开发中的应用
近年来,以DNA芯片为代表的生物芯片技术,得到了迅猛发展,已有多种不同功用的生物芯片问世.目前生物芯片技术已应用于分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药开发、司法鉴定和食品卫生监督等诸多领域,已成为各国学术界和工业界所瞩目并研究的一个热点.生物芯片技术的飞速发展,引起了制药业的极大兴趣,使得生物芯片技术在药物研究与开发领域得到越来越广泛的应用,已逐渐渗入到药物研发过程中的各个步骤.目前,生物芯片技术已经应用于药物靶点发现与药物作用机制研究、超高通量药物筛选、毒理学研究、药物基因组学研究以及药物分析等药物研发环节.可以预见,随着生物芯片技术的不断发展,生物芯片技术将在药物研究与开发领域,尤其是在中药现代化研究中得到更广泛更深入的应用.
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VolSurf软件及其在药物代谢性质虚拟高通量筛选中的应用
当前新药的研发模式发生了改变,需要药代动力学早期参与以减少损失.本文介绍了目前国外正在研究开发与应用的用于新药早期药代动力学虚拟高通量筛选的软件之一VolSurf的特点及其应用.
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微生物来源的卡斯帕酶-3抑制剂F03ZA-673A的研究
目的 筛选细胞凋亡相关疾病中重要靶点--卡斯帕酶-3抑制剂.方法 利用自建的快速、高效、高通量的卡斯帕酶-3抑制剂的筛选方法,从数千株菌株中筛选阳性菌株.阳性菌株的发酵产物进行分离纯化获得活性化合物,再通过对活性化合物的紫外、质谱、核磁等理化数据的分析进行结构鉴定.结果 筛选得到一个活性化合物F03ZA-673A.该化合物对卡斯帕酶-3有较强的抑制活性,IC50=21.1 μmol·L-1,它与L-671,776结构相同.结论 F03ZA-673 A为一个活性较强的微生物来源卡斯帕酶-3特异性的抑制剂,该化合物对卡斯帕酶-3的抑制活性未见国内外报道.
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Rho激酶抑制剂的高通量筛选模型建立与应用
目的 建立重组人Rho激酶(Rho-associated coiled-coil froming protein kinase,ROCK)的表达、纯化方法,并建立基于荧光素酶发光法的ROCK抑制剂的高通量筛选(high throughput screening,HTS)模型,通过大规模筛选发现其选择性抑制剂,为心脑血管、神经系统等疾病的预防和治疗提供新的治疗策略.方法 用分子生物学的技术,构建ROCK-1/pET32a表达质粒,转化入大肠杆菌BL21中,筛选阳性克隆,诱导目的 蛋白表达.纯化可溶性蛋白后,用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay进行活性鉴定,用Z'因子评价HTS方法的稳定性,并对3万个化合物和中药提取物进行了HTS.结果 重组人ROCK-Ⅰ蛋白显示较好的激酶活性,建立的HTS模型Z'因子为0.75,基于此模型筛选出4个活性化舍物和5个活性提取物.结论 本实验建立了一个简单而快速的人重组ROCK-Ⅰ表达系统,该系统具有低成本、稳定、表达量大等特点.ROCK-Ⅰ的化学发光检测方法适用于HTS技术,具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性.
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血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用
目的 利用均相时间分辨荧光(HTRF)技术建立血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量药物筛选模型,从化合物样品库中寻找小分子抑制剂.方法 使用20μL检测体系,384低容量白板,采用均相时间分辨荧光技术对反应体系中的酶活性进行荧光检测,进而评价待测样品的抑制活性.模型建立的体系优化包括如下实验步骤:酶浓度及反应时间优化,ATP和底物米氏常数测定,质控实验包括反应体系信噪比实验、抑制剂SU5416的IC5o测定,Z′因子的测定.在建立稳定模型检测体系之后,对本中心化合物库提供的10 560个样品进行活性筛选,并对部分活性化合物进行IC50的测定.结果 在血管内皮生长因子受体-2活性体系优化实验中求得血管内皮生长因子受体-2激酶适反应酶浓度为0.10 ng·μL-1,适反应时间为15min,ATP Km=0.75 mol·L-,底物Km=94.90 nmol·L-1,信噪比底物:SA =2:1,Z'值为0.85,阳性药IC50=1.03μmol·L-1.通过部分初筛活性样品进行复筛研究,得到3个活性化合物S2-14,S2-16、S2-38 IC50分剐为1.01×10-4,6.04×10-5,7.23×10-6 mol·L-1.结论 利用均相时间分辨荧光技术成功建立了血管内皮生长因子受体-2激酶高通量筛选模型,并进行了一定量的定向筛选研究,发现了若干先导化合物.本实验体系方法可靠,结果稳定,可作为抗血管新生天然产物筛选体系进行应用推广.
关键词： 均相时间分辨荧光 血管内皮生长因子受体-2 血管新生 高通量筛选 -
高效液相色谱-质谱联用法高通量筛选及检测哈茨木霉菌发酵液中peptaibols类抗菌肽
目的 高通量筛选及检测哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)CGMCC No.1780发酵液中peptaibols类抗菌肽.方法 以4,4’-(对二甲氨基)二苯基甲烷(TDM)特异性显色法做快速定性鉴定,以对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝生长的抑制作用做活性追踪；采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶及高效薄层层析硅胶板分离纯化哈茨木霉菌发酵液中peptaibols类抗菌肽；利用LC-MS/MS分析peptaibols类抗菌肽序列结构.结果 从哈茨木霉菌发酵液中分离出5组peptaibols类抗菌肽,经LC-MS/MS鉴定为20种peptaibols,其中包括5种新的peptaibols.结论 Peptaibols类抗菌肽是哈茨木霉菌主要抗生活性次生代谢产物之一,且种类较多,利用LC-MS/MS可快速有效鉴定哈茨木霉菌发酵液中peptaibols类抗菌肽的序列结构.
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以白色念珠菌为模型高通量筛选潜在抗真菌药物
目的通过高通量药物筛选来寻找有活性的广谱性抗真菌药物,专一性抗白色念珠菌药物以及特异性抑制含核酶的白色念珠菌生长的药物.方法以两株基因型不同的白色念珠菌菌株(一株含Ⅰ型内含子核酶,一株不含核酶)和一株非病原真菌啤酒酵母(不含Ⅰ型内含子核酶)为细胞模型,3种菌株依次以96孔板为容器,在起始菌液浓度的A580nm为0.1时分别加入10720种药物样品(包含化合物与天然产物),在30℃静止培养6 h,选取抑菌效率超过50%的样品进行复筛.结果通过初筛和复筛,发现了23种药物在10 μg·mL-1的浓度时的抑菌效率超过50%,其中1种药物特异性抑制含核酶的白色念珠菌生长,是潜在的抗核酶药物;4种药物特异抑制白色念珠菌的生长,是潜在的抗白色念珠菌药物;18种药物抑制所有模式菌株的生长,是潜在的广谱性抗真菌药物.结论本研究在国内首次采用自动化工作站进行抗真菌药物的高通量药物筛选,方法简便快捷,筛选结果稳定可靠,并筛选到一些有希望向临床发展的抗真菌药物活性样品.此方法有可能应用于抗其他病原微生物的药物筛选.
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荧光技术在高通量药物筛选中的应用
目的 高通量筛选是现代发现药物先导化合物的主要手段之一.荧光技术在高通量药物筛选中被广泛使用,本文对荧光技术在高通量药物筛选中的研究进展进行综述.方法 查阅近年国内外文献,对7种荧光检测技术的原理及其在高通量药物筛选中的应用情况进行归纳总结,包括荧光强度分析法、荧光偏振检测法.荧光共振能量转移检测法、均相时间分辨荧光检测法、荧光关联光谱、荧光成像分析、荧光报告系统.结果 与结论现在已经建成多种高通量药物筛选模型,利用荧光检测技术进行高通量药物筛选具有广阔的应用前景.
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从化合物库中发现药物先导化合物
目的介绍通过筛选化合物库发现药物先导化合物的方法.方法根据近几年国内外相关文章进行分析、汇总、综述.结果[ HTK〗从化合物库中发现药物先导化合物的方法包括大范围多品种的随机筛选、主题库的筛选、定向筛选和运用数据库的三维分子模型筛选.结论运用这些方法,成功地从化合物库中发现了很多有发展前景的先导化合物,有些已进入临床试验阶段, 大大加快了研制新药的速度.
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蛋白质芯片技术及其在新药研究中的应用
目的介绍蛋白质芯片技术以及评价其在新药研究和开发中的应用.方法综述近年来国内外有关文献.结果蛋白质芯片技术在确证新的药物治疗靶点、高通量检测和筛选药物以及评价药物效能和毒性等方面具有巨大的应用前景.结论蛋白质芯片技术作为一个技术平台,具有高度并行性、高通量、微型化和自动化等特点,将成为蛋白质的功能研究和新药开发的新工具.
