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几种常见药物筛选的新技术
药物筛选的发展和新技术的出现是紧密相关的,文章对当前药物筛选中较常用的双杂交技术、基因工程技术、高通量筛选和生物信息学从概念、原理、优点、缺点和应用领域等方面作了简单的阐述,以期为相关的人员提供参考.
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荧光共振能量转移电压敏感探针在钾通道抑制剂高通量筛选中的应用
目的:建立以荧光共振能量转移(FRET)电压敏感探针为染料的钾通道抑制剂高通量筛选模型.方法:分别用电压敏感探针的能量供体CC2-DMPE与能量受体DiSBAC2(3)先后负载RBL-2H3细胞,测量细胞去极化前后 460 nm 和 570 nm 的荧光变化,根据荧光的变化反映细胞膜电压的变化.结果:本筛选方法稳定可靠,系统Z'因子达到 0.60 以上,日筛选通量能够达到 10 000 药次.对102个定向合成的化合物进行筛选,有11个化合物的荧光信号变化率有较好的剂量效应关系.结论:此模型具有良好的稳定性和特异性,FRET电压敏感探针是钾通道抑制剂高通量筛选的理想染料.
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混合促进剂在经皮给药中的应用研究进展
研究表明混合促进剂对药物具有良好的促透效果,克服了使用单个化学促进剂的不足,随着对其促透机制和处方高通量筛选方法的进一步研究,混合促进剂在经皮给药系统中将有更好的发展前景.本文依据近年来国内外相关文献,从药物在皮肤的转运、化学促进剂及混合促进剂对药物的促透机制、处方筛选和实践应用等方面对混合促进剂在经皮给药系统中的应用研究进展进行综述.
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从放线菌发酵液中高通量筛选端粒酶抑制剂
目的 从2 000多株放线菌发酵液中高通量筛选特异性端粒酶抑制剂.方法 经对持有的3种端粒酶抑制剂筛选模型即3株酵母菌PCR验证后,将其接种于含3-AT、组氨酸缺乏的酵母培养液,然后分别调整其菌液浓度和筛选样品剂量,以备高通量筛选.将酵母菌液移于96孔板,加入待测样品,振摇培养并定时经多功能微孔板分析仪进行定量分析,选取抑菌率大于0.45的样品进行复筛.结果 经验证所持有的3种端粒酶抑制剂筛选模型均可用于下一步的筛选,并选取酵母菌液OD_(595nm) 0.04做为起始筛选浓度,选取放线菌发酵液剂量为5 ml,通过对放线菌发酵液进行初筛和复筛,发现了14株放线菌发酵液的抑菌效率超过0.45.结论 该研究首次高通量筛选端粒酶抑制剂,方法简便快捷,筛选结果稳定可靠,并筛选到14株放线菌发酵液可能具有抗肿瘤活性,为进一步研究和开发抗肿瘤新药奠定基础.
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高通量筛选JAK-STAT6信号传导通路抑制剂方法的初步建立
目的 构建可用于高通量筛选JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的工程细胞株,建立稳定可靠的筛选方法.方法 利用基因重组和转染技术,将STAT6特异性识别启动子IgE基因序列和虫荧光素酶报告基因联合插入pGMV质粒,脂质体法转染至HeLa细胞,经潮红霉素B抗性筛选及报告基因检测,得到稳定表达虫荧光素酶的工程细胞株.通过优化溶剂DMSO浓度,IL-4作用浓度及孵育时间等筛选条件,建立了可靠的筛选方法,并在此基础上对1600种化合物进行了筛选.结果 建立的筛选方法稳定可靠,系统Z'因子达到0.64.通过对1 600种化合物的筛选,得到3个抑制效果较理想的化合物并测得其IG50值.结论 所建立的高通量筛选方法可用于JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的筛选.
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基于报告基因检测的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型的建立
目的：建立基于报告基因法的高通量筛选细胞模型,用来发现PXR、FXR和LXRα受体激动剂。方法利用Re-al-time定量PCR方法比较HEK293、HepG2和LS174T细胞中内源性核受体 PXR、FXR 和 LXRα的表达量,将 pSG5-hPXR 和 pGL3-XREM-CYP3A4、pEGFP-N3-hFXR 和 EcRE-TK-Luc、 pCMX-FLAG-hLXRα和 pGL3-XREM-CYP3A4等质粒分别共转染到工具细胞中,优化共转染比例,并考察阳性药与萤光素酶报告基因表达强度的量效关系、模型特异性和稳定性。结果①根据Real-time定量PCR结果,模型选用低表达PXR、FXR和LXRα的HEK293细胞作为工具细胞；②根据不同共转染比例对报告基因活性的结果,PXR、FXR和LXRα报告基因药物筛选模型的报告基因和过表达质粒比例,终分别选择1∶1、2∶1和2∶1；③模型中,报告基因活性均与相应阳性药物( PXR/Rif、FXR/CDCA和LXRα/T0901317)呈剂量依赖性增长；④仅 PXR 激动剂 Rif、FXR激动剂CDCA和LXRα激动剂T0901317可分别明显增加相应筛选模型的报告基因活性,分别重复5次试验后,计算得Z′值分别为0．58、0．66和0．63。结论该研究建立的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型,具有良好的特异性和稳定性,适用于对PXR、FXR和LXRα受体激动剂的筛选,进而开发以核受体作为药物靶点的药物。
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5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立
目的 为发现5-羟色胺1A(5-HT1A)受体的激动剂,通过报告基因活性检测的方法建立高通量筛选(HTS)细胞模型.方法 将带有人源5-HT1A受体的真核表达质粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-h5-HT1AR)与带有报告基因pCRE-luc的pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-pCRE-luc)共转染到工具细胞中,通过对工具细胞选择、共转染质粒比例、化合物孵育时间及阳性化合物选择等条件进行探索和优化,建立了稳定表达人源5-HT1A受体并可用于该受体激动剂筛选的细胞模型(HEK293-h5-HT1AR).结果 ①根据瞬转实验中信号值的高低,模型采用HEK293细胞作为工具细胞;② 根据瞬转实验中的信噪比,发现pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc的佳比例为1:3;③ 对化合物孵育时间进行优化,选择的佳孵育时间为6 h;④阳性化合物的选择过程中,实验研究了5-HT.HCl,Flibanserin,8-OH-DPAT 以及 Lorcaserin(APD356)4个已报道有5-HT1A受体激动活性的化合物,结果表明APD356在该体系中适合作为阳性对照化合物.⑤ 该细胞株连续培养12代,信号稳定.结论 通过对一系列实验条件进行选择和优化,建立了一个稳定表达人源5-HT1A受体的细胞模型,该模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选.
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P-gp蛋白功能抑制剂高通量筛选模型的建立与应用
目的 建立高通量筛选模型,寻找疗效好、毒副作用小的肿瘤多药耐药逆转剂.方法 以罗丹明123荧光染料胞内积累实验为基础,建立基于细胞水平的高通量筛选模型,对480个中药样品进行了高通量筛选,并采用剂量-活性依赖实验和抗性增敏实验验证阳性样品.结果 模型Z'因子为0.72,筛选得到2个中药样品.结论 建立的P-gp蛋白功能抑制剂高通量筛选模型稳定性好,灵敏度高,筛选得到的2种中药样品具有较好的P-gp蛋白功能抑制活性.
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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制剂高通量筛选模型
目的 建立体外聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]抑制剂的高通量筛选模型,筛选潜在的PARP-1抑制剂.方法 将PARP-1、裸DNA与底物NAD+反应,再将剩余底物NAD+转化为荧光物质,通过测定其荧光强度来决定PARP-1的活性,并以此筛选PARP-1的抑制剂.建立384孔板的高通量筛选模型,对9 280个化合物(包括合成化合物、天然产物、微生物发酵提取物)组成的随机库进行体外筛选.结果 筛选出148个活性化合物对PARP-1的抑制作用大于70%,终确定3个化合物具有较高的抑制活性.结论 建立的PARP-1抑制剂高通量筛选模型具有灵敏度高、快速、微量、准确的特点.
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针对趋化因子受体CCR5的SPA-WGA药物筛选方法
目的 建立针对趋化因子受体CCR5的药物筛选SPAWGA法[35S]GTPγS结合实验方法.方法 通过降低SPAWGA小球用量和对其他各种因素进行优化,如细胞膜用量、GDP浓度、体系孵育时间和样品连续测量时间,建立了SPAWGA法[35S]GTPyS结合实验方法.结果 后优化得到实验条件为:100μl反应体系,0.1 mg SPA-WGA小球,10μgCHO-CCR5细胞膜,10μmol·L-1 GDP和0.3 nmol·L-1[35S]GTPγS,室温孵育1.5 h并且在1 200 min之内完成所有样品测量.该法与传统抽滤法比较,测量得到RANTES的EC50分别为:1.40 nmo1·L-1和2.90 nmol·L-1,测量得到SCH-C的IC50分别为:2.95 nmol·L-1和2.73 nmol·L-1,测量结果相似,均呈现出较好的剂量效应关系.利用该法筛选54个化合物,筛到3个IC50在1～10 nmol·L-1的化合物.这3个化合物是否具有HIV-1进入抑制剂的潜在开发价值,还有待体外抗HIV-1实验的进一步验证和筛选.结论 此方法操作简便,灵敏性和重现性好,且可高通量和自动化,该法适用于能与Gi家族蛋白偶联的GPCR的高通量药物筛选.
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基于FP法的EPOR配体高通量筛选模型
目的寻找疗效好、副作用小的EPO功能类似物.方法用FITC标记EPO,从FVA细胞中提取含EPO受体的细胞膜,建立了用FP法筛选EPOR配体的模型,并对实验条件进行了优化和可能影响模型的因素(DMSO)进行了分析,此外用 Z′因子对此模型进行了评估.结果样品中含0%～5% DMSO 不会对实验结果产生影响,Z′因子的值为0.78.结论建立的筛选模型稳定性好和准确率高.
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酪氨酸蛋白激酶抑制剂的高通量筛选模型
目的建立酪氨酸激酶抑制剂的高通量筛选模型.方法以多聚酪氨酸多肽为底物,用提取的酪氨酸激酶催化酪氨酸的磷酸化,用酶标记的单克隆抗体检测酪氨酸激酶的活性,根据待测样品对激酶活性的抑制程度,筛选酪氨酸激酶抑制剂.结果酶标板包被液的浓度为20 mg·L-1 PGT,使用25 mg·L-1 蛋白质的PTK初提物,在37℃条件下孵育60 min,再使用2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体IgG2bk与反应产物结合、测定.同一微孔板各样品间的测定误差为0.26,微孔板间和日间的测定误差分别为0.79和0.69.Genistein对PTK的IC50为110 μmol·L-1.从收集的7 680个样品中,筛选出具有活性的样品16个,选中率约2‰.结论建立的酪氨酸激酶抑制剂高通量药物筛选模型,具有灵敏度高、结果稳定的特性,在每块实验上同时设立空白和对照,测定结果具有可比性.
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基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法
目的 利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法.方法 构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TIc)分别对目的蛋白进行酶切反应.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化.酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值.结果 设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒.表达并纯化后获得纯度为90％左右的重组蛋白,命名为CY-VAMP.利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2～32 μ.mol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65～110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适.CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图大时在1.5左右,小在0.5左右.酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16+0.28) s-1.TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1.结论 成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需.
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p53途径的双荧光素酶报告系统在食品致癌物筛选中的应用研究
目的 应用p53途径的双荧光素酶报告系统筛选食品中的致癌物.方法 双荧光素酶试验中,采用萤火虫荧光素酶检测食品中常见的致突变性/致癌性物质的p53基因表达水平,同时以海肾荧光素酶作为内对照.结果 文献报道有致突变性/致癌性的8个样品中有7个双荧光素酶试验结果为阳性,而且阳性剂量低于大多数传统毒理试验,阳性样品的荧光素酶活性有随着处理剂量的增加而增高的趋势;缺乏致突变性/致癌性文献的隐色结晶紫的荧光素酶活性仅略有增加.结论 p53途径的双荧光素酶报告系统可能是一种比较理想的高通量食品致癌物筛选系统.
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高通量筛选方法在酶定向进化中的应用
在过去的几十年中,酶作为经济、环保的生物催化剂已经越来越受到工业以及医药领域的重视,与此同时,高通量筛选方法(HTS)作为酶定向进化中的一项重要技术也得到长足的发展.近些年来,一系列高通量筛选方法的建立使得酶的筛选更加灵敏、高效、快捷,大量的能够适用于工业以及医药领域的工程酶也相继产生.综述了近期建立的一些高通量筛选方法,简要概述了各种筛选方法的基本原理以及存在的优点和不足,并对高通量筛选方法将来的发展做出了展望.
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酪氨酸激酶抑制剂抗肿瘤活性评价方法研究进展
目的 酪氨酸激酶的突变和过表达在肿瘤无限制生长、抗凋亡、侵袭和转移中具有重要作用.筛选和评估酪氨酸激酶抑制剂抗肿瘤活性已经成为靶向抗肿瘤药物研究的热点和关键点,多种评价酪氨酸激酶抑制剂抗肿瘤活性的方法在抗肿瘤药物研究中各有优势,自动化、规模化的高通量靶向酪氨酸激酶抑制剂抗肿瘤活性评价方法将可为恶性肿瘤的治疗筛选出大量候选化合物,而分子影像学的应用将有助于尽早提供大量更有效、经济和安全的肿瘤靶向治疗武器.
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枸地氯雷他定与地氯雷他定治疗慢性荨麻疹随机对照研究
枸地氯雷他定是以地氯雷他定为基础,经分子设计、高通量筛选而得到的创新药物.为研究其临床疗效和安全性,我们使用枸地氯雷他定和地氯雷他定对照治疗慢性荨麻疹,现报道如下.
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适用于中药醛糖还原酶抑制剂高通量筛选的细胞模型的建立
目的:建立一种适合中药醛糖还原酶抑制剂高通量筛选的细胞模型,以避免中药对传统离体筛选方法的干扰.方法:以视网膜周细胞、肾小球系膜细胞为研究对象,确定佳孵育条件,并建立酶促微量反应法测定山梨醇含量,两者联动,建立细胞模型.结果:细胞孵育体系的佳反应条件为30 mmol·L-1葡萄糖孵育4 h;酶促微量反应测定山梨醇含量的精密度、重现性良好,山梨醇浓度变化与荧光强度变化呈线性正相关.山梨醇浓度在6.25×10-6～2.5×10-6mol·L-1范围内线性关系良好.结论:该细胞模犁能够排除中药对酶法测定醛糖还原酶活性的干扰,模拟体内的反应情况,使应用该模型进行的醛糖还原酶抑制剂筛选更具针对性,并适用于中药醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选.
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以蛋白质磷酸酶CDC25A/B为靶标的抗癌药筛选体系的构建
目的 通过克隆和表达人蛋白质磷酸酶CDC25A/B融合蛋白,探讨构建高通量靶向抗癌药筛选体系的途径.方法 采用RT-PCR技术克隆人CDC25A/B催化区结构域cDNA序列,构建pGEX-4T-1-CDC25A/B原核表达质粒,表达和纯化携带还原型谷胱甘肽(GSH)标签的融合蛋白.以对硝基苯基磷酸盐(pNPP)为底物,在96孔板上建立分别以GST-CDC25A/B为靶标的筛选体系,应用维生素K3(VK3)进行验证性抑制剂筛选.结果 成功表达和纯化了GST-CDC25A/B融合蛋白,建立了相应的高通量磷酸酶抑制剂筛选体系.在相同反应条件下,GSTCDC25B对pNPP的水解活性是GST-CDC25A的6倍.VK3对CDC25A/B的半数抑制浓度(IC50)分别为0.8和1.8μg/ml.结论 通过表达和纯化CDC25A/B催化区结构域与GST的融合蛋白,可以高效率的建立靶酶抑制剂高通量筛选体系,为进一步研发VK3衍生物类新型靶向抗癌药奠定了基础.
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高通量活性筛选技术在中药研究中的应用
高通量筛选(HTS)技术是以药物和靶点之间的相互作用为检测指标,高通量地筛选与特定靶点具有亲和力样品的技术.与传统方法相比,HTS具有快速、高效、灵敏、经济的特点,近年来在中药研发领域得到较好的应用,有效推动了中药现代化的进程.HTS包含初筛、复筛、深入筛选、确证筛选四个过程.其模型类别包括分子水平模型、细胞水平模型和动物水平模型.HTS常用的技术包括报告基因系统、荧光影像技术、荧光标记检测、离子流检测和微量化技术.
