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原研药与仿制品质量差异对患者的影响
从研发的角度,药物可以简单的分为原创新药、Me Too药和仿制药.原创新药的研发是一个极其复杂的过程,从开发至上市需经过高通量筛选、理化特性研究、体外筛选、体内筛选等临床前研究;Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床研究;在此基础上经注册后方能上市.
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RNA干扰高通量筛选技术在乳腺癌研究领域的应用
RNA干扰(RNAi)是双链RNA分子诱发的基因沉默过程,可体现在转录水平或转录后水平.近年来,学者在细胞水平进行多基因组RNAi高通量筛选(HTS),研究包括乳腺癌在内的恶性肿瘤复杂的生物学行为和进展.构建高通量RNAi文库可特异性地筛选异常信号通路、揭示新型药物靶点、优化肿瘤综合治疗方案等,已成为研究肿瘤发生发展的有力工具.新近提出的"合成致死"策略联合RNAi HTS,也成功发现新的有效治疗靶点.乳腺癌是一种多基因、多分子径路参与,经过多阶段变化累积的全身性疾病,RNAi HTS技术的推广将有助于研究乳腺癌发生发展的复杂过程,探明其快速生长、侵袭及转移的潜在机制.基于此,本文概述了RNAi HTS技术的原理及其在乳腺癌基础和临床研究领域的新应用.
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药物代谢动力学在药物研究中的应用与进展(上)
药物代谢动力学(pharmacokinetics,PK)是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄(ADME)随时间变化的过程及规律的一门学科[1].理想的药物要有优良而持久的药效和较低的毒副作用,同时还应具有良好的药动学性质,即较高的生物利用度和合适的药物半衰期.
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高通量药物代谢与毒性筛选平台研究进展
现代药物研发是一个多阶段的过程,需要多学科的参与,包括基于疾病的药物作用靶点的发现、应用高通量技术对化合物和/或天然产物库进行筛选、对先导化合物的进行结构优化并进行体内外药物代谢动力学、毒理学以及生物利用度的研究,后进入临床前研究和临床研究.
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基于分子药理学的中药研究
东方传统中药治疗和现代医学之间虽然存在着一些本质概念上的差异,但是传统中药制剂成功治愈许多人类疾病的结果表明传统中药和现代医药有相似的机理.本文简述了基于分子药理学和中药的新药筛选现状及发展趋势.
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构建p53双荧光报告载体及其功能验证
目的：构建p53双荧光报告载体，验证其能否模拟野生型p53的生物学活性并适用于高通量筛选。方法：用PCR在p53和萤火虫荧光素酶的开放阅读框两端引入酶切位点并移除p53的终止密码和萤火虫荧光素酶的起始密码，然后将二者插入到由内部核糖体进入位点引导的海肾荧光素酶的上游，从而构建出一个能表达P53萤火虫荧光素融合蛋白的p53FL/IRES/RL双荧光报告载体。转染该报告载体后，检测被表达的P53荧光素融合蛋白是否被MDM2降解、该融合蛋白的亚细胞定位和它对p53特异性启动子的诱导。结果：成功构建出p53双荧光报告载体。该载体在宿主细胞内表达的P53荧光素融合蛋白能被MDM2降解；主要分布于细胞核；具有野生型p53的转录活性。结论：新构建的p53双荧光报告载体p53FL/IRES/RL能有效模拟野生型p53的功能，适用于高通量筛选调节P53蛋白含量的药物、基因或化合物。
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23种岭南中药抗肝纤维化有效部位的高通量筛选
目的 采用高通量筛选技术评价23种单味岭南中药提取物对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响,初步筛选出具有抗肝纤维化作用的活性部位.方法 将23种临床常用单味岭南中药分别先用95％乙醇提取,再用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水依次萃取,并制成115种中草药干浸膏.采用keyFluor488 Click-iT EdU评价不同浓度梯度(50 μg·mL-1、25μg· mL-1、12.5 μg·mL-1)干浸膏对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响.结果 能使HSC-T6的增殖率明显下降的乙醇总提取物有溪黄草、黑老虎、虎杖等13种,石油醚萃取部位有黑老虎、荔枝核、虎杖和苦石莲子4种,乙酸乙酯萃取部位有溪黄草、山芝麻等13种,水饱和正丁醇萃取部位有马蹄金,水萃取部位有翠云草.其中4个萃取部位均不能降低HSC-T6增殖率的有红丝线、金盏银盘、白花丹、鸡骨草.结论 通过对23种岭南中药的95％乙醇总提物、石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水萃取物进行筛选,发现溪黄草、黑老虎等提取物对HSC-T6细胞的增殖有抑制作用,为进一步开展抗纤维化中草药有效成分的筛选及体内动物研究提供实验依据.
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药物高通量筛选技术应用研究进展
高通量筛选(high throughput screening,HTS)是以分子和细胞水平的实验方法为基础,在微孔板上以自动化操作系统执行实验过程,通过灵敏快速的检测仪器采集实验数据、运用计算机对实验数据进行实验结果的分析处理.因此HTS具有大量样品的快速筛选、分子和细胞水平的特异性作用靶点、检测系统的高灵敏度、自动化操作系统和数据采集传输处理系统等优点.本文综述了一些新利用高通量筛选技术建立的新药筛选模型,主要介绍了这些模型的建立目的、在实际药物筛选中的应用以及筛选结果.
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寻找新的抗菌药物
抗生素诞生的那刻就伴随了耐药菌的出现。本文介绍了后基因组学时代主要筛选新抗生素的手段比如高通量筛选（HTS），讨论了抗生素药物作用靶点在新的抗生素药物筛选中的重要地位，并介绍了其他开发治疗细菌感染药物的思路，如通过抑制细菌毒力、增强宿主免疫的手段来治疗细菌感染。后提出要合理使用抗生素，为研发新抗生素争取时间。
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噬菌体展示技术应用于肿瘤的研究进展
噬菌体肽库展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术.编码多肽的外源DNA片段与噬茵体表面蛋白的编码基因重组后,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列,通过与特定的靶标反应.使展示特定蛋白的噬菌体从佑表达有各种外源性蛋白的噬茵体肽库中筛选出来,通过感染大肠杆菌使选择出的噬茵体扩增,然后进行序列测定,获得相应的结构和功能信息,实现了高通量筛选,成为一种有效的分子筛选方法.
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利用自主发光结核分枝杆菌快速连续检测抗结核药物的细胞内活性
目的:建立无筛选标记的自主发光结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型并利用该模型直接快速连续检测抗结核药物的细胞内活性.方法:将小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)接入96孔板中贴壁过夜处理,然后利用UAIRv菌感染4h后进行清洗,加入抗结核药物后进行培养.分别在感染后的第0～7天对同一样品进行发光值的检测,直接通过发光值的变化进行药效的判断.结果:成功构建UAlRv感染小鼠巨噬细胞的模型,并利用该模型成功对利福平(RIF),异烟肼(INH),莫西沙星(MFX)和利奈唑胺(LZD)等抗结核药物进行细胞内抗结核作用评价.UAIRv体外检测药物活性的小抑菌浓度(MIC,μg/mL)分别为RIF 0.125,INH 0.06,MFX 0.5和LZD 2.0,与之前报道过的利用带抗性标记的自主发光结核杆菌体外检测药物活性一致.在UAlRv感染巨噬细胞模型中药物的MIC(μg/mL)分别为RIF 0.125,INH 0.015,MFX 0.5和LZD 4.0,这与报道过的利用普通H37Rv结核菌感染巨噬细胞模型检测的结果相一致.结论:利用UAlRv感染巨噬细胞模型可快速、经济、连续地检测抗结核药物的细胞内活性,并可能用于高通量筛选/评价抗结核药物.
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2型糖尿病药物筛选技术研究进展
2型糖尿病的发病率逐年递增,针对其治疗而进行的寻找新药的药物筛选技术也在不断进步,从整体动物水平上升到细胞、分子水平,由传统的筛选技术发展为快速高效的高通量筛选.本文将对2型糖尿病的药物筛选技术逐一进行概述.
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NGS在HLA基因分型中的应用
本文旨在介绍下一代测序(NGS)方法的原理,使用流程及现阶段存在的问题,强调这种方法在对人类白细胞抗原(HLA)基因分析中的应用,及其推广的价值.
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UPLC Q-TOF/MS法研究艾叶抑制EGFR激酶的活性部位
目的 应用高通量药物筛选寻找具有EGFR激酶抑制活性的中药提取物,同时采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLCQ-TOF/MS)对其活性部位进行分析和鉴别.方法 艾叶药材经石油醚渗滤、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后,得到4个相应提取部位;采用均相时间分辨荧光法检测抑制表皮生长因子受体(EGFR)的激酶活性,于620、665 nm处测定荧光信号的变化及信号值,计算提取物对EGFR激酶的抑制率;采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱,以0.1％甲酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱,在210～400 nm扫描,使用ESI离子源,在正离子模式下采集数据.结果 艾叶的乙酸乙酯部位显示较强的EGFR激酶抑制活性,IC50 =8.848tμg·mL-1;Q-TOF/MS测定的一级、二级质谱信息及结合文献鉴定艾叶乙酸乙酯提取物中7个化合物,其中6个分别是芹菜素、棕矢车菊素、木犀草素、异泽兰黄素、β-谷甾醇、槲皮素,1个未知成分.其中棕矢车菊素、异泽兰黄素、β-谷甾醇为主要成分.结论 首次发现艾叶具有抑制EGFR的激酶活性,推测其乙酸乙酯提取物中的黄酮类和甾醇类为抑制EGFR激酶活性的主要活性成分.
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谷胱苷肽转移酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用
谷胱苷肽-S-转移酶-π(GST-π)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物抗药性的形成过程中起着重要的作用.抑制过量表达的GST-π酶的活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性,因此,GST-π被认为是一个潜在的药物作用的靶位点.为了筛选新的抗癌药物的增敏剂,我们建立了一个GST-π酶抑制剂的高通量筛选模型,该模型以CDNB和GSH为底物,在96-孔板上通过对340nm处吸光度的变化来检测样品对GST-π酶的抑制活性.经过初筛和复筛,从4800个微生物发酵提取物中筛选到10个阳性样品,阳性率为0.2%.
关键词： 谷胱苷肽转移酶抑制剂 高通量筛选 微生物发酵提取物 -
Ascofuranone增加HepG2细胞LDLR报告基因表达的生物活性的研究
以控制LDLR基因表达的调控元件SRE为靶位点,使用含有荧光素酶报告基因的转染人肝细胞系HepG2筛选模型高通量筛选微生物来源的能够增加低密度脂蛋白受体(LDLR)基因表达的具有潜在的降胆固醇作用的生物活性物质.在筛选过程中,通过对一株真菌产生的化合物ascofuranone的研究发现该化合物对测活用细胞株的LDLR荧光素酶报告基因的表达有中等强度的激活作用,其SC150为40.4μmol/L.Ascofuranone激活LDLR基因表达这一新的生物活性的发现为深入研究该化合物的降血脂作用提供了新的重要启示.
关键词： 高通量筛选 荧光素酶 基因表达 低密度脂蛋白受体 Ascofuranone -
由一株真菌产生的抑制血管细胞粘附分子-1基因表达的活性物质的研究
以血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因为靶位点,使用含有荧光素酶报告基因的转染细胞株筛选模型M-4细胞从微生物的代谢产物中高通量筛选能够抑制VCAM-1基因表达的生物活性物质,以期找到能够治疗诸如类风湿性关节炎等免疫性疾病的新型药物.在筛选过程中使用有机溶媒萃取、ODS反相柱层析、HPLC制备等方法,从真菌FO-5897的发酵液中分离到了一个对测活用细胞株的荧光素酶报告基因的表达有中等强度抑制作用的化合物,其IC50为13.8μmol/L,经各种理化性质及1H-NMR分析确定该化合物与文献报道的具有降血脂和抗癌作用的化合物Ascofuranone的结构相同.
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紫外分光光度法快速测定庆大霉素C1a含量在高通量筛选中的应用
目的 探索庆大霉素C1a含量的快速检测方法,实现诱变菌株的高通量筛选.方法 以紫外分光光度法作为检测庆大霉素C1a含量的手段,对庆大霉素C1a单组分生产菌株进行ARTP、LiCl、微波和ARTP+LiCl诱变,通过高通量筛选获得高产菌株,并在5L发酵罐中对高产稳定性菌株进行验证.结果 紫外分光光度法和高效液相色谱法对发酵液中庆大霉素C1a含量进行测定,大相对误差为3.98％;筛选获得了10株高产菌株,其中AL324菌株与出发菌株相比,摇瓶效价提高了52％;通过稳定性传代实验,获得了4株高产稳定性菌株.5L发酵罐验证实验表明AL324与出发菌株相比效价提高了81.3％.结论 紫外分光光度法可以快速检测发酵液中庆大霉素C1a含量,该方法应用于高通量筛选中,获得了高产菌株,筛选结果表明ARTP+LiCl复合诱变方法的正突变率较高,是一种有效的庆大霉素C1a高产菌株诱变方式.
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重离子束辐照诱变及高通量筛选金霉素高产菌株
应用不同剂量12C+6重离子束对金霉素链霉菌出发菌株B9-34-125进行辐照诱变,并应用96和48孔板高通量筛选金霉素高产菌株.结果表明:当重离子束12C+6离子的辐照剂量为60Gy时,对金霉素链霉菌的诱变效果显著,筛选出5株优势菌株,其中Z-1452菌株摇瓶发酵效价较对照提高14.4％,60m3发酵效价较对照提高5.7％,产量提高了2.6％.
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运用高通量筛选技术优化红霉素A发酵的合成培养基
目的 设计并优化出一种适用于红霉素发酵的合成培养基.方法 利用单因素缺失实验设计来减少培养基组分,然后利用Plackett-Burman实验设计来优化组分浓度.上述实验都是采用高通量方法进行的.结果 初选取了38种与生长和次级代谢相关的物质;然后通过2次单因素缺失实验将培养基组分减少到了19种;后通过Plackett-Burman实验对19种组分的浓度进行了进一步优化,确定各物质的浓度.5L罐发酵结果表明本研究获得的优化后合成培养基生成的红霉素A产量是采用现有文献报道合成培养基得到红霉素A产量的13.6倍.结论 高通量筛选技术是一种快速有效的筛选方法,该方法适合于优化培养基的组分.采用本论文中得到合成培养基可以对红色糖多孢菌的胞内代谢特征和红霉素A合成的关键代谢因素进行深入分析,利用这些代谢特点和影响代谢的关键因素,本文可以更加理性地对红霉素A的发酵过程进行调控,进而提高工业红霉素A产量并降低生产成本.
