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高通量药物靶位基因筛选的策略与方法
目的探讨药物靶位基因高通量筛选的策略与主要方法,为现代药物研究提供新的理念.方法以国内外有影响的杂志和有代表性的文献为依据,重点就药物靶基因在药物研发中的重要性、药物靶基因筛选的几种策略及主要方法进行分析、归纳和综述.结果与结论人类基因组计划的实施和发展,为生物研究和制药工业提供了大量的基础信息和资料,同时也催生了许多高通量筛选检测技术,给传统制药的"瓶颈"-药靶筛选提供了新的契机.
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琥珀酸半醛脱氢酶抑制剂筛选方法的建立及其在天麻成分筛选中的应用
目的：建立琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）抑制剂类抗癫痫神经系统药物筛选模型，并运用此模型对中药天麻有效成分及其类似物进行体外活性筛选和构效关系分析。方法制备琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）酶系液，并以紫外分光光度法评价 SSADH 活力与吸光度相关性；优化酶催化反应温度、反应时间、底物 NAD ＋浓度、底物琥珀酸半醛（SSA）浓度、缓冲液 pH、底物 SSADH 浓度等因素对 SSADH 活性的影响，建立 SSADH 酶系活性筛选方法；采用文献已有报道的对羟基苯甲醛（HBA）为阳性对照验证此方法可靠性，同时，对 HBA 结构类似物测定结果及作用机制进行分析。结果成功构建 SSADH 酶抑制剂活性筛选方法，HBA 测定结果与前期文献报道抗癫痫作用一致。确定 SSADH 的紫外光谱（UV）活性检测体系及其检测缓冲液配置组成，其反应条件为37℃，温孵30 min，酶活力相关吸光度在340 nm 处测量。HBA 和香草醛（Va）对 GABA-T 的构效关系一致，—OH 及苯环上的—CHO 为 SSADH 酶抑制作用必须药效团。结论该模型可应用于 SSADH 酶抑制剂的高通量筛选，也为研究中药中 SSADH 酶抑制剂类活性成分的筛选及其作用机制研究提供参考。
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hiPSC-CM在中药早期心脏毒性筛选和上市后安全性再评价中的应用展望
药物研发失败的重要原因之一是由于其心脏毒性，与单体西药相比，基于复方的中药心脏毒性评估面临着更大的挑战。人诱导多能干细胞分化的心肌细胞（hiPSC-CM）相当于幼稚型心肌细胞，而且可以无限增殖，将为生物医学带来革命性变化。通过查阅PubMed、中国知网数据库搜集相关文献，就目前基于hiPSC-CM的心脏毒性高通量药物筛选方法进行综述，并对其在创新中药研发和上市中药安全性再评价的应用潜力予以分析和展望。
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γ-氨基丁酸转氨酶抑制剂筛选方法的建立及其在天麻成分筛选中的应用
目的 建立以γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)抑制剂类抗癫痫神经系统药物筛选模型,并运用此模型对天麻有效成分及其类似物进行体外活性筛选和构效关系分析.方法 优化酶催化反应温度、反应时间、底物NAD+浓度、底物α-酮戊二酸浓度、底物γ-氨基丁酸(GABA)浓度等因素建立GABA-T酶系活性筛选模型,采用对羟基苯甲醛(HBA)及其11种结构类似物验证模型可靠性.结果 成功构建GABA-T酶系抗癫痫活性筛选模型,HBA及1 1个结构类似物测定结果与文献报道抗癫痫作用相一致,且构效分析发现-OH及苯环对位上的-CHO为必需药效团.结论 建立的模型可应用于GABA-T酶抑制剂的高通量筛选,为GABA-T酶抑制剂类抗癫痫活性成分的筛选及其作用机制研究提供参考.
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天然抗病毒药物的组合微生物转化
抗病毒药物的研发是现今药物开发的热点,也是难点.分析抗病毒药物研发的关键性困难和障碍,在生物合成药物学、天然药物的生物转化学、药物设计学、免疫学、病毒学等学科知识基础上,借鉴组合化学、组合生物催化、高通量筛选等当今较前沿的药物研发途径和技术,提出了"组合微生物转化"的研发理念和相应途径,以应用于天然抗病毒药物的研发和药理毒理改造.
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靶向细胞骨架抑制肿瘤转移新发现
据Huang FK 2015年6月17日（Nature Commu，2015，6：7465-7465.）报道，美国华人科学家利用高通量筛选的方法发现了一些小分子能够特异性靶向参与肌动蛋白组装的关键蛋白--Fascin，同时证明抑制Fascin的活性能够阻断丝状伪足形成，抑制肿瘤的迁移和侵袭。
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新药评价中遗传毒性试验方法学研究及其发展趋势
比较各国的新药遗传毒性评价方案,重点介绍Ames试验和微核试验的研究进展、遗传毒性评价的新技术和新方法(FISH技术、彗星试验等),并提出了新世纪遗传毒理学的发展趋势.
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褪黑素对阿尔兹海默病的作用及高通量筛选在其药物研发中的应用
阿尔兹海默病（AD）属进行性记忆减退、认知学习障碍和人格改变为特征的脑退行性病变。随着社会老龄化的到来， AD 也已成为临床常见病，但其确切的病因机制尚不明确，目前也无阻止病情进展的有效药物，临床上广泛使用的胆碱酯酶抑制剂也仅能轻微改善患者症状［1］。AD 疾病的进展可导致脑功能损伤，造成患者痴呆，其属于脑老化性疾病，神经内分泌功能减退是 AD 发病机制研究中的一个重要方面，其中病理生理研究发现褪黑素（MT）的缺失与 AD 的发生具有密切的相关性。松果体腺是哺乳动物分泌褪黑素的主要器官，其属于脂溶性吲哚类激素，对生物节律、免疫系统、内分泌系统和炎性反应都具有调节作用。研究表明褪黑素的特异性结合位点广泛分布于与学习记忆相关的脑区，如下丘脑和海马等，对海马突触的可塑性具有调节作用，参与记忆过程的易化作用。王琳等［2］研究发现褪黑素受体激动剂 Neu-P11与褪黑素均能增强大鼠物体识别记忆，且 Neu-P11的效应是给药时间非依赖的。随着年龄的增长，松果腺腺体发生钙化，褪黑素的分泌也逐渐减少，AD 患者存在褪黑素合成和分泌减少、分泌节律异常。近年来褪黑素及其类似物成为治疗 AD 的潜在药物被广泛研究，本文结合 AD 的发病机制对其治疗作用加以阐述。
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2型糖尿病新药发现与高通量药物筛选
随着人们对2型糖尿病发病机制的不断认识,越来越多的治疗药物被人们所发现.目前,人们通过研究还找到了许多与2型糖尿病相关的药靶基因,并把它们克隆出来,建立起药物筛选模型,结合高通量药物筛选技术实现体外筛选,为2型糖尿病的新药发现开辟了一条新道路.
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以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立
背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能.目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成.材料:人胎脑Total RNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供.方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHRl和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性.主要观察指标:通过对钙离了敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子.结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测.MCHR1细胞模型对MCH的Ecso值为173.72 nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42 nmol/L和13.6 nmol/L.而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3 nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的.MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定_了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10 g/L系统佳.结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选.
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UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制
背景:研究表明UM171可以在体外扩增造血干细胞,但作用机制尚不清楚.目的:通过高通量对接(HTDocking)筛选技术研究UM171作用的靶点,并概述其潜在的作用机制.方法:利用StemCellCKB在线计算平台,找出UM171可能的作用靶点.通过验证实验排除阴性靶点,利用表面等离子体共振(SPR)分析确定UM171和转化生长因子βRⅠ之间的相互作用.Western blot法检测UM171作用于转化生长因子β信号通路的几种重要蛋白质表达变化.结果与结论:①根据StemCellCKB计算得分,找出了UM171可能的作用靶点有转化生长因子βRⅠ等;②表面等离子体共振分析得出KD50值为62.5μmol/L,说明UM171和转化生长因子βRⅠ有较强的结合能力;③转化生长因子β信号通路中转化生长因子βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad4等主要蛋白质的表达水平显著提高;④结果提示UM171通过作用于转化生长因子β信号通路扩增脐血造血干细胞.
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热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂荧光标记探针化合物的设计合成
目的 寻找新型Hsp90抑制剂荧光标记探针化合物,用于建立高通量荧光偏振筛选模型.方法 选择高活性的小分子Hsp90抑制剂(化合物1),以氟硼二吡咯为荧光标记物质,对小分子化合物进行标记,并进行荧光偏振测试窗口测定,确定正确的标记位置.结果与结论 设计合成了两个未见文献报道的全新探针化合物,化合物结构经IR、1H-NMR、MS和HR-MS谱确证.初步测试结果表明,当mp90的浓度为50 nmol·L-1时,探针Ⅱ的测试窗口达到了96 mp,能初步满足筛选方法建立的要求,为进一步的优化筛选打下了一定的基础.
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法尼醇X受体激动剂的研究进展
法尼醇X受体(FXR)作为一种胆汁酸感受器,在体内发挥着重要作用,是治疗血脂异常和脂肪肝的重要靶点.近年来,FXR激动剂的研究由甾体类转向非甾体类化合物,人们通过高通量筛选也发现了许多结构新颖的FXR激动剂.本文对近年来FXR激动剂的研究进行综述.
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手性药物合成中酶的高通量筛选进展
目的 介绍手性药物合成中酶的高通量筛选方法的进展.方法 根据近年发表的关于手性药物合成中酶的高通量筛选文献共30篇,对其进行综述.结果 介绍了一系列的立体选择性酶筛选方法.包括化学发光和荧光法,pH指示剂法,酶偶联分析法等,这些方法都体现了高通量的原则,即快速、高效、可靠.结论 高通量筛选方法对于寻找新的酶和生物催化剂意义重大.
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头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选方法的改进
目的 改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体.方法 基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选.结果 利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85U/mg显著提高.在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度.结论 改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持.
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酶立体选择性的定向进化策略
酶立体选择性定向进化的基本方法是用合适的分子生物学手段使酶基因发生随机突变,然后进行基因表达和高通量筛选.本文主要对引入突变技术和高通量筛选方法做一简要综述.
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创新药物体外ADMET的高通量筛选技术研究进展
目前的新药研发策略已从传统的以活性为主导的筛选模式,转变为在测定药效的同时平行评价化合物的ADMET性质,并建立了系列体外ADMET高通量筛选技术.本文综述了近年来药物体外ADMET高通量筛选技术的研究进展.
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醛糖还原酶对211首糖尿病中药复方作用的筛选研究
目的 通过醛糖还原酶高通量模型对211首中药复方的筛选,寻找治疗糖尿病的科研配方.方法 从猪晶状体中提取醛糖还原酶,通过测定340 nm处光密度的下降速率,间接测定醛糖还原酶的活性的方法建立的高通量醛糖还原酶筛模型的筛选,比较211首方剂的6 630个制备样品对醛糖还原酶的抑制作用.结果 其中4首方中5组制备样品对醛糖还原酶有特异性的抑制作用.结论 中药复方应用醛糖还原酶高通量模型筛选评价,简便快捷,可以优选得到科研配方.
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复方小续命汤抗AD有效成分组研究
目的:应用高通量筛选技术方法,建立新型的中药复方活性成分和作用机理研究模式,为中药现代化研究提供新思路和新技术.方法:研究中药复方"小续命汤"240个连续组分(L1-L120,A1-A120)对β-淀粉样蛋白毒性、过氧化损伤、谷氨酸损伤的保护作用及对β-分泌酶活性的抑制作用.结果:综合评价筛选结果,发现有3部分连续组分(L1-40,A3060,A100-120)综合效果较好,这3部分重新组合作为此复方抗AD的有效成分组.结论:中药复方"小续命汤"可以通过多组分、多靶点发挥抗AD作用.高通量筛选方法将极大地推进对中药复方的研究.
关键词： 小续命汤 有效成分组 高通量筛选 阿尔茨海默病(AD) -
小续命汤有效成分组的高通量筛选研究
目的:应用高通量筛选技术,建立新型的中药复方活性成分和作用机制研究模式,探讨中药复方小续命汤发挥药理作用的物质基础.方法:观察中药复方小续命汤240个连续组分的抗氧化、抗过氧化氢损伤、抗谷氨酸损伤活性以及对神经细胞内钙离子的影响.结果:中药复方小续命汤多模型筛选结果显示,连续组分L1～L40和A100～A120的综合作用效果较好.因此,可将这两部分的连续组分重新组合,作为小续命汤抗脑缺血损伤的有效成分组.结论:中药复方小续命汤可通过多组分、多靶点途径发挥其药理作用.
