多重PCR检测食源金黄色葡萄球菌nuc、blaZ和mecA基因方法的建立与应用

目的 建立快速检测食源金黄色葡萄球菌(Sa)耐热核酸酶基因(nuc)、β-内酰胺酶基因(blaZ)和甲氧西林耐药基因(mecA)的多重PCR方法.方法 根据GenBank Sa的nuc、blaZ和mecA基因序列,设计3对特异性引物,建立鉴定Sa及分析Sa耐β-内酰胺类抗生素三重PCR方法,并对79株食源Sa进行基因检测与表型比较.结果 显示供试Sa中检出nuc、blaZ基因阳性率分别为97.47%、73.42%,mecA基因检出为阴性;nuc基因检出与其表型符合率达97.47%;而blaZ扩增结果与β-内酰胺酶试验、青霉素类敏感试验同时符合率为49.37%,前者与后两者符合率分别为60.76%和75.95%;mecA与耐甲氧西林表型符合率为100%;此次79株食源Sa中无耐甲氧西林Sa.结论 该方法简便、快捷、准确,为食源Sa鉴定和耐药性分子分析提供了参考依据.

山东半岛地区贝类中诺如病毒污染状况与病毒鉴定初报

目的 调查研究山东半岛沿海地区双壳贝类中诺如病毒污状况并对阳性株进行鉴定.方法 应用常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR,对2007年9月到2008年8月间在山东半岛沿海8个地区收集的186份双壳贝类样品进行了诺如病毒的定性和定量检测,并对阳性株核酸片段进行克隆、转化和序列分析,使用DNAStar软件进行核酸序列同源性比较,经MEGA4绘制系统进化树.结果 186份样品中检出5份诺如病毒阳性,检出率为2.67%,诺如病毒含量为大于102拷贝RNA,序列分析与遗传进化树显示5份诺如病毒阳性株均为GGII型NVs,与国内报道的GGII型毒株同源性达到98%以上.结论 山东半岛地区贝类中含有的诺如病毒以GGII型为主,冬季检出率较高.

微小隐孢子虫重组BCG疫苗免疫保护作用观察

目的 研究微小隐孢子虫重组BCG疫苗的免疫保护作用.方法 100只BALB/c小鼠随机分为4组,BCG组免疫BCG,载体组免疫含PMV262质粒的BCG(BCG-PMV262),实验组免疫rBCG-CP15/60-23(各组均为每鼠尾静脉注射0.1mL,接种物浓度均为106细菌/mL),对照组每鼠尾静脉注射0.05 mol/L pH7.2 PBS 0.1mL.免疫后,每组分别随机选6只小鼠检测其血清抗体和脾细胞培养液中的CD+4、CD+8 以及细胞因子水平,各组剩余小鼠进行攻击实验.结果 rBCG-CP15/60-23能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体水平于免疫后2周逐渐升高,与BCG组和载体组差异显著(P均<0.05);脾细胞培养液中白细胞介素2(IL-2)、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)均有不同程度的升高,实验组IFN-γ和IL-2含量与对照组和BCG组差异显著(P均<0.05),IL-12水平组间差异无统计学意义(P＞0.05).各组小鼠经隐孢子虫卵囊攻击感染后,实验组小鼠卵囊排泄数量减少40%～60%,初始排卵囊时间延长2d,卵囊持续排出时间缩短5d;组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗免疫小鼠后,能产生良好的免疫保护作用.

载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用

目的 构建小鼠巨噬细胞半乳糖特异性凝集素(GSL)靶向的RNAi质粒载体,研究其对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的沉默作用.方法 根据GSL核苷酸序列,合成3条特异性双链小干扰RNA(siRNA)分子,退火形成双链,分别连接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen Vector,转化大肠杆菌得到阳性克隆,经测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BALB/c小鼠,应用实时定量PCR和免疫组化法评价siRNA载体对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的抑制作用.结果 siRNA载体对小鼠体内GSL基因的抑制率为84-96%,对巨噬细胞GSL基因的抑制率可达61.98%～83.02%. 结论构建的siRNA载体能有效抑制目的 基因在体内外的表达, 该结果为分析半乳糖特异性凝集素在布鲁氏菌侵染过程中的功能奠定了基础.

云南大理白族带绦虫mtDNA-Cytb序列测定及分析

目的 利用分子遗传标记对采自云南大理白族地区人体带绦虫标本进行生物多态性的研究.方法 从云南大理采集人体带绦虫标本株成虫节片, 抽提虫体基因组DNA,PCR扩增线粒体DNA细胞色素B(mtDNA-Cytb)序列部分片段,测序;结合GenBank中已知猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫mtDNA-Cytb序列, 经 DNAMAN 软件处理后计算遗传距离并构建系统发育树状图.结果 大理白族带绦虫标本系统发育树显示大理(B1,B2,B5,B6)株带绦虫标本与亚洲带绦虫的遗传距离接近,距牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.大理(B3,B4)株带绦虫标本与猪带绦虫的遗传距离接近,距牛带绦虫和亚洲带绦虫标本远.结论 云南大理(B1,B2,B5,B6)株带绦虫标本属于亚洲带绦虫,而(B3,B4)株带绦虫标本属于猪带绦虫; mtDNA-Cytb序列分析可以用于带绦虫生物多态性研究.

口蹄疫病毒O型与A型编码基因的密码子使用

对于54个编码口蹄疫病毒 O型和A型多聚蛋白质编码序列密码子使用的方差分析表明,这两种血清型多聚蛋白质的密码子(GCC、GCG、AGA、CGG、GGC、GGU、CAC、CAU、AUA、AUU、CUG、CCC、AGC、UCU、ACA、ACC、ACG、ACU)使用偏性有显著区别.然而,通过对氨基酸使用偏性的分析,我们只是找出Ala、Arg、Leu、Phe、Ser在O和A型多聚蛋白质中的使用偏性有显著差异.由此我们发现,密码子的使用偏性比氨基酸使用偏性能提供更多的信息.通过对A型和O型的密码子使用整体性分析,两者密码子使用偏性的相似性可能与tRNA丰度相关的.这些密码子使用偏性的内在联系表明口蹄疫病毒 A型和O型的基因组变异所涉及到同义密码子的选择上可能存在着某种选择机制.

棘球蚴原头节细胞凋亡的观察

目的 观察棘球蚴原头节自身是否存在细胞凋亡现象.方法 采集羊肝/肺棘球蚴中自然状态原头节直接用显微镜观察形态结构.过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达.原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL 法)检测凋亡细胞.透射电镜观察原头节超微结构.结果 在自然状态的原头节中,显微镜下见到一些原头节虫体枯萎、结构模糊.这些原头节中的caspase-1、 caspase-3呈强阳性表达.TUNEL法检测显示这些原头节中凋亡细胞密布.透射电镜见到典型细胞凋亡形态改变.结论 棘球蚴原头节自身存在细胞凋亡现象.

SXI2a基因在新生和格特隐球菌交配型鉴定中的作用

目的 设计针对a交配型位点内特有的SXI2a基因的特异扩增法,评价其在鉴定新生和格特隐球菌所有主要基因型a交配型中的作用.方法 在SXI2a基因4号外显子的序列保守区设计引物SXI2aF-SXI2aR特异扩增新生和格特隐球菌a交配型,并比较其与现有的针对STE20a、Mfa或STE3a基因的特异扩增法及交配试验在鉴定新生和格特隐球菌所有主要基因型a交配型中的作用.结果 针对SXI2a基因的特异扩增法准确鉴定受试的各主要基因型a交配型菌株,而针对STE20a、Mfa或STE3a基因的特异扩增法均至少无法扩增1种以上主要基因型的a交配型.部分受试菌株不能发生交配,交配试验无法鉴定其交配型.结论 针对SXI2a基因的PCR扩增可鉴定新生和格特隐球菌各主要基因型的a交配型.SXI2aF-SXI2aR引物在快速鉴定a交配型中具有更好的通用性和特异性.

兔脑血吸虫病脑基底动脉缝隙连接蛋白Cx37 mRNA的表达及其意义

目的 通过观察兔脑血吸虫病脑血管缝隙连接(gap junction, GJ)蛋白的mRNA转录水平,探讨其在脑血吸虫病病理发生中的作用.方法 制作兔脑血吸虫病模型,应用逆转录-聚合酶链(RT-PCR)技术测定兔脑血吸虫病脑动脉缝隙连接蛋白Connexin (Cx) 37 mRNA 的表达.结果 兔脑血吸虫病脑基底动脉血管组织缝隙连接蛋白Cx 37 mRNA的表达明显高于正常兔脑基底动脉的表达.结论 兔脑血吸虫病脑基底动脉缝隙连接蛋白Cx 37 mRNA的表达增高,提示缝隙连接蛋白在血吸虫虫卵抗原及其分泌物浸润脑动脉,诱发脑血吸虫病的病理发生机制中可能起重要的作用.

我国家禽戊型肝炎病毒感染情况的调查

目的 了解我国家禽戊型肝炎病毒(HEV)感染情况.方法 自我国15个省份采集鸡和鸭血清共计1 647份,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测血清中HEV 抗原和抗体;通过Nested PCR对陕西、西藏和海南的全部血清样本及其它抗原阳性样本分别进行HEV及禽HEV核酸检测.结果 1 507份鸡血清中有54份为HEV抗体阳性,26份为HEV抗原阳性,抗原和抗体的阳性率分别为3.58%和1.73%;140份鸭血清中10份为HEV抗体阳性,2份为HEV抗原阳性,阳性率分别为7.14% 和1.43%;鸡和鸭HEV抗原、抗体阳性率无统计学差异.在鸡、鸭血清标本中没有检测到HEV RNA.结论 我国家禽存在HEV感染,但还需要进一步研究以确定感染的病毒是否为禽HEV或1-4型HEV跨种感染.

广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达

目的 对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析.方法 以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的 基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中, 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达, Ni-IDA亲和层析纯化表达产物.免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性.结果 广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13 398.26Da.重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别. 结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达.

耐环丙沙星大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性探讨

目的 探讨本地区耐环丙沙星(CIP)大肠埃希菌临床分离株对氨基糖苷类药物的耐药表型与基因型的相关性.方法 用纸片扩散法测定75株大肠埃希菌对CIP和6种氨基糖苷类药物的耐药率,PCR法检测6种氨基糖苷类修饰酶基因.结果 53株(70.67%)对CIP耐药.耐CIP菌株对庆大霉素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星的耐药率分别为:73.58%、64.15%、62.26%、50.94%、16.98%、13.21%;与非耐CIP菌株比较,庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素耐药率的差异均有统计学意义(P<0.05),多重耐药表型的差异同样具有统计学意义(P<0.05),耐CIP菌株aac(3)-II和aac(6′)-I的检出率为主(56.60%、41.51%);与非耐CIP菌株比较aac(6′)-I检出率的差异有统计学意义(P<0.05).结论 耐CIP菌株多表现为同时对多种氨基糖苷类药物耐药,提示耐CIP大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药与氨基糖苷类修饰酶存在一定相关性,尤以AAC(6′)-I为明显.

基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌

目的 建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系.方法 针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌.结果 副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线.副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测.副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL.对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同.结论 与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观.

贝氏柯克斯体抑制单核细胞的杀菌活性

目的 比较贝氏柯克斯体感染单核细胞和非感染单核细胞的蛋白谱,发现该柯克斯体感染诱导单核细胞表达蛋白.方法 用贝氏柯克斯体I相毒株感染人单核细胞(THP-1),采用等电聚焦和SDS-PAGE双向电泳对感染单核细胞和非感染单核细胞同时做蛋白分离,用专业电泳图谱分析软件发现它们之间的差异表达蛋白,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪鉴定差异表达蛋白.结果 质谱分析鉴定97个差异表达蛋白,经蛋白氨基酸序列数据库检索和生物信息学分析发现其中15个差异表达蛋白参与调节单核细胞的吞噬、杀菌、细胞凋亡等.结论 贝氏柯克斯体侵入单核细胞诱导细胞某些蛋白分子差异表达,增强柯克斯体细胞内入侵、抑制单核细胞的杀菌活性和细胞凋亡,促进贝氏柯克斯体在细胞内生存.

首次从我国大绒鼠中检测到类似Tula样汉坦病毒

目的 了解云南省鼠类携带汉坦病毒情况及其分子特征.方法 在居民区和野外捕鼠,用直接免疫荧光试验检测鼠肺中汉坦病毒抗原,阳性鼠肺用RT-PCR法扩增汉坦病毒汉滩型和汉城型的S基因片段,并进行核苷酸序列测定和分析.结果 2006年9-10月在云南省泸西县共捕获鼠类4属6种267只,其中居民区146只,优势鼠种为黄胸鼠;野外121只,优势种为大绒鼠.居民区鼠类汉坦病毒带病毒率为0.85%(1/117),阳性鼠为黄胸鼠;野外鼠类汉坦病毒带病毒率为6.67%(6/90),阳性鼠为大绒鼠和高山姬鼠.对7份阳性鼠肺作RT-PCR扩增,结果从来自大绒鼠的LX378标本中检测到汉滩型病毒S片段核酸,其序列分析结果显示与Tula汉坦病毒Koziky/5276Ma/94株(AJ223601)核苷酸和氨基酸同源性高,分别为81%、89.8%,而与汉滩型76-118株、汉城型L99株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为73.9%(80.9%)、74.4%(77.9%).结论 首次从我国大绒鼠中检测到类似Tula样汉坦病毒的核酸序列,有关该类汉坦病毒在云南的分布、宿主动物和致病性以及全基因序列特征尚需进一步研究.

优化密码子以提高狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞的表达

目的 探讨提高狂犬病病毒(RV)HEP-Flury株糖蛋白(GP)基因在原核细胞中表达的水平和与抗体的反应水平.方法 以RV HEP-Flury株的全长质粒为模板,采用PCR方法扩增获得去除信号肽基因的GP(G1)、GP的膜外区基因(G2).选取膜外区基因中抗原表位富集区基因,对氨基酸密码子进行修饰并合成其序列(G3).分别将G1、G2及G3基因亚克隆到表达载体pET32a(+),构建融合表达质粒pET32a-G1、pET32a-G2及pET32a-G3,转化表达宿主菌BL21,并利用IPTG诱导表达.经SDS-PAGE,Western-blotting和薄层扫描分析,比较重组蛋白的表达量.结果 G3基因的表达量比G1、G2基因明显提高.结论 通过密码子优化,能显著提高G基因在原核细胞中的表达水平.

HLA-DRB1基因多态性与新疆维吾尔族人群结核病易感性的相关性研究

目的 探讨人类白细胞抗原(HLA)-DRB1基因多态性与新疆维吾尔族人群结核病易感性的关联.方法 采用病例-对照方法,应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对226例新疆维吾尔族肺结核病患者(肺结核病例组)和当地同族231人健康者进行HLA-DRB1基因分型,比较其等位基因频率(GF),并计算其比值比(OR).结果 肺结核病例组中HLA-DRB1*11基因频率显著高于健康对照组,两组的GF分别为4.53%和1.09%,差异有统计学意义(OR=4.388,χ2=9.872,Pc=0.026＜0.05); 肺结核病例组中HLA-DRB1*04基因频率亦显著高于健康对照组,两组的GF分别为12.77%和8.36%,但P值经过校正后差异无统计学意义(Pc>0.05).结论 HLA-DRB1*11等位基因与新疆维吾尔族人群结核病呈相关性.

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的 构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台.方法 用RT-PCR 方法扩增出EV71 FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR 载体中,获得全长cDNA 克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25.应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞.通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定.结果 RNA转染后72 h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆.结论 本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具.

结核分枝杆菌分子分型技术研究进展

自从1882年科赫发现结核病由结核分枝杆菌感染引起以来,结核病一直是人类想要攻克的传染病之一.但是,经过百年来人们的努力,结核病仍然是影响人类健康的重要传染病之一.

免疫信息学在抗原虫病疫苗研发中的应用进展

进入新世纪以来,原虫的基因组计划取得了很大的进展.其中,恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)[1]、约氏疟原虫(P. yoelii yoelii)[2]、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)[3]和人隐孢子虫(C. hominis)[4]、硕大利什曼原虫(Leishmania major)[5]、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)[6]、布氏锥虫(T. brucei)[7]、小泰勒虫(Theileria parva)[8]、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(http://www.ToxoTDB.org)的全基因组序列已经发表;其他一些原虫的全基因组序列正在测定和注解中,并已获得大量的EST.

非结核分枝杆菌病的流行趋势、诊断及治疗

分枝杆菌属除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌) 和麻风分枝杆菌外统称为非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria ,NTM).

广西鼠疫流行情况及相关研究进展

鼠疫是一种烈性传染病,也是一种自然疫源性疾病,它的发生和流行会造成严重的危害,关系到社会稳定、经济发展和人民生命健康.1955年我国将其列为甲类传染病之首进行管理.

感染人类的第五种疟原虫-猴诺氏疟原虫

猴诺氏疟原虫(Plasmodium Knowlesi)目前被公认是感染人类的第五种疟原虫,研究结果表明该猴疟不仅在自然的猴群中通过传疟按蚊相互传染,也可以通过传疟按蚊传染给人类,造成人-人和人-猴之间的传播[1],人类同样也可以通过血液进行传染.

朊蛋白同源蛋白Doppel的分子生物学研究进展

朊病毒病又称可传播性海绵状脑病(Transmission spongiform encephalopathy,TSE),是一组累及人类及多种动物中枢神经系统的退行性疾病,致死率可达100%,如人类的克雅氏病(CJD),动物的疯牛病(BSE)等[1].

云南西部边境地区健康人群登革热血清学调查

目的 了解云南西部边境地区健康人群登革热抗体水平状况,为制定有效登革热防治对策提供依据.方法 在具有登革热本地感染病例的不同地区采集健康人群血清,并采用间接酶联免疫吸附试验分别检测登革病毒IgG和IgM 抗体.结果 采集的740份中国籍血清标本登革病毒IgG和IgM抗体阳性率分别为10.9%(81/740)和5.7%(42/740),两种抗体同为阳性的阳性率为0.81%(6/740);缅甸籍学生这两种登革抗体阳性率分别为12.5%(13/104)和2.9%(3/104).登革IgG/IgM抗体阳性率在不同年龄组、性别、民族、不同国籍学生中的分布无统计学差异(P>0.05);务农人群IgG抗体阳性率高于非农人群(P<0.05);盈江县IgG抗体阳性率较高.结论 云南省边境地区人群广泛存在登革病毒的既往和新近隐性感染,建议加强对边境口岸和边境地区的登革热疫情监测,开展登革热防治知识的宣传和提高当地医疗机构的诊疗水平.

儿童猫抓病6例

猫抓病是因接触猫而发生的急性传染病.1950年先有描述,青少年及儿童是猫抓病的好发年龄.临床表现为皮肤损伤和局部淋巴结肿大.我院外科近2年来收治颈部、腋下、上肢等浅表部位出现的肿块及不明原因的浅表淋巴结肿大80余例,其中有6例经手术后病理明确为猫抓病.

鄱阳湖区血吸虫病患者感染状态的超声显像变化

B超影像是一种快速、简便、无损伤性诊断血吸虫病的影像学检查方法,广泛应用于日本血吸虫病的临床诊断、流行病学调查,以及血吸虫病疫区疾病监测等[1].本文报道了血吸虫病疫区居民感染血吸虫病后肝脾损害状况及病程不同时期血吸虫感染程度对脏器的影响.

美国《Emerging Infectious Diseases》2010年第3期有关人兽共患病论文摘译