大鼠LC3B荧光融合表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用
摘要: 目的 构建三种rLC3B融合表达载体,探究其在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用.方法 采用PCR扩增大鼠LC3B基因序列,克隆至pEGFP-C1和pmCherry-C1,分别构建pEGFP-rLC3B和pmCherry-rLC3B融合表达载体;随后以pEG-FP-rLC3B为模板经PCR得到EGFP-rLC3B序列,克隆至pmCherry-C 1并构建pmCherry-EGFP-rLC3B融合表达载体.将上述三种质粒转染至U-2OS细胞后,采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,通过激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成.采用Western blot检测Rapamycin、Chloroquine和Baf-A1作用下的内源性LC3B和外源性EGFP-rLC3B、mCherry-rLC3B及mCherry-EGFP-rLC3B,验证外源性rLC3B的正确表达和自噬检测功能;采用Western blot检测游离EGFP表达,从而精确检测细胞内的自噬性降解水平.结果 经酶切鉴定和测序验证:成功构建三种融合表达载体.采用饥饿和Rapamycin激活自噬,或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬,并在激光共聚焦显微镜下观察到明显的自噬体或自噬溶酶体.Western blot同时检测到内源LC3B和外源rLC3B的表达,并且游离EGFP蛋白的表达随着饥饿时间增加而明显上调,12h组比对照组增加1.05倍,24 h组比对照组增加1.56倍,显示自噬性降解水平升高.结论 EGFP-rLC3B载体可检测自噬体的形成和反应细胞内的自噬性降解水平;mCherry-rLC3B载体可同时显示自噬体和自噬溶酶体,但不能区分这两者;mCherry-EGFP-rLC3B载体可同时显示和区分自噬体和自噬溶酶体,是检测自噬流的佳方法.
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单节段Discover人工颈椎间盘置换术对颈椎矢状面曲度的影响
目的 评估单节段Discover人工颈椎间盘置换术对颈椎矢状面曲度的影响.方法 对2012年2月至2014年9月行单节段Discover人工颈椎间盘置换术的62例患者进行回顾性分析,男34例,女28例;年龄31~61岁,平均(45.2±8.2)岁.均为单节段颈椎间盘突出症,包括C3-4椎间盘突出3例,C4-5椎间盘突出12例,C5-6椎间盘突出34例,C6-7椎间盘突出13例.测量术前与术后3个月颈椎中立侧位X线片上手术节段椎间盘角、脊柱功能单位(functional spinal unit,FSU)角、C2~C7角、椎间盘前缘高度、椎间盘中央高度、椎间盘后缘高度、FSU前缘高度、FSU中央高度、FSU后缘高度,分析手术前后的变化情况.结果 全部病例获得随访,随访时间3个月.与术前相比,术后3个月椎间盘角由0.0°±4.2°增加至7.3°±3.9°、FSU角由2.3°±5.0°增加至6.9°±4.8°、C2~C7角由9.5°±10.8°增加至13.1°±9.1°、椎间盘前缘高度由(4.3±1.0) mm增加至(7.9±1.1)mm、椎间盘中央高度由(5.8±0.9) mm增加至(8.1±0.9)mm、椎间盘后缘高度由(3.7±0.9)mm增加至(5.5±0.9)mm、FSU前缘高度由(34.1±3.5) mm增加至(36.2±3.4) mm、FSU中央高度由(32.3±3.5) mm增加至(33.6±3.3) mm、FSU后缘高度由(33.9±3.5)mm增加至(34.6±3.2) mm,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 单节段Discover人工颈椎间盘置换术能够早期改善椎间盘角及FSU角、增加椎间隙高度,从而在一定程度上恢复颈椎的矢状面曲度.
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球形探针技术在椎弓根螺钉置钉术中的应用
目的 通过与传统徒手置钉术的比较,评价一种新的椎弓根螺钉置钉技术,即应用椎弓根球形探针系统置入椎弓根螺钉的准确率.方法 自2009年5月至2010年6月,对脊柱侧凸、腰椎滑脱、脊柱骨折等疾病需行颈胸腰椎椎弓根钉内固定的患者,术中应用椎弓根球形探针置入椎弓根螺钉.该探针为医用不锈钢制成,包括一个球端、杆和柄,金属球端的直径分别有1.5、2.5、3.0、3.5 mm四种,其中直径1.5mm的探针具有较强的硬度和一定的弹性.球形探针技术要点:按标准椎弓根螺钉进钉点定位,高速磨钻去除皮质骨,将椎弓根球形探针按直径从小到大依次缓慢敲入椎弓根内直至达到椎体前方骨皮质.术后采用CT扫描评价椎弓根螺钉钉道情况.并与采用传统徒手技术的病例资料进行对比.结果 采用球形探针技术共置入312枚椎弓根螺钉,传统徒手技术置入276枚.术后CT扫描显示球形探针技术组颈椎、胸椎、腰椎椎弓根螺钉钉道准确率为100%,无一例穿出椎弓根骨皮质.传统徒手技术组准确率为78%,共有61枚螺钉(22%)位置不良,23枚(8.3%)穿透椎弓根内侧骨皮质,38枚(13.7%)穿透外侧骨皮质.两组置钉准确率的差异具有统计学意义.所有患者术中和术后均未出现神经、血管和内脏损伤等并发症.结论 与传统徒手置钉技术相比,椎弓根球形探针置钉技术,可准确地置入椎弓根钉,避免因螺钉误置所导致的术后并发症.
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可动式椎间盘镜下单侧开窗双侧减压椎体间融合术治疗复杂的腰椎管狭窄症
目的 探讨可动式椎间盘镜(mobile microendoscopic discectomy,MMED)下单侧开窗双侧减压椎体间融合术治疗复杂腰椎管狭窄症的疗效.方法 2013年3月至2014年9月采用MMED下单侧开窗双侧减压椎体间融合术治疗复杂的腰椎管狭窄症患者68例,男39例,女29例;年龄56~76,平均67岁.49例伴退行性滑脱,19例伴退行性侧凸.责任节段包括L4,5 57例,L5S1 6例,L3~L5 4例,L4~S1 1例.患者均有腰腿痛和间歇性跛行症状,术前Oswestry功能障碍指数(Oswestry disability index,ODI)为43.8%±10.4%,疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale,VAS)腰痛(6.3±3.3)分、腿痛(6.1±3.8)分.在症状严重侧行纵行切口,放置MMED,用磨钻扩大开窗,沿神经根通道减压,摘除椎间盘,充分刮除终板软骨,处理椎间隙;潜行咬除对侧黄韧带,松解对侧神经根;退出内套管,直视下试模撑开椎间隙,用自体骨与异体骨混合植骨,放置cage,移除外套管.透视下经椎弓根穿刺,放置空心椎弓根螺钉,仍有滑脱者预设复位距离,经皮插入连接棒复位固定.结果 1例术中转开放手术,所有病例均未发生神经损伤.手术时间100~180 min,平均120 min;术中出血50~200 ml,平均100 ml.术后影像学检查示脊柱序列改善,减压充分,合并滑脱者滑脱比由术前17.9±6.2降低至11.8±4.8.61例患者随访12~24个月,其他7例随访6~9个月.末次随访时ODI降低至8.9%±7.4%,VAS评分下降至腰痛(1.2±1.1)分、腿痛(0.9±0.9)分,MacNab法疗效评定结果为优41例、良25例、可2例.结论 MMED下单侧开窗双侧减压椎体间融合术治疗复杂的腰椎管狭窄症能明显缓解症状、改善脊柱功能,术后近期疗效良好.
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后路枕骨髁螺钉置钉参数对安全性的影响
目的 探讨国人后路枕骨髁螺钉进钉点竖直方向位置对置钉安全性的影响,分析后路枕骨髁螺钉术中以置钉安全性为目的的进钉点选择策略.方法 回顾性分析2013年9月至2015年9月60例健康成年国人上颈椎的影像资料,其中男36例,女24例;年龄25~58岁,平均(41.6±9.2)岁.排除枕颈区域损伤、肿瘤和畸形患者,利用CT扫描的Dicom数据在Mimics中进行三维数字化建模并模拟置钉,以枕骨髁后方内外侧中点为进钉点,竖直方向间隔采点,各进钉点分别以大头倾角、小头倾角、长钉道、小钉道四种状态置入直径3.5 mm虚拟螺钉,通过三维视窗评估螺钉与舌下神经管、寰枕关节等解剖结构关系,在3-Matic软件中测量螺钉头倾角、内倾角、钉道长度,计算得到头倾角安全范围、置钉成功率.结果 60例通过Mimics建模总计得到120侧枕骨髁,左右侧别的头倾角、内倾角、安全范围和长度数据差异均无统计学意义,各进钉点头倾角安全范围:下进钉点20.9°±6.0°,中进钉点17.0°±6.2°,上进钉点11.6°±7.1°,差异有统计学意义;各进钉点不同头倾角置钉成功率:下进钉点以3°和4°头倾角进钉成功率高99.17%,中进钉点以3°头倾角进钉成功率高96.67%,上进钉点以0°头倾角置钉成功率高74.17%,中、下进钉点置钉成功率较上进钉点显著提高,差异有统计学意义;螺钉内倾角参数:左侧为34.41°±2.59°,右侧为34.06°±2.44°,差异无统计学意义;获得各进钉点长钉道长度参数:上进钉点(23.09±1.47) mm、中进钉点(22.84±1.40) mm、下进钉点(23.15±1.45) mm,各进钉点短钉道平均值约21 mm,进钉点之间差异无统计学意义.结论 后路枕骨髁螺钉进钉点的选择中,下进钉点较上方进钉点拥有更高的置钉成功率和安全性;进钉点在竖直方向上的改变对钉道长度影响较小;通过三维数字化虚拟置钉能模拟后路枕骨髁螺钉置入钉道,评估置钉安全性,减少后路枕骨髁螺钉置入风险.
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改良邻指矩形皮瓣修复手指末节套状撕脱皮肤缺损
目的 探讨改良切取指动脉背侧支供血的邻指超比例矩形皮瓣修复手指末节套状撕脱皮肤缺损的手术方法及临床疗效.方法 2006年1月至2010年3月,收治26例(26指)手指末节套状撕脱皮肤缺损患者,男21例(21指),女5例(5指);年龄17~56岁,平均31.6岁;机器绞伤14例,挤压伤8例,绳索绞勒伤4例.其中示指8例,中指9例,环指4例,小指5例.脱套手指末节长度为1.1~2.6cm.应用指动脉背侧支供血的邻指超比例矩形皮瓣修复,皮瓣切取范围3.6 cm×2.3 cm~6.5 cm×3.2 cm.供区全厚皮片游离移植.结果 术后13~23 d断蒂,26例皮瓣全部成活,皮瓣及供区植皮伤口均一期愈合.术后25例获得随访,随访时间6~28个月,平均16.3个月.皮瓣质地柔软,外观饱满.两点辨别觉为6~9 mm,平均7.8 mm.无一例外观表现臃肿及发生指端触痛等并发症.手功能按手指总主动活动度(total active movement,TAM)法评定,优17例,良7例,可1例,优良率为96%.结论 改良切取指动脉背侧支供血的邻指超比例矩形皮瓣修复手指末节套状撕脱皮肤缺损的方法操作简单,皮瓣成活率高,术后手指功能恢复满意,皮瓣外观及感觉恢复良好,可用于修复2~5指末节套状撕脱皮肤缺损.
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青少年颈椎长节段严重后凸畸形手术方案的个体化选择
目的 探讨青少年期(10~19岁)严重非创伤性、非炎症性颈椎长节段后凸畸形的个体化手术治疗方案.方法 回顾性总结分析2000年7月至2007年7月收治的12例年龄在12~19岁的颈椎长节段严重后凸畸形患者的临床资料和手术治疗过程及治疗效果.分析12例患者的影像学资料发现其共同点为:(1)后凸的顶椎位于C4或C5;(2)后凸弧内的椎体均前低后高呈楔形变及椎间隙明显变窄;(3)MRI显示与顶椎相对应的椎管均有不同程度的狭窄和硬膜囊受压.以下几种情况为不同病例的个体化特点:(1)合并C1.2旋转半脱位者2例;(2)合并C2半脱位2例;(3)C4~C7椎体严重营养不良2例;(4)C2~C5椎体严重营养不良1例;(5)C6.7椎间隙向前喇叭口样张开2例.结果 根据对每个病例特点的具体分析采用针对性的手术入路.前方入路2例,后方入路2例,后方入路联合前方入路7例,一期前-后-前入路1例.后凸Cobb角由手术前平均73°矫正至平均15°.随访3个月~6年,1例在融合固定的下端发生新的成角和节段性不稳,其余11例矫正度无明显丢失.3例瘫痪者均恢复正常神经功能.结论 对不同病因、不同畸形程度和不同继发性病理改变的青少年颈椎后凸畸形患者应采用合理的个体化的手术治疗方案才能有效地矫正畸形和解除脊髓压迫.
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微创腰椎间盘分流术治疗椎间盘源性腰痛
目的:探讨微创腰椎间盘分流术治疗椎间盘源性腰痛的作用机制并分析其近期临床疗效。方法通过体外实验测定尼龙线分流虹吸管作用的距离;动物椎间盘内置入尼龙线,其尾端埋于肌肉中,组织学检查尼龙线的生物相容性。15例经椎间盘造影诊断为椎间盘源性腰痛,局麻下行腰椎间盘分流术(应用特别设计的工具将尼龙线置入腰椎间盘内),L3-41例、L4-56例、L5S17例、L3-4合并L4-51例。术后1周、3、12和24个月采用疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale, VAS)、Oswestry功能障碍指数(Oswestry disability index,ODI)和影像学检查综合评估临床疗效。结果体外实验显示通过尼龙线可将乳酸溶液的pH值从低于4.0调高至7.14;体内实验表明绵羊椎间盘置入尼龙线后,椎间盘内蛋白多糖的含量随着时间推移逐渐增加,且尼龙线周围无炎症反应。所有患者均成功施行腰椎间盘分流术,无手术并发症。术后2年随访,患者VAS评分与ODI评分均有明显下降,VAS改善率达79.16%±12.33%,ODI改善率为77.42%±12.20%;X线片示术后2年椎间盘高度指数与术前相比,差异无统计学意义;MRI示根据改良Thompson分级,分流椎间盘的退变程度无加重,10例患者髓核信号有一定程度的增强。结论经皮腰椎间盘分流术能够明显缓解腰痛,改善腰背部功能,具有创伤小,风险低的优点,有望成为临床治疗椎间盘源性腰痛一种新的微创手术方式。
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关节置换术后感染非组配式广泛涂层股骨柄二期翻修术的中期疗效
目的 探讨应用非组配式广泛涂层股骨柄行关节置换术后感染二期翻修术的中期疗效.方法 回顾性分析2005年3月至2006年12月接受全髋关节置换术后感染二期翻修的33例(33髋)患者的病例资料,男20例,女13例;年龄52~80岁,平均(66.1±7.2)岁.二期翻修方案包括一期取出关节假体,彻底清创,置入自制抗生素骨水泥间隔体,抗感染治疗后行二期关节翻修术.抗感染治疗包括静脉抗感染治疗4周、口服抗生素6周.采用美国骨科医师学会(American Academy of Orthopaedic Surgeons,AAOS)分类法评估髋臼骨缺损,Paprosky分类法评估股骨骨缺损.采用Harris髋关节评分评估髋关节功能,术后定期复查X线片评估假体稳定性、移位、松动情况.根据DeLee和Charnley分区法记录髋臼假体周围透光线,根据Gruen分区法记录股骨柄周围透光线.采用Engh等标准评价股骨假体固定情况.再感染的标准与诊断关节感染的标准相同.结果 全部病例随访5~9年,平均(6.1±1.7)年.二期翻修术后无一例出现感染或假体松动.二期翻修术中所取标本微生物培养或病理学检查均为阴性.Harris髋关节评分由术前(42.3±6.5)分提高到末次随访的(89.1±8.5)分.股骨柄骨长入固定30例,纤维稳定固定3例.11例髋臼侧打压植骨和所有股骨髓腔内打压植骨均与宿主骨融合.股骨侧异体皮质骨板移植者10例,9例于二期翻修术后1年与宿主骨融合、1例于术后2年融合.结论 采用非组配式广泛涂层股骨假体行感染二期翻修结合髓腔内颗粒骨打压植骨能取得较好的假体中期生存率和感染清除率.
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国产膝关节表面假体的临床应用初步报告
目的 比较国产T-free膝关节假体与同类进口假体膝关节置换的早期疗效.方法 2008年7月至2009年12月采用国产T-free膝关节表面假体施行膝关节置换25例35膝,单侧15例、双侧10例;屈曲挛缩19例25膝、内翻畸形11例18膝、外翻畸形4例5膝.膝关节活动度75.11°±27.68°,美国膝关节协会评分系统(Knee Society Score,KSS)膝评分(17.88±14.37)分,KSS功能评分(21.62±21.27)分.同期同一术者施行的同类进口膝关节假体置换27例39膝做为对照进行回顾性研究.两组患者年龄、体重指数、随访时间、术前膝关节活动度的差异无统计学意义;术前KSS膝评分及KSS功能评分的差异有统计学意义.结果 国产假体组24例平均随访(14.92±8.32)个月,与进口假体组26例(15.42±9.87)个月的差异无统计学意义.末次随访时国产假体组的膝关节活动度平均107.53°±18.32°,与进口假体组112.84°±9.76°的差异无统计学意义;KSS膝评分平均(86.71±9.78)分,与进口假体组(86.68±6.01)分的差异无统计学意义;KSS功能评分平均(65.88±25.01)分,与进口假体组(71.35±16.74)分的差异无统计学意义.国产假体组患者的满意率为95.8%(23/24).结论 国产T-free膝关节表面假体与同类进口产品的近期疗效相当.
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关节镜下可吸收交叉钉固定腘绳肌腱重建前十字韧带
目的 介绍在关节镜下腘绳肌腱移植重建前十字韧带并利用可吸收交叉钉固定的方法,探讨其临床效果.方法 2005年3月至2006年3月,共治疗31例前十字韧带断裂患者.男18例,女13例;年龄19~51岁,平均34岁.致伤原因:交通伤15例,日常生活及运动损伤16例.病程为5 d~36个月.合并半月板损伤12例,合并内侧副韧带Ⅰ、Ⅱ度损伤6例,Ⅲ度损伤3例,均为新鲜损伤.合并后十字韧带断裂6例.术后随访12~24个月,平均16.8个月,观察此固定方法的可靠性和疗效.以Lyscholm评分和KT-2000评价手术前后膝关节功能及稳定性.结果 26例患者获得随访,所有患者均无伸膝受限,膝关节屈曲活动度均>120°.屈膝90°时前抽屉试验均阴性;Lachman试验强阳性1例,阳性4例,阴性21例;膝关节功能Lyscholm评分为(94.6±4.2)分.KT-2000检查结果:25例双膝差距为0~4.0 mm,平均2.4 mm,1例患者关节不稳定,双膝差距5.5 mm.结论 可吸收交叉钉固定可为关节镜下腘绳肌腱移植重建前十字韧带提供早期的初始稳定性和后期的生物稳定性,是一种可靠的固定方法.