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高脂血症中人脐静脉内皮细胞HSP 22的表达
目的：观察高脂环境热休克蛋白22（HSP22）基因真核过表达载体pEGFP-N1转染对人脐静脉内皮细胞HSP22表达水平的影响。
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SmD1重组蛋白及抗原表位肽段在系统性红斑狼疮中的临床意义
系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病.抗Sm抗体由于其在SLE诊断中具有高度特异性被认为是疾病的标志性抗体.目前研究认为,SmD1是其中主要的抗原分子.本研究通过构建表达载体进行重组SmD1蛋白的表达和纯化的方法获取纯度较高的抗原,并通过生物学软件设计并化学合成SmD1抗原表位肽段,用ELISA法分别检测其在SLE中的临床意义.
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血管内皮细胞生长因子表达质粒的构建及其促进烫伤愈合的研究
构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达质粒,并观察其表达产物对小型猪深度烫伤创面影响.采用PCR技术和DNA重组技术,从胎肝细胞内将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pQE-40上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.同时通过SDS-PAGE和western blot方法对其表达产物进行特异性鉴定.猪小面积深Ⅱ度烫伤后,立即将含有1.5μg/g VEGF的表达产物制成的膏剂均匀涂于创面,每个创面200mg膏剂,隔日换药一次,至伤后14d.用透明膜描记称量法记录创面面积,并取创面组织作组织学和免疫组化检测.克隆出的VEGF基因cDNA片段由380bp组成,包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分.重组表达质粒pQE-VEGF在M15细菌体内能够表达.小型猪烫伤后7d,VEGF处理的伤口处肉芽组织增生明显,毛细血管数量增多.烫伤14d后,M15处理组的创面仍未愈合,VEGF组的创面可见连续的上皮覆盖,CD34阳性细胞率与M15处理组相比明显升高,两者差异显著(P＜0.01).构建的VEGF表达载体可以编码VEGF121蛋白,其表达产物能够诱导肉芽组织生长,刺激血管内皮细胞增殖,加速新生血管形成,促进创面愈合.
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转染HGF基因对肝细胞的生物学效应
目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因对肝细胞生长增殖能力的影响.方法通过脂质体介导法,将HGF基因导入肝细胞中.用荧光显微镜以及原位杂交观察到HGF基因表达.采用检测细胞生长曲线、Ki-67蛋白和嗜银蛋白免疫组化观察肝细胞生长增殖能力及DNA合成能力的变化.结果荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达,用原位杂交方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达.细胞生长曲线显示,转染HGF基因的肝细胞增殖速度明显增快,Ki-67蛋白和嗜银蛋白表达明显增多,提示转导HGF基因使肝细胞增殖活性增加.结论本实验显示转染的HGF可表达并有促细胞分裂活性.为进一步了解HGF分子生物学特性及治疗应用提供了理论基础.
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可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建
目的构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体,检测该调控元件的特异性和可调控性.方法 PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-1的多克隆位点连接,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体(pEGFP-1-EP).用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用.结果成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP-1的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达,1×10-7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制.结论 AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础.
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转染反义DcR3真核表达载体协同氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡
目的研究DcR3反义mRNA与氟尿嘧啶对肝癌细胞的影响.方法用MTT、TUNEL、流式细胞术分别检测反义重组体组、氟尿嘧啶处理组、协同作用组对肝癌细胞株SMMC7721的影响.结果协同作用组促凋亡作用明显强于其余二组.结论PVAXⅠ-as-DcR3与氟尿嘧啶协同作用可使在氟尿嘧啶浓度降低的同时保持较强的促肝癌细胞凋亡作用.
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RNAi表达载体对前列腺癌细胞CXCR4基因表达的抑制作用
趋化因子CXC受体4及其配体基质细胞衍生因子1(SDF-1)相互构成的反应轴与肿瘤的恶性表现密切相关[1].它们不仅在肿瘤细胞的迁移过程中起着一定作用,而且与肿瘤细胞发生、增殖和分化等有密切关系,并可能成为肿瘤基因治疗中的一个新靶点.我们利用可在细胞内自主生成siRNA的表达质粒转染激素依赖性和非依赖性人前列腺癌细胞株LNCaP和PC-3m,观察其对CXCR4 mRNA及蛋白表达的影响.
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HBxAg蛋白反式激活基因5的生物信息学分析及真核表达载体的构建
目的 对HBxAg蛋白反式激活基因5(XTP5)进行生物信息学分析,并构建其真核表达载体.方法 利用生物信息学软件对XTP5基因进行CpG岛、启动子活性、转录终止信号和氨基酸的一、二级结构以及信号肽、跨膜特性和功能基序进行预测.构建XTP5基因的真核表达载体pcDNA3.1-XTP5和pGBKT7-XTP5.结果 生物信息学分析发现XTP5基因有200 bp左右的CpG岛,有高启动子活性序列、转录终止信号位点,二级结构以Helix为主,存在信号肽的概率为0.0000A,无跨膜区域信号,存在数个功能基序.成功构建了XTP5基因的真核表达载体pcDNA3.1-XTP5和pGBKT7-XTP5.结论 为深人研究XTP5结构和功能、进一步探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)发病机制创造了条件.
关键词： 乙型肝炎病毒X蛋白 XTP5基因 次要组织相容性抗原基因 生物信息学 表达载体 -
SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测
目的：构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc（SLC-HP-Fc）的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc ，经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183中进行同源重组，得到重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞，通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc ，成功转染293细胞出现细胞病变反应，经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体，并建立了重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库，为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。
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15-羟基前列腺素脱氢酶基因转染抑制鼠胃癌细胞MFC增殖的观察
目的:构建pcDNA3.1/15-PGDH(15-羟基前列腺素脱氢酶)真核表达载体,并转染鼠胃癌细胞MFC,观察15-PGDH对MFC细胞增殖的影响.方法:通过基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1/15-PGDH,转染胃癌细胞MFC,建立稳定转染细胞株,RT-PCR检测转染细胞中15-PGDH基因的表达情况；MTT法测A值,绘制细胞生长曲线；克隆形成实验分析15-PGDH对胃癌细胞增殖能力的影响.结果:15-PGDH基因转染成功,转染后鼠胃癌MFC/15-PG-DH细胞中15-PGDH基因的相对表达量为1.06±0.08,明显高于空质粒转染组的0.22±0.01及未转染细胞组的0.21±0.01,差异有统计学意义,P＜0.01.且基因转染后细胞生长明显受到抑制,MTT结果显示,细胞生长至第4、6、8天,15-PGDH基因转染组细胞的A值均较低,分别为1.173±0.072、1.405±0.040和1.689±0.116,与空质粒转染组细胞的1.452±0.062、1.955±0.098和2.755±0.324相比,差异有统计学意义；与未转染MFC细胞的1.534±0.082、1.972±0.073和2.477±0.319相比,差异亦有统计学意义,P值均＜0.05.15-PGDH基因转染细胞组克隆形成率为18％,与未转染细胞组63％及空质粒转染细胞组59％相比,克隆形成明显受到抑制,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:15-PGDH基因转染可显著抑制鼠胃癌MFC细胞的增殖和克隆形成能力.
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针对核干细胞因子腺病毒干扰载体构建与干扰作用观察
目的 构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用.方法 根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650 bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒.实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组.不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR (QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平.计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化.结果 靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建.蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势.P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P＜0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P＜0.001.P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P＜0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P＜0.001.细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006.表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过.结论 成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础.
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miR-34a稳定表达株构建及其对宫颈癌Caski细胞功能影响的观察
目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并研究其对宫颈癌细胞株Caski细胞活性的影响.方法:以人正常组织基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到miR-34a的前体序列,构建miR-34a真核表达载体pEGFP-C1-miR34a.同时用重组载体pEGFP-C1-miR34a转染宫颈癌细胞株Caski细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系作为实验组,pEGFP-C1转染组为对照组(Control),用RT-PCR及Real time RT-RCR法鉴定miR-34a在克隆细胞中的表达,并用MTT、FCM分析miR-34a的生物学特性,RT-PCR研究检测其靶基因表达改变.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pEGFP-C1-miR34a,并在宫颈癌Caski细胞中上调miR-34a的表达,实验组miR-34a的表达相对于对照组升高约3.13倍；MTT提示,实验组miR 34a能够显著的抑制Caski细胞增殖,差异有统计学意义,P=0.018;实验组G0/G1期百分率为77.7％,与对照组的50％比较,差异有统计学意义,P=0.004;而实验组S期百分率为20.3％,对照组为35.4％,两组比较差异有统计学意义,P=0.027；实验组细胞miR-34a靶基因细胞周期基因CDK4、CDK6、Cyclin E2和E2F1 mRNA的表达下调,与对照组比较差异有统计学意义,P=0.002.结论:成功构建人miR-34a的真核表达载体,并能显著抑制宫颈癌细胞株Caski细胞活性,为进一步研究miR-34a在宫颈癌中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.
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HCV C区、E1区基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-CE1的构建、鉴定及表达
用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV CE1基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV CE1基因片段,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link 1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-CE1.通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定,证实了pAd.HCV-CE1插入片段为HCVCE1区基因片段.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法证实pAd.HCV-CE1可以在人肝癌细胞7721中瞬时表达.以上结果初步表明,构建的质粒pAd.HCV-CE1可以表达HCV CE1区基因,为进一步包装能高效表达HCV CE1基因的腺病毒载体奠定了基础.
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基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定
目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR)+164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.
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糖多孢红霉菌表达载体pZMW的构建
目的:构建能够在糖多孢红霉菌中稳定存在的表达性载体.方法:用PCR方法从糖多孢红霉菌染色体上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体的启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了染色体整合型糖多孢红霉菌表达载体pZMW.结果:pZMW表达载体能够整合到链霉菌和糖多孢红霉菌染色体上,并能够在链霉菌和糖多孢红霉菌体内表达硫链丝菌素抗性基因tsr.结论:pZMW表达载体能够在糖多孢红霉菌中表达外源基因.
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红色糖多孢菌表达载体pZW的构建
目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率.方法:以pSET152和pET-22b(+)为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW.结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP).结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因.
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周期蛋白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响
观察哮喘大鼠气道平滑肌周期蛋白D1的表达,并构建大鼠周期蛋白D1 (CyclinD1)正反义表达质粒,转染支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC),探讨CyclinD1在哮喘大鼠ASMC增殖过程中的影响.大鼠雾化吸入卵清蛋白建立哮喘模型,免疫荧光检测CyclinD1的表达.以气道平滑肌条总RNA为模板,通过RT-PCR获取大鼠CyclinD1全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建CyclinD1正义表达质粒(pcDNA3.1-CyclinD1)和反义表达质粒(pcDNA3.1-asCyclinD1).用脂质体介导的基因转染方法,将正反义重组体和空质粒(vector)分别转染哮喘大鼠和正常大鼠ASMC,用Western blotting方法鉴定CyclinD1基因的表达.采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察构建质粒对哮喘大鼠ASMC增殖的影响.结果表明:(1)与对照组相比,哮喘组CyclinD1表达显著增高;(2)酶切鉴定和测序分析证实,试验成功构建了CyclinD1正反义表达质粒.与转染pcDNA3.1-CyclinD1组和vector组相比,转染pcDNA3.1-asCyclinD1组大鼠ASMC中CyclinD1表达水平下降(P<0.01);(3)与vector组S+G2M期比例、吸收度(A)值、PCNA阳性表达率相比,转染pcDNA3.1-CyclinD1组增殖指标均明显增加(P<0.01).转染pcDNA3.1-asCyclinD1组增殖指标均明显下降(P<0.01).正常组大鼠转染质粒后各组间变化趋势与哮喘组一致.pcDNA3.1-CyclinD1可促进哮喘大鼠ASMC增殖,pcDNA3.1-asCyclinD1可抑制哮喘大鼠ASMC增殖,提示CyclinD1在哮喘ASMC增殖的信号转导中具有重要作用.
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DNA重组制品药学申报资料一般要求
新的《新生物制品审批办法》（以下简称《办法》）于1999年5月1日发布施行。法规中对 各类生物制品的申报资料要求较原法规有了更为详细、具体的规定。其中关于治疗用生物制 品的申报资料项目共列有52项，要求按不同的申报阶段（包括申请临床、证书或生产等） 提供相应项目编号的资料，而对于不同种类的制品（如DNA重组产品、单克隆抗体和血液制 品等）《办法》中又有进一步具体的规定。本文以生物技术产品中的DNA重组产品为例，简 要介绍一下申报临床阶段药学方面的资料要求，其内容包括了《办法》中治疗用生物制品申 报资料项目的1～20项，共分8个方面介绍。需说明的是其排序并未按法规上资料项目编号 ，而是按照一般新制品的研制思路和顺序，并将相关内容的资料项目进行了合并，目的是为 简化形式并增强内容的系统性。1 申请表，附检定报告（资料项目1） 复印法规上的空白表格，按要求逐项填写。注意事项有：①中文名要用正式名称。②申 报生产文号时，不同规格应分填不同申请表。③填写内容应简明、扼要。④所有申报单 位都应加盖公章。2 新制品的名称、选题目的和依据、国内外有关方面研究现状（包括专利 ）、生产和使用情况综述及主要参考文献（资料项目3） 与一般药品不同，这里加注了专利情况检索。除制品本身的专利外，重组产品还会从不同 的角度涉及专利问题，如目的基因、宿主细胞、表达载体等，需全面考虑。但此方面内容一 般不作为审评的重点，亦不作为批准与否的依据。
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多药耐药1基因小干扰RNA阳离子脂质体逆转乳腺癌多药耐药的研究
目的 探讨载体表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)逆转乳腺癌细胞多药耐药的可行性,同时解决小干扰RNA在应用过程当中存在的瞬时表达及体内递送问题.方法 以之前研究中筛选出来的能有效抑制MDR1基因表达的小干扰RNA序列为基础,构建其表达质粒,利用新型纳米隐形阳离子脂质体装载MDR1基因小干扰RNA的表达质粒,并对该阳离子脂质体进行体内外药效学研究.结果 装载小干扰RNA表达质粒的阳离子脂质体在体内外均能有效的抑制MDR1基因的表达.结论 小干扰RNA阳离子脂质体很大程度上逆转了乳腺癌的多药耐药性.纳米阳离子脂质体是小干扰RNA的理想递送载体,能够保护小干扰RNA免于降解并将小干扰RNA转运到肿瘤区发挥作用.
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口服重组乳酸菌的药用研究与应用
目的 围绕重组乳酸菌的药用优势、发挥药用效应的免疫学机制、影响因素、主要应用及其发展中面临的问题进行综述.方法 分析和整理近年来国内外关于口服重组乳酸菌药用研究与应用的相关文献.结果与结论 多种乳酸菌以其安全性、遗传可操作性及良好的定植能力成为口服药用蛋白在胃肠道发挥局部作用的潜在运载工具.近10年的动物试验表明,口服重组乳酸菌具有明显的药用价值,目前该项研究已进入人类临床实践阶段.虽然重组乳酸菌口服剂型的研发仍存在技术瓶颈,但其应用前景和潜在的商业价值不可估量.
