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阿霉素冲击诱导人骨肉瘤多药耐药细胞模型
目的:建立人骨肉瘤细胞多药耐药亚系.方法:采用ADM间断冲击法诱导骨肉瘤细胞,并用免疫荧光、MTT及ABA法检测肿瘤细胞的耐药特征.结果:本实验建立了6株多药耐药细胞亚系MG-63/R1～6.用免疫荧光术可以检测到P-gp的表达,MTT、ABA法显示各亚系细胞的多药耐药性明显增加,并且维拉帕米可以拮抗P-gp的作用.结论:MDR1/P170在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,而且这些骨肉瘤多药耐药细胞亚系为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础.
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沙眼衣原体体外持续性感染细胞模型的研究进展
沙眼衣原体（ Ct)在感染上皮细胞整个过程中，Ct原体和网状体两种形态交替形成。然而，体外培养过程中，青霉素、IFN－γ、缺铁等可抑制RB向EB的转化，形成异型RB；当诱导因子去除后，网状体又重新转变为正常形态并开始分裂，表现为持续性感染状态。本文对体外Ct持续性感染细胞模型的相关因素以及方法学的研究进展作一综述。
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过表达和敲除SLUG基因卵巢癌SKOV3细胞稳定株的建立
目的 利用慢病毒载体和改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统分别构建过表达和敲除SLUG基因的卵巢癌SKOV3细胞稳定株.方法 ①以质粒pCMV-Myc-SLUG为模板扩增出HA-SLUG基因,将其连接到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Hyg中.将此重组表达载体pLVX-HA-SLUG通过病毒感染法感染SKOV3细胞(实验组),以相同条件制备pLVX-IRES-Hyg空载体的慢病毒作为阴性对照,Western blotting法检测两组SLUG蛋白表达.②将一对能特异结合SLUG基因的sgRNA分别连接到载体PX462中,获得的一对重组质粒通过脂质体法共转染SKOV3细胞,筛选稳定株,挑取单克隆细胞(实验组),用Western blotting法检测SLUG蛋白表达,另设空白对照组,不加任何处理.结果 ①对挑取的单克隆菌液进行PCR扩增,阳性者提取质粒进行PCR和双酶切,两者验证正确后进行DNA测序鉴定,结果证实重组质粒构建成功.阴性对照组与实验组SLUG蛋白相对表达量分别为0.92±0.02和3.14±0.04,实验组SLUG蛋白表达高于阴性对照组(P<0.01).②挑取4个单克隆细胞进行测定,SLUG蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.01、0.21±0.02、0.20±0.01,空白对照组为0.56±0.03.实验组SLUG蛋白相对表达量低于空白对照组(P均<0.01).结论 过表达和稳定敲除SLUG基因的SKOV3细胞株构建成功,为进一步探讨SLUG在卵巢癌中的作用提供了细胞模型.
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一种简便的皮层神经元原代培养方法的建立及其培养结果分析
目的：建立一种简便的皮层神经元原代培养方法，并鉴定其培养效果。方法取出生24 h内的SD大鼠大脑皮层组织，采用胰酶消化法获取神经元细胞悬液，用10％ FBS＋DMEM高糖培养基接种在经多聚赖氨酸包被的培养板中，4 h后全量换用Neurobasal＋2％B27＋0．5 mmol／L谷氨酰胺培养液。培养后采用倒置相差显微镜观察神经元形态变化，连续观察8天。神经元培养7～8天进行免疫荧光染色，于激光共聚焦显微镜下对神经元进行鉴定，计算神经元密度和纯度。结果皮层神经元接种时体积小，透亮，呈圆形，单个散在分布。接种后有少量细胞开始贴壁，2 h左右贴壁较多，少量细胞伸出短小的突起；4 h左右已基本贴壁，大量细胞伸出突起，周围光晕明显；培养3天时神经元突起明显伸长，相互交织，细胞透亮，立体感强，呈圆形、椭圆形、梭形；培养5～6天时神经元体积增大，突起交织成网状；培养7～8天时，神经元细胞体饱满，细胞质透亮，细胞核大而明显，细胞体周围折光性强，立体感好，突起交织成致密的网络结构。经免疫荧光染色后鉴定，分离培养的是神经元，密度1．5×106个／mL，纯度＞90％。结论成功建立了一种操作简便的皮层神经元培养方法，该方法培养的神经元纯度高、密度大，可为今后的相关学科研究提供良好的细胞模型。
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体外MPP+诱导胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元模型的建立
目的 建立一种体外1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶离子(MPP+)诱导的胚胎大鼠中脑多巴胺(DA)能神经元模型,为帕金森病(PD)发病机制和药物干预研究奠定基础.方法 体外培养胚胎SD大鼠(孕14～15 d)中脑DA神经元7d后随机分为实验组和对照组,均以含1％ B27的无血清DMEM/F12培养基培养,在此基础上前者加入MPP+使终浓度达到10 μmol/L,均继续培养48 h.采用免疫组化染色法检测酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量和突起长度.结果 在放大倍数(×100)视野下,实验组和对照组中脑TH阳性神经元数量分别为(351.5±32.7)、(538.0 ±58.7)个,P＜0.01;在放大倍数(×200)视野下,实验组和对照组中脑TH阳性神经元突起长度分别为(121.6±6.1)、(246.9±11.3)μm (P＜0.001).结论 MPP+体外诱导可成功建立胚胎大鼠中脑DA能神经元模型,此为PD发病机制和药物干预研究奠定了基础.
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吡格列酮对胰岛素抵抗HepG2细胞胰岛素受体底物表达的影响
目的 探讨吡格列酮对胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞胰岛素受体底物(IRS)蛋白表达的影响.方法 胰岛素抵抗HepG2细胞模型建立后,培养液中加入吡格列酮共同孵育,观察吡格列酮对模型细胞葡萄糖掺入率的影响;应用免疫细胞化学染色法观察吡格列酮对IR HepG2细胞IRS-1、IRS-2表达的影响.结果 与模型细胞组比较,1×10-5 mol/L吡格列酮显著提高了HepG2细胞的葡萄糖掺入率(P＜0.01),使IR HepG2细胞IRS-1、IRS-2蛋白的表达显著增加(P＜0.05).结论 吡格列酮的胰岛素增敏作用可能与胰岛素信号转导分子IRS-1、IRS-2蛋白的表达增强有关.
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蜕皮甾酮对胰岛素抵抗HepG2细胞胰岛素受体表达的影响
目的 探讨蜕皮甾酮对胰岛素抵抗(IR)HepG2细胞胰岛素受体(InsR)蛋白表达的影响.方法 建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,培养液中加入蜕皮甾酮孵育,观察蜕皮甾酮及吡格列酮对细胞葡萄糖摄取率的影响;应用免疫组化染色法及Western blot方法观察蜕皮甾酮对IR HepG2细胞InsR蛋白表达的影响. 结果 与模型细胞比较,1×10-5 mol/L蜕皮甾酮可使IR HepG2细胞InsR蛋白的表达显著增加. 结论 蜕皮甾酮的胰岛素增敏作用可能与胰岛素信号转导分子InsR蛋白的表达增强有关.
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子宫腺肌病体外细胞模型的建立
目的 探讨分离、培养在位子宫内膜间质细胞的方法,以作为子宫腺肌病体外研究的细胞模型.方法 通过酶解、过滤、沉降及贴壁纯化等技术,分离、培养12例子宫腺肌病(不合并子宫肌瘤)患者的在位子宫内膜间质细胞,并传代培养.结果 12例子宫腺肌病在位内膜标本中,9例分离、培养获得成功,可进行传代培养;间质细胞的纯度达95%以上.结论 在位子宫内膜间质细胞可在体外成功得到分离、培养,并可作为子宫腺肌病在体外研究的细胞模型.
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蛋白酶体抑制剂制备帕金森病模型的研究进展
帕金森病(PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病,以黑质多巴胺(DA)能神经元的变性缺失和残存的神经元胞质内Lewy小体形成为病理特征.由于发病率的增加及其不可根治性等特点,PD已成为神经领域的研究热点,而制备稳定的疾病模型成为研究的主要手段.近年来蛋白酶体抑制剂成为制备PD模型的新型药物,下面就该药物在PD模型中的研究进展作一综述.
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新型脂质体的研究与应用
脂质体是由脂质双分子层构成的内部为水相的封闭囊泡.由于其磷脂双分子膜与细胞膜结构类似,使其具有某些与生物体相似的性质,从而作为细胞模型,和药物载体广泛应用于生物膜及膜蛋白的研究;近年来随着新材料、新技术的研发,又出现了一些新型的脂质体,现将其研究与应用综述如下.
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一种高效表达HBx的肝癌细胞模型的建立
目的 构建稳定、高效表达HBx的转基因细胞模型BEL-7404/HBx.方法 通过脂质体转染将亚克隆有HBV X基因的重组质粒pcDNA3.1(+)-V5-HisB-HBx导人肝癌细胞系BEL-7404,并用G418筛选获取阳性克隆,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)检测不同生长时期阳性克隆中HBx mRNA和蛋白的表达情况.结果 不同生长时期阳性克隆均能检测到HBx mRNA和蛋白的高效表达.结论 成功构建稳定、高效表达HBx的转基因肝癌细胞模型BEL-7404/HBx.
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难治性癫(癎)研究相关的细胞模型概况
难治性癫(癎)是儿科棘手的临床问题之一,其发生机制至今尚未完全明确.由于人体大脑组织难以获取等限制,难治性癫(癎)形成机制等方面的研究需依赖人体之外的模型.现就各种难治性癫(癎)研究相关的细胞模型建立的方法、机制等方面进行综述.
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人巨细胞病毒体外感染SD乳鼠海马神经元细胞模型的建立及钙代谢的初步研究
目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染对原代培养SD乳鼠海马神经元细胞内钙离子的影响及其机制.方法 取24 h内出生的SPF级SD乳鼠雌雄各10只,建立原代乳鼠海马神经元单层细胞;在体外培养的第8天将生长良好的单层神经元细胞随机分为HCMV感染组、HCMV+ MK-801组、MK-801组和对照组,每组设10个复孔;在处理后24 h用Fluo-3 AM钙离子探针进行荧光染色,在激光共聚焦显微镜下检测各组神经元游离钙离子的荧光强度值.结果 接种HCMV 24 h后,神经元逐渐变圆、肿胀,4d后大部分细胞裂解消失;通过免疫组织化学在海马神经细胞的培养物中可见HCMV产生早期蛋白,呈棕黄色颗粒,苏木精复染后呈棕褐色.HCMV组神经元细胞内游离钙离子荧光强度值为215.5±14.9,高于对照组(116.4±5.9),差异有统计学意义(t=15.2,P＜0.01);HCMV+ MK-801组神经元的荧光强度值(135.5±8.6)较HCMV组(215.5±14.9)明显下降,下降率为(37.0±3.4)％,差异有统计学意义(t=11.3,P＜0.01);MK-801组的荧光强度值为88.1±4.5;较对照组(116.4±5.9)明显下降,下降率为(24.0±6.7)％,差异有统计学意义(t=-9.3,P＜0.01).结论 HCMV AD16株感染体外培养大鼠海马神经元可致细胞内的钙超载,N-甲基-D-天冬氨酸受体通道介导的钙离子内流可能是HCMV感染后神经元内钙超载的主要机制之一.
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用精神分裂症患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多潜能干细胞模型
目的 将精神分裂症患者来源的人皮肤成纤维细胞(HDF)重编程为诱导性多潜能干细胞(iPSCs),为精神分裂症患者建立iPSCs模型.方法 采用聚合酶链反应技术从pEP4EO2SEM2K质粒上扩增2条目的片段:OCT4-IRES2-SOX2和C-MYC-IRES2-KLF4,将其连接到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry上.构建成功的质粒通过磷酸钙转染法转染293T细胞包装病毒,检测病毒活力后侵染患者皮肤成纤维细胞,将其去分化为诱导性多潜能干细胞,并检测其多能性.结果 测序表明重组慢病毒载体构建成功,并制备了具有良好侵染活力的重组慢病毒.将含4种重编程因子的慢病毒颗粒侵染1例精神分裂症患者的HDF后,HDF的形态逐步发生变化,终形成典型的iPSCs克隆.结论 成功将1例精神分裂症患者成纤维细胞重编程为iPSCs,为以后建立更多精神分裂症疾病模型奠定基础.
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宫颈癌细胞模型在临床研究中的应用
宫颈癌体外细胞模型种类较多,本文就宫颈癌体外评价细胞模型研究进展进行综述,通过介绍常用的经典宫颈癌细胞模型及近年来新构建的几种细胞模型,阐述了其在药物研究中的作用,为临床研究选择合适的细胞模型提供参考.
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自体外周血单个核细胞对原代肝癌细胞生长的影响及芦荟多糖对其干预作用
目的 观察、探讨自体外周血单个核细胞(PBMC)对原代肝癌细胞生长的影响及芦荟多糖AP11的干预作用.方法 以手术切除肝癌组织为标本,胰酶短暂消化加吹打、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞.通过倒置显微镜观察其形态学特征.于分离培养第2天,加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中,倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响,MTT法观察其对癌细胞生长的影响.结果 采用胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液原代培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞;与空白对照组相比,芦荟多糖组癌细胞在形态上无明显差别,MTT实验结果表明其对癌细胞的生长无明显影响;与空白对照组相比,芦荟多糖AP11干预与未干预PBMC组癌细胞形态均有较大变化,MTT实验结果表明,其对癌细胞的生长有显著抑制作用.结论 芦荟多糖AP11无直接体外抗肿瘤活性,其抗肿瘤活性可能是通过与PBMC的相互作用,通过调节机体的免疫系统而达到的.
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二仙汤对围绝经期综合征细胞模型的影响
目的 探讨二仙汤治疗围绝经期综合征的依据.方法 利用10％围绝经期综合征大鼠血清培养正常大鼠的卵巢颗粒细胞以复制围绝经期综合征的细胞模型,观察二仙汤对该模型中卵巢颗粒细胞生长的影响.结果 二仙汤对颗粒细胞的生长呈现促进作用.结论 二仙汤在临床治疗围绝经期综合征与其对颗粒细胞生长的促进作用有关.
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猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立
采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK-15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得CSFV39-PK15细胞株.用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况.结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征.这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础.
关键词： 猪瘟病毒株CSFV39 持续感染 细胞模型 RT-PCR -
大鼠骨骼肌细胞氧化应激损伤实验研究
目的 构建体外压疮深部组织细胞氧化应激模型,为进一步在细胞层面探讨压疮深部组织损伤机制建立基础.方法 将对数生长期大鼠骨骼肌细胞分为对照组及5个实验组,对照组行常规培养,5个实验组分别采用50、100、1 50、200、250 μmol/L过氧化氢处理1～4 h后分别检测四氮甲基唑蓝(MTT)、乳酸脱氧酶(LDH)指标并观察骨骼肌细胞Hoechst染色及形态学变化.结果 对照组1～4 h细胞存活100％,MTT、 LDH指标及组织形态无明显变化.5个实验组2h时除50 μmol/l组外,均呈现明显损伤变化;至4h,大鼠骨骼肌细胞存活率为20％～75％;显微镜下观察大鼠骨骼肌细胞随氧化应激程度加重而缩收,细胞间隙增大;Hoechst细胞荧光染色显示100 μmol/L过氧化氢作用4h已有较多肌细胞趋向凋亡;细胞LDH释放率约为对照组的1.5倍.结论 大鼠骨骼肌细胞随氧化应激程度加重,趋向凋亡;经100 μmol/L过氧化氢作用4h的骨骼肌细胞可作为研究压疮深部组织细胞氧化应激的体外模型.
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大鼠背根神经节加压培养细胞模型的建立
目的 建立大鼠背根神经节(DRG)细胞受压模型,观察在恒定压力下培养24 h和48 h后神经元形态和活性的变化,评价这种神经元压力培养模型的优缺点.方法 将培养的新生大鼠DRG细胞随机分为正常对照组、受压24 h组、受压48 h组,在80 mmHg压力的密闭环境中培养相应时间后观察各组细胞在荧光显微镜和电镜下形态学特点,并用MTT法分析各组神经元细胞生长活性的改变.结果 加压培养后,荧光显微镜下DRG神经元形态未发生明显变化,超微结构示48 h组和24 h组较正常组线粒体肿胀明显,粗面内质网缩短、变少,游离核糖体增多,部分核固缩,神经元代谢水平下降,MTT法比较加压前、后各组细胞活性的差异无统计学意义.结论 加压培养未使细胞活性发生显著改变,此模型可观察机械压力单一因素对神经元的影响,有望成为一种在亚细胞和分子水平研究机械压力对DRG神经元的影响的有效细胞模型.
