增殖型血管平滑肌细胞模型的培养改良

以往使用的血管平滑肌细胞(VSMC)模型是直接用正常血管贴壁培养传代细胞,并认为传至第5代以后即为分泌型[1].但我们通过检测特异性表型表达基因SM22α发现,按以往传代培养的VSMC仍有表达.

荧光素酶标记的HBV细胞模型的建立

建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)体外感染的细胞模型.利用分子亚克隆技术,以pAAV/1.2HBV质粒为模板,PCR扩增带有反向重复序列(ITR)的1.2倍HBV基因组片段,反向插入真核表达载体pGL3-CP-Fluc中,构建Fluc标记的HBV基因组表达质粒pGL3-CP-Fluc HBV1.2,并将此质粒转染至Huh-7细胞中.全自动免疫分析仪进行HBsAg、HBeAg的定量检测,生物发光检测仪检测Fluc其在细胞的表达水平.成功构建了1.2倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染Huh 7细胞后,质粒在细胞中高水平表达Fluc,并可以正常分泌HBsAg、HBeAg.重组质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2能在Huh-7细胞中表达,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型,为抗病毒药物研究奠定基础.

人表皮干细胞体外培养及分化特性的研究

目的探索人表皮干细胞(KSC)的筛选和体外培养方法,了解表皮干细胞在体外快速扩增的条件及其分化特性,为研究创伤愈合和组织工程提供良好的细胞模型;

丙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞模型的建立

目的:建立近似自然感染的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)体外感染细胞模型.方法:将含10%HCV RNA阳性血清的接种液和HepG2细胞在37℃、5%CO2条件下共同孵育24 h,再加含新生牛血清、地塞米松、胰岛素及硫酸亚铁的维持培养液,置32℃、5%CO2条件下培养,以后每3～4 d传代一次,定期收集培养上清液和细胞.应用RT-nested-PCR、免疫组化及Western blot进行病毒核酸和蛋白质的检测.结果:RT-nested-PCR法检测发现在接种病毒后第4～16天的细胞标本中可检测到HCV RNA正链,接种病毒后第4～24天的细胞标本则可检测到HCV RNA副链.通过免疫组化和Western blot检测,病毒蛋白(NS3)能在第4天检出.结论:HCV体外感染HepG2细胞模型的建立,可望用于HCV吸附肝细胞机制研究及疫苗中和试验.

妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的建立及血管紧张素Ⅱ表达的检测

目的:探索建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的优化方法并对该细胞模型中血管紧张素Ⅱ表达量进行分析.方法:取妊高症孕妇脐带(约8cm),用PBS冲洗和灌注胰蛋白酶(浓度为1%)消化法分离脐静脉内皮细胞,用McCoy's 5A培养基进行原代和继代培养;用吖啶橙(AO)细胞荧光染色进行细胞的形态学鉴定;用免疫组织化学分析所分离细胞的来源;用Western blotting检测血管紧张素II(Ang II)的表达情况.结果:利用1%的胰蛋白酶灌注消化可以获得大量的原代细胞,并且在不添加任何生长因子的情况下,使用McCoy's 5A培养基进行原代和继代培养可以实现连续传代6代以上,且细胞状态良好,生长稳定.AO染色鉴定显示细胞边缘平整,细胞核小且形态完整,符合正常细胞的形态.免疫组化鉴定结果表明在所分离的细胞中人VIII因子及血管内皮生长因子(VEGF)相关抗原呈强阳性.Western blotting检测发现在所分离的细胞中Ang Ⅱ表达量远远高于普通细胞[(90.20 ± 5.84)%, P= 0.0130].结论:1%浓度的胰蛋白酶灌注消化法与McCoy's 5A培养基培养法是体外建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的高效经济的方法,该模型高表达血管紧张素Ⅱ,推测Ang Ⅱ可能是诱发妊高症的原因之一.

人肝癌细胞系7721丙型肝炎病毒体外感染模型的建立

目的 建立接近体内自然感染状态并能稳定支持丙型肝炎病毒(HCV)体外长期复制的感染细胞模型.方法 将人肝癌细胞系7721与慢性丙型肝炎患者血清共温育8小时后,分别以逆转录一聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞和/或培养上清中的HCV RNA、HCV抗原表达及HCV RNA在感染细胞内的定位.结果 感染血清和细胞共同温育后的第2～66天,从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负链RNA,即使其间细胞传代6次,HCV NS3、NS5抗原在细胞内能稳定表达,原位杂交显示HCV RNA阳性物质多位于细胞浆.结论 7721细胞不但对HCV易感,而且可以稳定地支持HCV的体外长期复制,此模型可以用于HCV感染、复制机制的研究、抗病毒药物的评价及保护性抗体/疫苗的初步筛选.

心脏营养素-1及其与肝脏疾病关系的研究进展

1995年Pennica等[1]利用心脏来源的胚胎干细胞模型,首先克隆出一种具有促心肌肥大和发育的细胞因子,称之为心脏营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1).

乙型肝炎病毒及其X基因对培养肝细胞端粒酶活性的影响

乙型肝炎病毒(HBV)X基因(HBx)的表达产物反式激活宿主细胞癌基因,是HBV诱发肝癌的主要机制[1].近年,人们发现80%以上的恶性肿瘤细胞存在高水平的端粒酶活性,认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的形成和发展密切相关,并把端粒酶活性作为肿瘤早期诊断和判断预后的指标[2-4].我们构建了体外肝细胞模型,对HBx与端粒酶有无内在关联进行了初步探讨.

口服药物吸收的细胞模型研究进展

多种细胞模型如常用的Cao-2和MDCK细胞,以及新近开发的MDCK-MDR1、M细胞、药物溶出/Caco-2细胞组合、HT-29和TC7细胞等均可用于口服药物吸收的评价,但也存在一定的局限性.本文综述各类细胞模型的特点及其应用等相关研究进展.

细胞共培养模型在口服药物吸收研究中的应用

细胞共培养体系能很好地模拟人体小肠生理环境，准确预测药物在肠道内的转运和代谢情况，增强体外细胞模型与整体动物实验研究之间的相关性，近年来在评价口服药物吸收方面发挥着越发重要的作用，已成为新药研发过程中评价药物口服吸收的热点。综述体外模拟肠道环境的细胞共培养模型，并对其应用于口服药物研发的体外评价吸收做出展望。

过氧化氢介导人瓣膜间质细胞产生氧化应激细胞模型的建立

目的 建立过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)介导的瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)氧化应激模型,为心脏瓣膜病始发机制的研究以及未来抗氧化治疗药物筛选提供细胞学模型.方法 将分离培养的原代人主动脉瓣VICs随机分为对照组和处理组,分别以含10％胎牛血清的DMEM培养液和普通培养液+不同浓度梯度(0、50、100、300、500、800、1 000 μmol/L)的H2O2进行培养.采用H-E染色、MTT比色法、Annexin Ⅴ/PI双染流式细胞术检测细胞生存能力和凋亡的发生.结果 处理24 h后,MTT结果显示各组VICs细胞存活率差异有统计学意义(P＜0.01),H2O2浓度在50、100μmol/L时细胞存活率与对照组相比升高(P＜0.05),随后细胞存活率随H2O2浓度升高开始下降,在800 μmol/L时出现快速降低的拐点,此时细胞存活率为(69.8±8.3)％,1 000 μmol/L时细胞存活率降为(14.3±11.0)％.H-E染色显示在800μmol/L时VICs形态皱缩,胞核固缩.流式细胞检测则进一步证实800 μmol/L时VICs出现明显凋亡,此时多为中晚期凋亡.结论 H2O2佳作用浓度为800 μmol/L,作用时间为24 h,在该条件下可成功建立氧化应激细胞模型.

细胞推拿模型的构建及作用机制研究进展

传统中医推拿是指医生通过手法诊治患者筋骨病变、脏腑虚实、气血盛衰等.而这种观察与判断是建立在推拿医生医疗实践的积累之上的,且这些多着眼于软组织、骨关节、神经等层面.这些研究虽然在一定程度上促进了学科的发展,但是这些软组织、骨关节等研究毕竟属于宏观层面的研究,没有微观的探讨,给临床、教学、科研带来了诸多不便,制约中医推拿的发展和推广.随着分子生物学、细胞学、基因组学、蛋白质组学的发展,推拿学科也应与时俱进,从多学科、多角度去分析推拿疗法的作用机制.

不同浓度H2O2体外诱导大鼠海马细胞氧化损伤观察

目的 探索H2O2诱导大鼠海马细胞氧化损伤模型的佳浓度.方法 应用不同浓度的H2O2与大鼠海马细胞共同培养 24 h.观察细胞形态学变化;MTT法测定细胞活性;免疫组化法检测细胞中Bax与Bcl-2的蛋白表达.结果 与正常组细胞比较,当H2O2浓度高于 1 mmol/L时细胞形态损伤明显加重,细胞活性降低,bax蛋白高度表达;当 H2O2浓度低于1 mmol/L时细胞形态无明显损伤, 细胞活性无明显改变,bcl-2蛋白高度表达.结论 在本实验条件下H2O2浓度1 mmol/L时为模型佳复制浓度.

帕金森病体外细胞模型的研究进展

帕金森病作为长期困扰中老年人的重大疾病,广泛受到人们的关注.在帕金森病的研究过程中,由于动物实验的周期长、消耗大,因而体外细胞模型越来越多的被用来进行相关病理、生理及药物筛选研究.而在体外细胞模型的选择上,不同造模剂各有特色,而且使用的细胞系不同,也使模型表现出不同的特点,并终影响研究结果.

HBV感染对趋化因子CCL20表达的影响及其意义(摘要)

目的研究HBV不同感染状态对CCL20表达水平的影响,探讨CCL20在乙肝病毒感染中的作用.方法通过基因体外转染技术,建立HBV不同感染状态的肝细胞模型;以内对照定量RT-PCR检测HBV不同感染状态下CCL20的表达水平.结果HBV不同感染状态下CCL20的表达水平不同,HBV未感染肝细胞CCL20表达水平每106细胞为(2.65±0.02)pg/10μL,HBV短暂感染肝细胞CCL20的表达水平每106细胞为(3.43±0.02)pg/10μL,而HBV持续感染肝细胞CCL20的表达水平每106细胞为(1.22±0.04)pg/10 μL,上述三种不同感染状态下肝细胞表达CCL20的水平差异有统计学意义,表现为HBV短暂感染肝细胞＞未感染肝细胞＞HBV持续性感染肝细胞(P＜0.05).在HBV同一感染状态下,CCL20的表达水平与HBV感染时间、细胞的培养时间、病毒载量等因素未见显著性相关;上述细胞经乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)活化后,相应细胞CCL20表达均明显增加(P＜0.05),但并不改变CCL20在各细胞中的表达格局.结论HBV的不同感染状态影响了CCL20的表达.

9-硝基喜树碱在Caco-2细胞模型中的体外摄取、转运及外排动力学

基于柠檬酸转运蛋白的高通量药物筛选细胞模型

柠檬酸转运蛋白(NaCT)为新发现的钠离子偶联的羧酸转运蛋白家族的一员,主要功能是负责转运三羧酸循环的中间体,近年来研究发现NaCT可能是治疗糖尿病和肥胖症的重要药物靶点.该研究构建了NaCT基因的真核表达质粒,通过稳定转染HEK293细胞,筛选得到了稳定表达NaCT的细胞系.利用RapidFire平台建立了基于NaCT的高通量药物筛选细胞模型,结果显示该模型能高效地转运柠檬酸,具有良好底物特异性和选择性,其转运能力可被Li+激活,被4,4-二异硫氰基芪-2,2′-二磺酸抑制.Z因子计算结果为0.69,提示其适用于高通量筛选.对两种不同类型化合物库的筛选获得了一系列NaCT抑制剂,包括14个小分子化合物和15个中药组分.基于NaCT细胞模型的成功构建为高通量筛选具有抗糖尿病及肥胖症作用的先导化合物提供了一个新平台.

阿托伐他汀对房颤细胞模型中ATBF1/PIAS3/STAT3通路的影响

探讨阿托伐他汀对心房颤动细胞模型中ATBF1/PIAS3/STAT3信号通路的作用.通过高频电刺激(5 ms,25 Hz,7 V/cm) HL-1心房肌细胞系构建房颤细胞模型,并采用CCK-8实验检测梯度浓度阿托伐他汀(0.01,0.1,1,10,50和100 μmol/L)干预下心房肌细胞系HL-1细胞活性,以筛选出阿托伐他汀的药物安全浓度,同时应用Western blotting实验测定以上每组p-STAT3和STAT3蛋白表达情况来选择佳给药浓度,并分别检测在对照组、房颤组和药物实验组3组中ATBF1/PIAS3/STAT3信号通路中各个蛋白表达水平.实验结果证明,CCK-8实验筛选阿托伐他汀的药物安全浓度为0.1～50 μmol/L.房颤细胞模型中,ATBF1的蛋白表达量显著下调,PIAS3蛋白水平降低,p-STAT3水平明显升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05),但总STAT3的表达水平并无显著性改变(P＞0.05).阿托伐他汀药物干预后,p-STAT3蛋白与STAT3蛋白比值随浓度升高,在1μmol/L时达到大.在此药物浓度下,房颤模型中ATBF1和PIAS3表达上调,p-STAT3表达下调,有统计学差异(P＜0.05),而总STAT3无显著性差异(P＞0.05).提示阿托伐他汀抗心房颤动的分子作用机制可能与其抑制ATBF1/PIAS3/STAT3信号通路有关.

基于细胞模型的高通量药物筛选

随着高通量药物筛选发展的需要,细胞模型在药物筛选中发挥了越来越大的作用.本文综述了细胞模型在药物高通量筛选中的应用.主要介绍了该模型基础上的筛选流程、模型分类及其在实际药物筛选中的应用,并对其相关的检测技术进行了阐述,以及对其发展前景进行了分析.

KATP通道对缺血性心肌电平衡的维护作用及机制

目的:利用异丙肾上腺素(ISO)诱导大鼠心肌缺血性损伤模型和心肌细胞损伤模型,并对其进行药物干预,探讨心肌ATP敏感性钾通道(KATP通道)维持缺血性心肌电平衡的作用与机制.方法:在动物实验中,将雄性SD大鼠,随机分为5组,正常对照组大鼠皮下注射0.9％氯化钠溶液,其余各组大鼠均皮下注射等量1g·L-1 ISO(qd),连续9d,其间,在第7～9 d,除了正常对照组和模型组外,其他3组大鼠还分别灌胃给予1.75 9·L-1普萘洛尔(PRO)2 mL·kg-1·d-1、5 9·L-1曲美他嗪(VAS)2 mL·kg-1·d-1或腹腔注射给予5g·L-1二苯基碘(DPI)1 mL·kg-1· d-1.在造模期间不同时间点,对各组大鼠进行心电图检查,并制备心肌标本,检测其中KATP通道亚基KIR6.2蛋白表达水平.在细胞实验中,将H9C2心肌细胞分成对照组(不给药)、ISO组、ISO+ PRO组、ISO+DPI组和ISO+VAS组,后3组细胞均在1 μmol·L-1ISO加入前30 min,分别给予2 μmol·L-1 PRO、10 μmol·L-1DPI和10 μmol·L-1 VAS,且在加入ISO后,与ISO组细胞一样,再孵育1和24 h,采用实时荧光定量PCR法测定各组细胞中KATP通道亚基KIR6.2和SUR2A基因表达水平.结果:大鼠实验显示,与正常对照组相比,模型组大鼠在造模的第3、7d,心电图参数QTc明显缩短,心率加快(P＜0.05),且心肌中KIR6.2蛋白表达明显增多(P＜0.01),而造模9d后,其QTc明显延长(P＜0.01),心率减慢(P＜0.05),心肌中KIR6.2蛋白表达显著降低(P＜0.01);ISO+ PRO、ISO+DPI和ISO+VAS各组大鼠在持续3d分别接受3种药物治疗后,其QTc较模型组明显缩短,心率升高,均趋于恢复正常水平.细胞实验显示,与对照组相比,ISO组H9C2细胞经ISO孵育1h后,KIR6.2和SUR2A的mRNA表达显著上调(P＜0.05),而在ISO孵育24 h后,KIR6.2和SUR2A的mRNA表达显著下调(P＜0.01);与ISO组相比,各给药组细胞经ISO孵育1h后,KIR6.2和SUR2A的mRNA表达均有不同程度下调,而在ISO孵育24 h后,KIR6.2和SUR2A的mRNA表达均显著上调(P＜0.05或P＜0.01).结论:KATP通道对维护缺血性心肌电平衡起重要作用.持续性激动β受体、氧化应激或能量供应不足等体内多条途径都会影响KATP通道的表达和功能,而保护KATP通道功能,对于维持心电平衡,抑制,心律失常基质形成,意义重大.