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糖尿病性白内障晶状体蛋白二维电泳和质谱鉴定
目的 应用二维电泳和质谱鉴定技术对糖尿病性白内障进行蛋白质组学研究,探讨蛋白质组学在糖尿病性白内障发病机制中的价值.方法 取8例(8眼)1型糖尿病并发白内障晶状体组织,提取晶状体组织中蛋白质进行二维电泳,凝胶染色后,通过Gel Doc 2000凝胶成像仪采集图像,利用PDQuest 8.0凝胶分析软件对图像进行分析.使用基质辅助激光分析离子飞行时间质谱仪(MALAI-TOF-MS)对蛋白斑点进行鉴定.结果 二维电泳图谱能检测到35 ～40个左右的蛋白斑点,大部分高丰度蛋白斑点相对分子质量处于(20 ～31)×103范围内,小部分低丰度蛋白斑点相对分子质量处于(35～45)×103范围内,等电点在5～9之间.利用MASCOT软件查询NCBInr数据库对2个蛋白斑点的肽质量指纹图谱进行了鉴定,分别为α-B晶状体蛋白和β-B1晶状体蛋白.结论 二维电泳和质谱鉴定能够较好地分离和鉴定糖尿病性白内障晶状体蛋白质,为研究糖尿病性白内障形成机制提供了新的方法和途径.
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蛋白质组学技术分析Long Evans大鼠眼优势柱可塑性终止相关蛋白
目的利用二维电泳-质谱技术分析Long Evans大鼠初级视皮层中与眼优势柱终止相关的蛋白质,探索蛋白质组学技术在视觉可塑性研究中的应用.方法取100d龄Long Evans大鼠通过向其初级视皮层中灌注硫酸软骨素酶建立成年眼优势柱移动的动物模型,然后分别提取22 d龄大鼠、100 d龄大鼠和100 d龄硫酸软骨素酶灌注大鼠的初级视皮层灰质总蛋白,利用二维电泳-质谱技术分析与眼优势柱终止相关的蛋白质.结果通过双向电泳确定了与眼优势柱终止相关的4个蛋白质点,质谱分析鉴定了其中2种蛋白质.这2种蛋白为磷脂酰乙醇胺结合蛋白和胶质纤维酸性蛋白.结论二维电泳-质谱技术可以有效地分离和鉴定视皮层中的特殊蛋白质,随着技术的进步和完善,蛋白质组学技术必将在视觉可塑性研究中占有重要地位.
关键词： 二维电泳 视皮层 Long Evans大鼠 蛋白质组 硫酸软骨素 -
蛋白质组学技术分析眼优势柱可塑性相关蛋白
目的利用二维电泳-质谱(2-DE/MS)技术分析Long Evans大鼠初级视皮层中与眼优势柱可塑性相关的蛋白质.方法取22 d龄Long Evans大鼠通过向其初级视皮层中灌注放线菌酮建立幼年眼优势柱不移动的动物模型,然后分别提取22 d龄大鼠、100 d龄大鼠和22 d龄放线菌酮灌注大鼠的初级视皮层灰质总蛋白,利用2-DE/MS技术分析与眼优势柱可塑性相关的蛋白质.结果通过2-DE/MS技术鉴定了与眼优势柱终止相关的5种蛋白质,这5种蛋白质与蛋白质的更新相关,分别为proteasome protein p45/sug、Malate dehydrogenase、Proteasome alpha 1 subunits、adolase A和septin 4.结论二维电泳-质谱(2-DE/MS)技术可以有效地分离和鉴定视皮层中的特殊蛋白质.随着蛋白质组学技术的进步和完善,必将在视觉可塑性研究中占有重要地位.
关键词： 二维电泳 视皮层 蛋白质组 放线菌酮 Long Evans大鼠 -
成年与幼年Long Evans大鼠视皮层蛋白的二维电泳分析
目的利用双向电泳技术比较正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组表达差异,探索蛋白质组学技术在视觉发育研究中应用的可能性.方法 22 d龄和100 d龄Long Evans大鼠各3 只,过量戊巴比妥钠处死,切取其初级视皮层的灰质,裂解抽提总蛋白,双向电泳分离总蛋白,比较2 组大鼠初级视皮层蛋白质表达差异.结果胶图差异分析发现幼年鼠初级视皮层中有12个蛋白质点表达较丰富,成年鼠初级视皮层中有16个蛋白质点表达较丰富.结论正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组存在明显差异,蛋白质组学技术可以应用于视觉发育方面的研究.
关键词： 二维电泳 视皮层 Long Evans大鼠 -
白内障晶状体核蛋白质组学的初步研究
目的 研究年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白的组成.方法 取12例年龄相关性白内障晶状体软核,提取晶状体核中的水溶性蛋白及尿溶性蛋白进行二维电泳及UPD-蛋白质染料染色试剂盒对凝胶染色后,用Image Master 2D Platinum 6.0软件对获得的蛋白图谱进行分析,再利用MALDI-TOF MS分析及数据库搜索对差异表达的蛋白质点进行鉴定.结果 二维电泳结果显示,年龄相关性白内障晶状体核中水溶性蛋白和尿溶性蛋白大部分为相对分子质量14 400～97 400,pI 5～9.高丰度蛋白质斑点相对分子质量分布在20 000～31 000,pI 6～8区域内.年龄相关性白内障晶状体核水溶性蛋白二维电泳图识别出31个蛋白质斑点,尿溶性蛋白二维电泳图识别出26个蛋白质斑点,相差2倍以上表达的差异点有14个.对选取的蛋白质斑点进行MALDI-TOF MS分析,经数据库检索后鉴定出6种蛋白质,其中3种蛋白质表达下调(γS-晶状体蛋白、βA3-晶状体蛋白、βA4-晶状体蛋白),1种蛋白质表达上调(βB1-晶状体蛋白),2种蛋白质表达缺失(截取的人βB1-晶状体蛋白A链、截取的人γD-晶状体蛋白X链).结论 年龄相关性白内障晶状体核不同组分晶状体蛋白中主要由β-晶状体蛋白组成,与尿溶性晶状体蛋白相比,水溶性蛋白鉴定出γD-晶状体蛋白,而βA4-晶状体蛋白阙如.
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二维电泳联合质谱技术鉴定水溶性晶状体蛋白
目的应用二维电泳结合质谱分析分离鉴定水溶性晶状体蛋白及观察乙酰化修饰后的γ晶状体蛋白的变化.方法分别从小鼠及小牛晶状体获得水溶性晶状体蛋白质,并经凝胶过滤层析分离出牛γ晶状体蛋白,进行体外乙酰化;将各晶状体蛋白样品进行二维电泳(2DE),经染色、照相和图像分析,进一步用胰蛋白酶消化、基质辅助激光解吸电离质谱分析鉴定各晶状体蛋白.结果在2DE电泳图谱上,小鼠水溶性晶状体蛋白有20余个斑点,各晶状体蛋白的相对分子质量多位于18 000～30 000 D范围.主要已鉴定的α、β和γ晶状体蛋白,分别占19%、43%和36%.来自小牛的γ晶状体蛋白主要有5个斑点,其中3个大的点(γB、γD和γs)占总量的90%.体外乙酰化后,带负电荷的斑点数明显增多.结论2DE结合生物质谱技术是分离鉴定晶状体蛋白的有效手段,并能对其修饰进行分析研究.
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应用二维电泳及质谱法筛选胰腺癌血清标志物
在中国,胰腺癌发病率逐渐增加,目前其肿瘤相关致死率已跃居第6位[1].早期发现是胰腺癌得以及时治疗的前提之一.目前缺乏理想的胰腺癌血清学标志物.蛋白质组学为肿瘤研究提供了新的思维和技术平台[2].在本研究中,我们初步探讨了二维电泳及质谱法筛选胰腺癌血清标志物中的应用,并希望发现一些与胰腺癌相关的标志物,为胰腺癌的早期诊断提供线索.
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表面增强激光解析电离化飞行时间质谱技术在儿科疾病中的应用进展
人类基因组计划全基因组测序的完成标志着后基因组时代的到来,蛋白质组学成为当前研究热点.在质谱(mass spectrometry,MS)基础上发展起来的表面增强激光解析电离化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ioni-zation time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)[1.2]是一种全新的蛋白质组学研究技术平台.它弥补了二维电泳对低丰度、低溶解度、极端等电点值、极大(相对分子质量>200×10~3)和极小(相对分子质量<10×10~3)等蛋白质分离的不足,提高了蛋白质分离和鉴定的速度.
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应用二维电泳、液相色谱串联质谱技术筛选前列腺癌骨转移相关血清蛋白
目的 筛选前列腺癌骨转移患者和无骨转移患者血清中的差异蛋白质.方法 收集前列腺癌骨转移患者和无骨转移患者的血清,分别将两组血清混合并进行二维电泳,随后用液相色谱串联质谱技术进行差异蛋白的进一步分离和鉴定.后用酶联免疫吸附试验进行验证.结果 发现了两组患者血清中表达水平有显著差异的三个蛋白质:栽脂蛋白A-Ⅰ、血清淀粉样蛋白A和细胞角蛋白10,其中血清样淀粉蛋白A-Ⅰ和细胞角蛋白10在骨转移组表达升高;载脂蛋白A-Ⅰ在骨转移组表达降低.免疫吸附试验分析显示:骨转移的前列腺癌患者血清中栽脂蛋白A-Ⅰ的表达率显著低于无骨转移的患者.结论 载脂蛋白A-Ⅰ血清淀粉样蛋白A和细胞角蛋白10与前列腺癌骨转移相关,可能作为前列腺癌骨转移的诊断或预测标志.
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视网膜色素上皮细胞蛋白质组学研究中二维电泳条件的优化
目的:优化并确立一套适合视网膜色素上皮细胞二维电泳的实验方法.方法:提取视网膜色素上皮细胞可溶性蛋白,改进条件以确立对视网膜色素上皮细胞蛋白进行二维电泳的实验流程.结果:该实验条件对视网膜色素上皮细胞蛋白达到了良好的分离效果,并能通过分析找出正常与病变细胞蛋白表达差异.结论:该优化的实验流程能有效分离视网膜色素上皮细胞蛋白质,并为进一步的差异蛋白质组研究奠定基础.
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脑梗死肝阳化风证患者外周血淋巴细胞凝胶图谱分析
目的 建立脑梗死肝阳化风证高分辨率的二维凝胶电泳图谱,从蛋白质组学角度探讨脑梗死中医肝阳化风证的本质内涵.方法 设脑梗死肝阳化风证组、健康人对照组、脑梗死阴虚生风证对照组3组,取外周静脉血分离淋巴细胞提取蛋白质,经双向凝胶电泳,考马斯亮蓝染色获取凝胶图谱,PDQuest V7.3.1软件比较分析3组图谱并识别差异表达蛋白质点.结果 建立了脑梗死肝阳化风证、健康人组、脑梗死阴虚生风证患者外周静脉血淋巴细胞2-DE图谱,分别获得蛋白质点459个,552个,644个;通过分析比较,发现了脑梗死肝阳化风证与阴虚生风证的相同蛋白质点8个,差异蛋白质点23个.结论 提示相类证有共同的物质基础,同病异证有不同的本质内涵,为进一步研究中医肝阳化风证本质内涵奠定了科学基础.
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蛋白质组与蛋白质芯片
蛋白质组研究目的在于从蛋白水平阐明基因的功能,这对于探索生命的奥秘具有重要的意义.蛋白质芯片是近年来兴起的一种强有力的高通量研究方法,能够一次平行分析成千上万的蛋白样品,具有很高的敏感度与准确性.它将成为蛋白质组学研究中的强有力的研究方法,并终架起基因组学与蛋白质组学的桥梁.
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近致死量照射CNE1后存活克隆生物学性状初步分析
目的 放疗后残存癌细胞重新克隆是鼻咽癌放疗复发的主要原因,本实验旨在分析照射残存癌细胞的生物学特征.方法 MTT法测定6MV-X射线照射人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1的近致死剂量,用近致死量照射获得残存癌细胞存活克隆,然后用流式细胞仪检测存活克隆与亲本细胞株的细胞周期分布,应用二维电泳和质谱技术分析两者的蛋白质表达改变.结果 用15 Gy近致死量照射CNE1得到了照射存活克隆,并命名为CNE1-15GyR.CNE1-15GyR与亲本细胞株相比:G1/G0期比例增高而G2/M期比例降低;有98个蛋白质表达差异点,其中76个蛋白质斑点上调,22个蛋白质斑点下调;对其中上调的20个蛋白质斑点进行了质谱鉴定,发现细胞间叶来源的中间丝蛋白Vimentin在存活克隆CNE1-15GyR中表达增高.结论 照射筛选的存活克隆CNE1-15GyR与亲本细胞株CNE1相比生物学性状发生了改变,细胞间叶来源的中间丝波形蛋白Vimentin在CNE1-15GyR克隆中表达增高,可能与G1/G0期比例增高有关.
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乳腺癌化学治疗敏感与耐药组织相关蛋白表达差异
目的:研究乳腺癌化学治疗(化疗)敏感及耐药相关蛋白.方法:根据新辅助化疗效果筛选出化疗敏感与耐药组,应用蛋白质组学技术研究两组间的差异蛋白并采用蛋白质印迹方法对部分差异蛋白进行验证.结果:在化疗敏感组及耐药组乳腺癌组织蛋白质谱中找到13种差异蛋白质,其中3种在耐药组上调,10种下调.对其中7种蛋白质进行验证,角蛋白Ⅰ型细胞骨架19(keratin type Ⅰ cytoskeletal 19,KIC19)、胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TYPH)在耐药组表达上调,而热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)、角蛋白Ⅰ型细胞骨架9(keratin type Ⅰ cytoskeletal 9,KIC9)、胶原蛋白α-2(六)链[collagen alpha-2(Ⅵ),CO6A2]、波形蛋白(vimentin,ⅥME)、β肌动蛋白(actin cytoplasmic 1,ACTB)等表达下调,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:KIC19和TYPH可能与乳腺癌化疗耐药相关,而HSP27,KIC9,CO6A2,VIME以及ACTB可能与化疗敏感相关.
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Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药的关系
目的:应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关的蛋白质.方法:以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR为研究对象,应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)技术分离两种细胞的总蛋白,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF)对差异表达的蛋白质点进行鉴定. Western blot验证差异蛋白质的表达水平,反义核酸技术分析差异蛋白与胃癌耐药的关系.结果:可溶性耐药相关性钙结合蛋白(sorcin)在SGC7901/VCR细胞中高表达,反义核酸抑制sorcin表达可增强SGC7901/VCR对长春新碱的化疗敏感性.结论: Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药密切相关.
关键词： 多药耐药性 胃癌 二维电泳 质谱 可溶性耐药相关性钙结合蛋白 -
初诊鼻咽癌患者临床证型与外周血淋巴细胞核蛋白差异表达相关性的初步分析
目的 探讨初诊鼻咽癌患者临床证型与其外周血淋巴细胞核蛋白差异表达的相关性.方法 采用二维电泳差异蛋白质表达鉴别策略,在与健康对照者进行差异表达点鉴别分析的基础上,对不同证候初诊鼻咽癌患者的临床证型与外周血淋巴细胞核蛋白差异表达特点的相关性进行初步探讨.结果 不同证型初诊鼻咽癌患者与健康时照者的外周血淋巴细胞核蛋白二维电泳图谱匹配分析结果表明,不同临床证型存在大量的差异表达蛋白斑点.结论 不同证型初诊鼻咽癌患者外周血淋巴细胞核蛋白具有各自的差异蛋白质表达模式,这些差异蛋白质的功能特性以及与临床证型的病理关联性值得进一步深入探讨.
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STGC3基因表达上调对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响
目的采用蛋白质组学方法,分析STGC3基因高表达对CNE2细胞系蛋白质表达谱的影响.方法应用脂质体转染技术,将pcDNA3.1(+)/STGC3的表达质粒导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选、RT-PCR技术鉴定阳性克隆,建立稳定高表达STGC3的细胞系;采用双向凝胶电泳分离CNE2、pcDNA3.1(+)/CNE2和pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的总蛋白质,图像扫描后用Image Master软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质点.结果 CNE2、pcDNA3.1(+)/CNE2和pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的蛋白质点分别为675±27、660±23和662±18个,蛋白质点主要分布在等电点为3.5～8.5、分子量为22～80 kD的范围内.去除空白载体所致的蛋白质的差异后,在pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系中,确立了15个上调的蛋白质点和8个下调的蛋白质点.结论 STGC3基因高表达能引起鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变,此结果为进一步研究STGC3基因的抑瘤分子机制提供了很好的实验资料.
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蛋白质组学研究进展
本文综述了蛋白质组学的发生发展概况、蛋白质组学的研究内容、蛋白质组研究的方法及其进展,列举了蛋白质组学研究的常用数据库及其一些应用.
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采用蛋白质组分析高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的影响
目的研究腹透液中葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMCs)分泌蛋白质影响,并采用蛋白质组学方法分析其对腹膜纤维化和腹膜功能的影响.方法采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离HPMCs,第3代用于实验.实验分组:对照组(F12培养基)和高糖组(F12培养基+4%葡萄糖),分别观察24 h和48 h.经二维凝胶电泳(2-DE)分离人腹膜间皮细胞总蛋白,每组重复3次,PDQuest图象分析软件比较对照组和高糖组平均凝胶,求差异蛋白质.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质.结果获得12块经2-DE分离的分离胶,每组3块.通过PDQuest图象分析软件发现24 h高糖组与对照组比较有27种蛋白质表达有差异(P＜0.05);48 h高糖组与对照组比较有50种蛋白质的表达有差异(P＜0.05),表达上调有22个蛋白质斑点,表达下调有55个蛋白质斑点;对其中23个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出23种蛋白质,其中有2个点为同一蛋白质.这些蛋白质涉及到高糖对HPMCs的细胞骨架、糖代谢、黏附、细胞因子、抗氧化剂、表面活性剂等物质的调节.结论高糖导致腹膜纤维化是多因素、多途径,要防止腹膜透析腹膜纤维化保护腹膜透析效能,好避免过多使用高糖透析液.
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人脑星形胶质细胞瘤恶性程度相关蛋白表达谱的分析与鉴定
目的 应用蛋白质组学技术确定与人脑星形胶质细胞瘤恶性程度相关的差异表达蛋白质分子. 方法 二维电泳技术比较分析12例正常脑组织和52例不同恶性程度星形胶质细胞瘤组织(Ⅱ级23例、Ⅲ级15例、Ⅳ级14例)差异表达蛋白质斑点,高效液相色谱-电喷雾(ESI)串联质谱技术、生物信息学方法分析鉴定与恶性程度相关的差异表达蛋白质分子. 结果 共鉴定出15种差异表达的蛋白质分子,其中热休克蛋白27、抑制素、葡萄糖调节蛋白78、过氧化物氧化酶1、过氧化物氧化酶6、膜联蛋白Ⅱ、组织蛋白酶D、纤溶酶原激活物抑制剂-1、肌动蛋白(胞浆型1)、谷胱甘肽S-转移酶M这10种蛋白的表达在Ⅲ级和Ⅳ级星形胶质细胞瘤组织中升高,二硫键异构酶A3、αB晶体蛋白质、T复合体蛋白1(ε亚单位)、泛素C-末端水解酶同T酶L1、胶质纤维酸性蛋白这5种蛋白的表达降低. 结论 蛋白质组学技术可有效鉴定与肿瘤恶性程度相关的差异表达蛋白,为星形胶质细胞瘤的分子个体诊断和分子靶向治疗提供实验依据.
