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甲羟戊酸激酶基因真核及shRNA表达载体构建及其对BxPC-3细胞周期蛋白表达的影响
目的 构建甲羟戊酸激酶( MVK)基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响.方法 从BxPC-3细胞中提取总RNA, 逆转录PCR ( RT-PCR)法获得目的基因 MVK 以及通过化学合成 MVK (751~779)和 MVK(1 089~1 117)位点寡核苷酸片段,构建真核表达及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞,筛选稳定表达细胞系.Western blot法分析转染后对BxPC-3细胞周期蛋白的影响.结果 成功获得MVK基因真核表达( pcD-NA3. 1-mvk)及两个针对 MVK shRNA 表达载体( piLenti-RNAi-shRNA1/2). 通过抗生素筛选及Western blot分析获得了稳定的MVK过表达及低表达细胞株. Western blot分析显示:过表达MVK的细胞株及MVK knockdown的细胞株中细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表达量与正常及对照细胞相比均显著降低. 结论 MVK过表达及低表达均抑制Bx-PC-3细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表达.
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沉默 Piwil2表达对子宫颈癌细胞增殖和衰老的影响
目的：采用 shRNA 沉默 Piwil2基因的表达，探讨其对宫颈癌细胞株增殖和衰老特性的影响。方法通过脂质体 Lipofectamine2000转染技术和嘌呤霉素筛选，建立稳转Sh-piwil2宫颈癌细胞株，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和 Western blot 法验证沉默效果。采用细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期和细胞衰老等实验观察沉默 Piwil2表达对宫颈癌细胞生物学特性的影响。结果建立稳定转染 Sh-piwil2宫颈癌细胞株，与对照组相比，沉默Piwil2表达后细胞的增殖和集落形成能力均显著降低(P <0．05)；细胞 G0/ G1期比例增加、S 期比例明显下降( P <0．05)，同时沉默 Piwil2后细胞衰老数量明显增多( P <0．05)。结论沉默 Piwil2基因可发挥抗宫颈癌作用，推测Piwil2基因可作为宫颈癌临床治疗的一个潜在靶点。
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稳定沉默Raptor表达的前列腺癌DU145细胞株的构建
目的 应用RNA干扰技术降低前列腺癌DU145细胞株Raptor基因表达水平,并建立稳定转染细胞株.方法 针对Raptor基因设计合成siRNA,鉴定、测序正确后转染293T细胞观察基因表达情况；构建Raptor-shRNA慢病毒载体；进行Raptor-shRNA慢病毒包装及滴度测定；筛选稳定表达Raptor-shRNA的前列腺癌DU145细胞株；Western blot检测稳定转染细胞中的Raptor表达水平.结果 Raptor-shRNA成功转染前列腺癌DU145细胞后,通过嘌呤霉素筛选,获得了Raptor基因沉默的DU145细胞株,Western blot检测证实该细胞株的Raptor表达水平明显低于对照组(P＜0.01).结论 成功构建稳定沉默Raptor表达的前列腺癌DU145细胞株,为后续研究奠定了基础.
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细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定
目的 设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能.方法 根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Real time RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果 成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平.结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达.成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础.
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日本血吸虫Mago nashi基因RNA干扰系统的构建及鉴定
目的 构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体.方法 设计及化学合成日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的短发夹结构的寡核苷酸,通过退火成双链DNA片段,将其与经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPER质粒连接,构建表达shRNA的重组质粒.结果 经酶切及测序证实针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体pSUPER构建成功.结论 成功构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体,为进一步研究对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因RNA干扰作用及该基因功能奠定基础.
关键词： 日本血吸虫 Mago nashi样蛋白 RNAi siRNA shRNA -
SARS-CoV S基因的克隆及其shRNA表达载体的构建
目的构建绿色荧光蛋白与SARS-CoV S基因的融合表达载体pEGFP-C1-S及针对SARS-CoV S基因的shRNA表达载体pshRNA-S,以观察shRNA对SARS-CoV S蛋白表达的影响.方法人工合成SARS-CoV S基因片段及其shRNA引物,两端设计酶切位点,分别与载体pEGFP-C1和pTZU6+1连接,转化大肠杆菌DH-5а和JM109,酶切及测序鉴定. 结果酶切电泳显示pEGFP-C1-S插入片段大小为1 416bp,测序结果显示pshRNA-S中插入的shRNA引物序列正确.结论成功构建融合表达载体pEGFP-C1-S 及针对SARS-CoV S基因的shRNA表达载体pshRNA-S.
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shRNA沉默RAGE基因对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢的影响
目的 研究RAGE基因在骨性关节炎形成中的作用,探讨其对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢的影响.方法 通过构建RAGE基因的shRNA表达载体,沉默RAGE基因在骨性关节炎SD大鼠软骨细胞的表达,采用Western blot分别检测空白对照组、空载组、shRNA沉默组中RAGE、p-p38 MAPK、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白水平.结果 与空白对照组和空载组(Rc)相比,R1、R2、R3、R4的RAGE、p-p38MAPK、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表达水平显著下降(P<0.05);RAGE、p-p38MAPK和MMP-13的蛋白水平在空白对照组和空载组(Rc)间差异无统计学意义;RAGE、ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白水平在空白对照组和空载组(Rc)间差异有统计学意义(P<0.05)结论 shRNA沉默RAGE基因表达对骨性关节炎SD大鼠软骨细胞外基质代谢有明显的抑制作用.
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低氧诱导因子-1α对Jurkat细胞端粒酶逆转录酶影响的研究
目的 探讨RNA干扰白血病细胞株Jurkat低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的影响,并检测其对端粒酶活性、细胞增殖及凋亡的影响,为白血病的基因治疗提供理论基础.方法 构建人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染白血病细胞株Jurkat;采用RT-PCR方法检测Jurkat细胞HIF-1α及hTERT mRNA表达水平;EIESA法检测端粒酶的活性,流式细胞术分析转染后Jurkat细胞的细胞周期和凋亡率.结果 成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染Jurkat细胞后,与空质粒组相比,pshRNA HIF-1α可有效抑制Jnrkat细胞HIF-1α及hTERT基因表达;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于空质粒组(P＜0.05),Jurkat细胞增殖活性显著降低.结论 成功构建HIF-1α的shRNA表达质粒,转染Jurkat细胞后能表达shRNA,干扰效果明确,目的基因的表达明显下降,从而可以抑制白血病细胞Jurkat的增殖,促进凋亡.
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RNA干扰技术在胚胎干细胞研究中的应用
RNA干扰是外源性或内源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制,该技术在生物学研究中有着广泛的应用前景.近将RNA干扰技术应用于胚胎干细胞的研究取得了显著效果,为胚胎干细胞的研究开辟了一条新途径.本文简述了RNA干扰技术的作用机制、在胚胎干细胞研究中的试验方法等新进展.
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shRNA结合131I-免疫脂质体抑制胶质瘤细胞U251增殖的初步研究
目的 探索RNA干扰与131I-免疫脂质体联用在胶质瘤疾病治疗中的潜在价值.方法 在合成pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA表达载体的基础上,结合核素内放射性131I免疫脂质体,进行细胞实验探索其对胶质瘤细胞U251增殖凋亡的影响.结果 成功构建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢ-shRNA载体;同时细胞实验结果显示,shRNA和131I免疫脂质体联用有效抑制胶质瘤细胞U251增殖和促进其凋亡,抑制率达70％.结论 shRNA结合131I免疫脂质体能高效地促凋亡和抑制细胞增殖,为其在胶质瘤治疗中的应用奠定了初步基础.
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SiRNA特异性抑制cyclin D1的表达及其shRNA表达质粒的构建
目的研究siRNA (small interfering RNA)对cyclin D1基因表达的抑制作用及shRNA表达质粒的构建.方法化学合成针对cyclin D1基因的siRNA,转染MCF-7细胞株;分别应用荧光定量PCR和免疫印迹检测cyclin D1 mRNA和蛋白的表达;合成特异性cyclin D1的RNA干扰寡核苷酸序列,采用克隆技术,将其插人Psilencer2.1-U6质粒表达载体,构建cyclin D1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体.结果化学合成的siRNA转染MCF-7细胞,48 h 后cyclin D1基因和蛋白表达都明显降低;构建特异性针对cyclin D1的shRNA 表达质粒,酶切和测序结果显示,siRNA片段已成功插入Psilencer2.1-U6载体,载体构建成功.结论 siRNA可以有效抑制MCF-7细胞株中cyclin D1的表达,并成功构建其shRNA表达质粒.
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Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建
目的:构建存活素(Survivin)基因短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础.方法:设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1.0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析.结果:酶切鉴定和测序结果证实构建成功.结论:survivin shRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础.
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CIP2A靶向干扰质粒对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响
目的 用RNA干扰技术沉默人乳腺癌MCF-7细胞中CIP2A基因的表达,观察细胞增殖、 迁移和侵袭能力的变化.方法 检测人乳腺癌MCF-7细胞中CIP2A表达水平;将4种不同序列的CIP2A shRNA质粒以及含与CIP2A无关序列的CIP2A shRNA NC分别转染MCF-7细胞,48h后qPCR检测其CIP2A表达水平,筛选CIP2A基因沉默效果好的shRNA质粒干预MCF-7细胞;通过MTT检测shRNA干扰质粒对MCF-7细胞增殖能力的影响,划痕实验检测其对MCF-7细胞迁移能力的影响、Transwell体外侵袭实验检测沉默CIP2A基因对MCF-7细胞侵袭能力的影响.结果 qPCR检测MCF-7细胞阳性表达CIP2A基因,用lipofiter成功将不同CIP2A shRNA质粒转染入MCF-7细胞;qPCR检测发现CIP2A shRNA2质粒沉默MCF-7细胞CIP2A表达效果显著,随后用CIP2A shRNA2质粒干扰MCF-7细胞,MTT检测显示转染CIP2A shRNA2质粒组MCF-7细胞增殖能力小于空白对照组;转染CIP2A shRNA2干扰质粒的MCF-7细胞迁移能力和侵袭能力较空白对照组低.结论 CIP2A shRNA质粒能明显降低人乳腺癌MCF-7细胞内的CIP2A基因表达,并抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力.
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Mfn2基因shRNA质粒的构建及其流体力学转染技术的实验研究
构建线粒体融合素基因2(Mfn2)短发卡RNA(Mfn2shRNA)表达质粒,观察流体力学注射法对绿色荧光蛋白器官靶向性.根据Mfn2基因序列,挑选1条目标基因序列和1条非特异性基因序列,构建质粒重组体并测序及鉴定.将24只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、阴性对照组和转染组(n=8),阴性对照组和转染组分别通过尾静脉快速注入阴性对照质粒(HK)和Mfn2shRNA质粒溶液1.5 ml.24 h后采集肝脏、心脏、肌肉、肾脏组织冰冻切片,荧光显微镜下观察,并取血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度.结果表明:质粒HK和Mfn2shRNA构建成功;流体力学注射后,肝脏、心肌及肾脏可见绿色荧光蛋白的表达;与正常对照组比较,阴性对照组血清ALT、AST有明显差异,转染组血清ALT、AST较正常对照组及阴性对照组明显升高.Mfn2shRNA质粒载体的成功构建,流体力学肝脏靶向性的基因转染方法,为活体内研究Mfn2功能提供了可靠的材料和方法.
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HIF-1α介导缺氧环境下肝癌Bel-7402细胞自噬的激活
目的:探讨缺氧环境肝癌细胞自噬的激活与HIF-1 α的关系.方法:将肝癌Bel-7402细胞分为常氧组、缺氧+Con shRNA组和缺氧+HIF-1 α shRNA组,将慢病毒介导的HIF-1 α shRNA转染细胞,继续培养36 h,Western blot检测HIF-1 α蛋白表达;吖啶橙(AO)荧光染色检测自噬溶酶体的形成,丹酰尸胺(MDC)荧光染色检测自噬小体的形成,并应用流式细胞技术定量自噬溶酶体或者自噬小体的荧光强度;Western blot检测自噬激活的标志蛋白LC3-Ⅱ表达.结果:慢病毒介导的HIF-1 αshRNA降低了缺氧诱导的肝癌细胞中HIF-1 α蛋白的生成(缺氧+HIF-1 α shRNA组vs缺氧+ConshRNA组,P＜0.01),HIF-1 α降低后,细胞中自噬小体及自噬溶酶体明显减少(缺氧+HIF-1 αshRNA组vs缺氧+Con shRNA组,P＜0.01),自噬激活标志蛋白LC3-Ⅱ明显减少(缺氧+HIF-1 αshRNA组vs Con shRNA组,P＜ 0.01).结论:缺氧环境下HIF-1 α介导了肝癌细胞自噬的激活.
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组织蛋白酶S表达降低致肝癌细胞凋亡的机制研究
目的:探讨组织蛋白酶S (Cathepsin S,CatS)表达降低后肝癌细胞凋亡的影晌及其机制.方法:选择2种肝癌细胞系MHCC97-H、Bel-7402,将肝癌细胞分为对照组、Con shRNA组、Cat SshRNA组.慢病毒介导的Cat S shRNA转染肝癌细胞48h后,Western blot检测Cat S表达变化;Annexin V/PI双染流式测细胞凋亡;Western blot检测内源性凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化;Western blot检测外源性凋亡相关蛋白Fas、Fas-L表达变化.结果:在肝癌细胞MHCC97-H、Bel-7402中,Cat S shRNA可显著降低肝癌细胞中Cat S表达(P＜0.01);Cat S表达降低后,凋亡细胞显著增多(P＜0.01);内源性促凋亡蛋白Bax表达升高(P＜0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P＜0.01);外源性促凋亡蛋白Fas-L表达明显增强(P＜0.01),Fas表达无明显变化(P＞0.05).结论:Cat S可同时通过内源性及外源性凋亡途径对肝癌细胞的凋亡进行调控.
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靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响
目的:探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响.方法:合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA(shRNA)的双链寡核苷酸并构建pSilencer2.1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察.结果:neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中.通过RT-PCR及western blot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68.9 ％和61.3％.细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓(P＜0.01).流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少.DNA ladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多.结论:靶向survivin的 shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体处抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础.
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RNAi沉默CD147基因对卵巢癌细胞HO-8910pm生物学行为的影响
目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi) 技术,利用构建的稳定转染CD147 shRNA 表达质粒载体的HO-8910pm/pGE-1 CD147shRNA细胞株观察卵巢癌细胞系HO-8910pm CD147基因的沉默作用及生物学效应.方法:用免疫细胞化学法、激光共聚焦检测HO-8910pm细胞CD147的表达;MTT法绘制细胞生长曲线,观察裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的成瘤性.结果:pGE-1CD147shRNA转染人卵巢癌细胞系后,CD147的表达受到高效且特异的抑制,细胞侵袭力减弱,荷瘤裸鼠成瘤力下降,抑瘤率达58.8%(P<0.01).结论:RNAi沉默CD147基因可影响卵巢癌的侵袭和成瘤,有可能成为治疗卵巢癌的新途径.
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靶向 survivin shRNA 在肿瘤治疗中的研究进展
生存素在细胞凋亡抑制中起重要作用，越来越多的研究者将其作为肿瘤基因治疗的理想靶点。应用 RNA 干扰技术靶向抑制生存素的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。
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GALNT12 对急性髓系白血病细胞生长影响的研究
目的 探索GALNT12的表达对急性髓系白血病细胞生长的影响.方法 通过对数据库中急性髓系白血病(AML)病人相关数据进行分析,明确GALNT12 mRNA的表达水平与AML病人的生存率之间的关系.构建GALNT12shRNA慢病毒载体并包装GALNT12shRNA慢病毒,以此为工具构建GALNT12沉默的白血病THP-1细胞系.采用杂乱序列(shScramble)的慢病毒感染的THP-1细胞系做对照,进而观察GALNT12沉默的白血病THP-1细胞和shScramble的慢病毒感染白血病THP-1细胞生长的差异.采用流式细胞分选术收集GFP阳性细胞并用于观察GALNT12对 AML细胞生长的影响.结果 对三个数据库中AML病人的数据进行统计分析结果显示,GALNT12的表达与AML患者的生存周期呈显著的负相关;且GALNT12在急性髓系白血病THP-1细胞系中高表达.本研究成功构建了GALNT12沉默的白血病THP-1细胞系. 研究发现,GALNT12 shRNA1干扰的THP-1细胞与shScramble相比,生长速度明显减慢.结论 本研究证实GALNT12的表达能够促进急性髓系白血病细胞的生长,有利于急性髓系白血病的发生发展,也为寻找治疗急性髓系白血病的有效分子靶点增添了新的内容.
