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一种荧光细胞标准计数样片的制备与应用
目的 制备一种用于自动荧光显微分析系统质量控制的荧光细胞标准计数样片.方法 利用定制的带有黑色方框的载玻片做载体,载玻片表面使用多聚赖氨酸进行防脱处理后,将一定数量荧光标记的人上皮细胞固定在黑色方框内,然后滴加甘油,后在四周添加中性树胶封片剂后盖上盖玻片封存.以此方法制得不同细胞浓度的标准样片,用于自动荧光显微分析系统的准确性、精密度和复现性测试.结果 制备了空白对照、阳性样片A、阳性样片B三种规格的荧光细胞标准计数样片.该系列标准样片经过计量机构检测确认后的结果为真值,用该系列标准样片上机检测,计算得出自动荧光显微分析系统对阳性样片A和阳性样片B的分析准确性分别为98.96％和97.96％;分析精密度分别为1.92％和2.00％;分析复现性误差分别为0.34％和1.33％.结论 设计的荧光细胞标准计数样片性能可靠,可作为自动荧光显微分析系统的成品质控测试工具.
关键词： 荧光细胞标准计数样片 自动荧光显微分析系统 循环肿瘤细胞 荧光标记 质量控制 -
河南汉族人群 Penta E基因座的群体遗传学与法医学应用评价
目的：通过对河南汉族无关个体常染色体的短串联重复序列（STR）基因座的遗传多态性的调查，了解相应群体遗传学数据在法医学应用中的意义。方法在河南随机选取1000例无血缘关系个体，提取静脉血 DNA，用 GoldenEye_20A 荧光标记复合系统进行检验，得到 STR 分型后，用相关软件进行统计分析并计算法医学应用参数。结果河南地区汉族群体 Penta E 基因座发现27个等位基因，其基因型分布符合 Hardy-Weiberg 平衡（P>0.05）。其个人识别能力（DP）和非父排除率（PE）为0.957和0.835。结论Penta E 基因座在群体遗传学研究和法医学个人识别中有较高的应用价值。
关键词： 河南汉族 短串联重复序列 Penta E基因座 群体遗传 荧光标记 -
赤芍中护肝活性物质的筛选与鉴定
目的:建立中药潜在护肝活性物质快速筛选新方法,辨识赤芍内具有护肝活性的化学成分.方法:在半乳糖胺HepG2细胞损伤模型上,采用二乙酸荧光素荧光标记法和MTT法筛选赤芍中具有护肝活性的组分,使用色谱-质谱联用技术分析其化学组成,并对筛选出的赤芍护肝活性成分进行实验验证.结果:从赤芍中筛选发现具有明显护肝活性的化学组分3个,并分析鉴定出芍药苷、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯3个成分.验证实验表明,这3个化合物对HepG2细胞均具有较明显的保护作用.结论:赤芍所含的芍药苷、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯具有潜在的护肝活性.
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泽泻中肾毒性成分的辨析研究
目的:研究筛查泽泻中肾毒性成分,为提升其质量控制标准提供科学依据.方法:使用高压制备色谱分离和制备泽泻化学组分样品;基于LLC-PK1细胞模型,用FDA荧光标记和MTT 2种方法筛查肾毒性组分;对毒性明显的化学组分进行液-质联用定性分析.结果:MTT法与FDA荧光标记法检测结果基本一致,FDA法检测泽泻中C13组分呈明显的毒性,经液-质联用分析鉴定为泽泻醇C,16,23-环氧泽泻醇B和泽泻醇O.结论:泽泻中泽泻醇C,16,23-环氧泽泻醇B和泽泻醇O可能会引起肾毒性,应注意限量控制.
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复制型埃博拉病毒样颗粒的表达和鉴定
为了研究埃博拉病毒的生物学特性及其与宿主的相互作用,构建无致病基因的复制型埃博拉病毒样颗粒(Transcription and replication competent virus-like particles,trVLPs)成为在BSL-2实验室中进行研究的理想途径.本研究目的是表达和鉴定复制型埃博拉病毒样颗粒(trVLPs).本研究利用埃博拉病毒7个蛋白的基因组片段(VP40、VP24、GP、VP35、VP30、L、NP)和一个报告基因片段重组构建了表达质粒,瞬时转染293T细胞,通过荧光素酶检测系统测定报告基因的表达活性确定了复制型埃博拉病毒样颗粒(trVLPs)的成功表达.进一步通过超离转染细胞的上清纯化得到病毒样颗粒(trVLPs),在透射电子显微镜下观察到了典型的丝状结构.对病毒样颗粒进行荧光标记并感染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到细胞中出现点状和丝状的荧光信号.复制型埃博拉病毒样颗粒的成功表达为进一步研究埃博拉病毒的生物学特性以及与宿主相互作用机制提供了基础.
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2型糖尿病患者肝脂肪酶基因标签单核苷酸多态性与血脂水平分析
观察汉族人群肝脂肪酶(HL)基因2个标签单核苷酸多态性(SNP)与2型糖尿病(T2DM)及血脂代谢的相关性.应用荧光标记单碱基延伸分型技术及寡核苷酸微阵列芯片杂交技术检测HL基因rs 12462668和rs10426971多态性.用全自动生化分析仪检测CHO、TG、HDL-C、LDL-C、载脂蛋白Al( ApoAl)及载脂蛋白B(ApoB).结果表明:T2DM组rs12462668的AA、GG基因型频率、等位基因频率及由2个SNP构建的单倍型频率与对照组比较差异有统计学意义.T2DM组的TG和ApoB显著高于对照组,HDL-C和ApoA1显著低于对照组.组间各基因型血脂水平比较结果显示,2个SNP与TG、HDL-C和ApoAl代谢紊乱有关.组内各基因型间血脂水平比较结果显示,T2DM患者的HDL-C水平与rs12462668多态性有关,而TG水平与rs10426971多态性有关.这提示HL基因的2个标签SNP与T2DM的发生密切相关,并可影响血脂的代谢.
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基因芯片技术及其在药学领域的应用
1 引言1995年,Schena[1]在
杂志上发表文章,他把拟南芥菜植物的cDNA文库中的48个cDNA用PCR方法扩增后,把PCR产物固化在玻璃片上,制成基因芯片(DNA microarray,也称DNA芯片).然后从拟南芥菜的不同组织中提取mRNA 反转录得到带荧光标记的cDNA,把不同组织来源的 cDNA混合后与玻璃片上的DNA进行杂交,用荧光双通道扫描系统对杂交点的荧光信号进行扫描分析,得到了拟南芥菜不同组织中基因的表达情况.自Schena的成功报道后,短短四﹑五年时间,有关基因芯片技术的研究与应用的报道已大量出现在多种新闻与学术媒体中. -
猪卵巢卵母细胞体外成熟及体外受精过程中皮质颗粒变化的研究
目的研究猪皮质颗粒在体外成熟及体外受精过程中的变化,以及皮质颗粒与多精受精的关系. 方法用异硫氰荧光素联接的花生四烯酸(FITC-PNA)标记体外成熟不同时间及体外受精不同时间皮质颗粒. 结果皮质颗粒在猪卵母细胞体外成熟过程中逐渐由皮质部向卵质膜下迁移,并在质膜下排布成单层.体外成熟过程中所排出的第1极体也被FITC-PNA所标记,说明第1极体中含有皮质颗粒.在对不同体外成熟时间的卵母细胞进行授精时发现,皮质颗粒的释放速度与体外成熟时间呈正比例关系.为进一步证实皮质颗粒的排放速度与多精受精之间的关系,还进行了精子穿透实验.结果显示,体外成熟48h的卵母细胞其多精受精率为73%,比体外成熟36h(83%)、24h(80%)的卵母细胞要低.并且进入卵子的精子数目(1.7)比后两者(分别为3.1和2.9)的少. 结论多精受精率与皮质颗粒释放的速度和数量的大小有关.
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移植骨髓基质细胞在脊髓内存活、迁移及分化
为探讨骨髓基质细胞移植入脊髓后的存活、迁移及分化情况,实验首先应用核荧光标记培养的骨髓基质细胞,通过显微注射技术从背侧将骨髓基质细胞移植入正常SD大鼠脊髓内,分别于1d和14d处死大鼠,髓组织切片,光显微镜下观察骨髓基质细胞的存活、迁移情况,用神经元特异性烯醇化酶(neur-specific enolase,NSE)抗体及胶质纤维酸性蛋白(gliel fibrillary acid protein,GFAP)抗体染色,观察骨髓基质细胞向神经元及胶质细胞分化的情况.
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NT-3基因修饰施万细胞与神经干细胞联合移植治疗全横断脊髓损伤的实验研究
为探索一种治疗急性脊髓损伤的新策略,本实验先用核荧光标记培养的神经干细胞(NSCs);再用含神经营养素-3基因的腺病毒(AdvNT-3)感染培养的施万细胞(SCs),简称NT-3-SCs.然后建立大鼠全横断脊髓损伤模型,向损伤处分别移植NSCs、SCs+NSCs和NT-3-SCs+NSCs.所有动物存活60d后,进行爬网格测验和BBB评分.接着在脊髓横断处远端组织内注射荧光金(FG),动物再存活7d.在处死动物前检测皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质体感诱发电位(CSEP).
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量子点荧光探针在生物成像中的应用进展
量子点荧光探针是近几年发展起来的一种新型荧光标记物,拥有荧光染料及荧光蛋白所不能比拟的独特优势,已经在细胞功能研究及细胞表面和内部功能分子的探测、组织的成像和病灶的定位等方面得到了较为广泛的应用.本文对量子点的光学特性、生物化修饰及其在生物成像等方面的应用进展进行了较为详细的介绍,并展望了其应用发展.
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量子点荧光标记及其应用
量子点(quantum dot,QD)又称为半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal),是一种由Ⅱ-Ⅷ或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒,直径约1～100 nm.在激发光的诱导下,量子点会产生荧光.一、量子点的基本特性
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现代免疫细胞化学和荧光图像技术
近20年来,生命科学、计算机科学、物理学、化学、生物信息学取得了巨大进步.人们已经可以表达、合成和突变体内的各种蛋白及其片段;已经可以随心所欲的制备出数以万计的抗各种天然蛋白、突变蛋白、翻译后经各种修饰(磷酸化、甲基化、乙酰化等)的蛋白、各种蛋白亚区、不同基序的抗体以及标记不同的细胞器的特异性抗体;已经可以合成许多稳定性好,不易淬灭,不受pH环境影响,水溶性好,发射光谱特异,适于多重标记的有机荧光色素,如分子探针Alexa Fluor系列[1]、Amersh的Cy系列[2]以及其他活体荧光标记分子;如FIAsH,ReAsH等二砷荧光色素[3]和O6-苯基鸟嘌呤荧光素(BGFL)[4],纳米量子颗粒(quantum dot)[5, 6]和荧光蛋白(GFP)[7]等;共聚焦扫描显微镜、全内反射荧光显微镜[8,9]及其他三维、四维荧光显微镜[10,11]和荧光图像数字图像系统的出现,又大大提高了对荧光信号的感知水平,即可感知细胞内低丰度(甚至单个分子)的标记荧光,其时间分辨率已可达微秒水平,其空间分辨率亦可与电镜匹敌[12].
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石蜡包埋组织HE染色切片的短串联重复序列荧光标记复合扩增
短串联重复序列(short tandem repeats,STR)的复合扩增是病理组织进行个体识别的常用技术.我们对石蜡包埋组织HE染色切片的STR荧光标记复合扩增进行实验研究,现报道如下.
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GFP标记Ⅸ蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定
目的 为了更加直观地观察腺病毒(Adenovirus,Ad)与细胞之间的相互作用,本研究拟构建一株经绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记(pⅨ)蛋白的5型重组腺病毒(Ad5-IXGFP).方法 我们将GFP基因构建至腺病毒穿梭质粒pShuttle中Ⅸ基因3'端,通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内的同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXGFP.将pAd5-IXGFP质粒经Pac Ⅰ酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒Ad5-IXGFP.结果 经扩增和超速离心纯化后可获得浓度为6.9×1011 vp/ml的重组腺病毒.该病毒于4℃与HEp-2细胞孵育后,重组病毒吸附于HEp-2细胞表面,用荧光显微镜观察,可见绿色荧光.结论 利用反向遗传学技术对重组腺病毒外壳蛋白pⅨ进行修饰,成功制备的经GFP标记的重组腺病毒可用于实时动态追踪腺病毒颗粒感染细胞的过程.
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HIV-1G亚型基因芯片的制备与杂交分析
基因芯片技术是一种高效、敏感、平行化的基因检测分析新技术[1],对临床疾病的诊断技术将产生革命性的影响,目前主要集中在感染性病原基因的检测方面.我们尝试将该技术应用于人免疫缺陷病毒(HIV)基因的检测与分型.首先制备HIV基因组探针并分别进行分析,实验中我们采用一种基因显示新技术:限制性显示(restriction display,RD-PCR)[2,3],制备HIV-1G亚型基因探针,并用基因芯片荧光标记杂交的方法对这些探针进行了杂交分析,为基因芯片技术在HIV感染检测的应用中奠定了基础.
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全自动荧光标记DNA测序法检测利福平耐药结核杆菌rpoB基因突变
为研究我国分离的结核杆菌临床分离株利福平(Rifampin,RFP)耐药表型与rpoB基因突变的关系,应用全自动荧光标记DNA测序方法对7株RFP耐药株及1株RFP敏感株的rpoB基因突变集中区域进行了序列分析,并与欧美日文献报道结果做了对比.
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血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定
为评估HIV抗体阴性HIV感染高危人群潜在的HIV传播性，本研究对来自德国的38例HIV抗体阴性的静脉药瘾者肝组织样品进行常规DNA抽提，用HIV不同结构区(gag,pol,env)6对引物同时扩增HIV DNA。结果发现38例肝组织中有30例在HIV gag区(M667/sk03c,M661/sk01c)发生特异性扩增。10例对HIV env区(env526/C02,envC01/571K)发生特异性扩增。进一步分析发现38例中有3例同时在gag、pol、env 3个区域产生特异性扩增，12例分别对HIVgag和pol区或gag、env区产生特异性扩增，17例产生单一gag或pol或env特异性扩增，6例在gag、pol、env区均阴性。对env阳性的部分标本经荧光标记自动测序仪测序并与国际HIV标准株比较，其感染HIV株与欧美B亚型同源性为86%。此研究提示，抗HIV阴性的静脉药瘾者为潜在HIV感染的高危人群，加强对这类人群“窗口期”的监测，对预防HIV的传播有重要意义。
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载超顺磁性氧化铁和DiI荧光高分子微球巨噬细胞MR成像
目的 制备载超顺磁氧化铁(SPIO)纳米粒和DiI荧光高分子微球(DiI-SPIO-PLGA),探讨其作为MRI对比剂体外巨噬细胞成像的效果和作为荧光示踪剂体外示踪巨噬细胞的可行性.方法 采用双乳化法制备DiI-SPIO-PLGA微球,并检测其理化性质.培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,与DiI-SPIO-PLGA微球共孵育12 h后行普鲁士蓝染色和荧光显微镜观察,将吞噬了微球的细胞和空白细胞分别重悬于0.5 ml 1％琼脂糖Eppendof管中,行MR扫描.结果 所得样品为外壳装载SPIO颗粒和DiI荧光的微球,粒径(868.00士68.73)nm.普鲁士蓝染色结果显示,几乎所有细胞内都有蓝染颗粒分布,部分区域聚集成堆；倒置荧光显微镜F可见细胞内有大量红色微球.MRI显示吞噬了DiI-SPIO-PLGA微球的实验组管内信号显著降低,管内信号值/背景信号值明显低于对照组(P＜0.05).结论 DiI-SPIO-PLGA微球能有效加强MR成像效果,荧光信号强烈,可同时作为MRI阴性对比剂和荧光示踪剂.
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荧光原位杂交技术在尿路上皮肿瘤诊断中的作用
荧光原位杂交(FISH)技术是一种使用荧光标记的DNA探针评估细胞基因改变的技术,其依据为癌症是一种基因缺陷性疾病,大多数癌症伴有染色体的异常改变,采用FISH技术可检测到这些异常改变.目前美国食品药品管理局(FDA)已批准的通过尿液诊断膀胱癌的技术中,包括BTA、NMP22、ImmunoCyt以及FISH等,灵敏度和特异性高的是FISH.
