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mdr1和GSTπ基因缄默逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究
目的研究短发夹状小分子干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02 mdr1和谷胱甘肽S-转移酶(GST)π基因的表达和功能的影响.方法根据mdr1mRNA第79～99位和GSTπ mRNA第308～327位核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的shRNA,克隆入pSilencer2.1-U6 neo,克隆产物为pSilence-mdrl和pSilence-GSTπ,转染K562/A02细胞株.用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπ mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50).结果经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞mdr1 mRNA表达量下降了71.5%,从(2.80±1.65)×108拷贝/μgRNA下降至(3.90±2.37)×107拷贝/μg RNA(P＜0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπ mRNA表达量较对照组下降了39.8%,从(2.30±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.40±2.45)×104拷贝/μg RNA(P＜O.01);空载体转染后阿霉素的耐药指数为23,pSilence-mdr1转染后为8,pSilence-GSTπ转染后为10,差异有统计学意义(P＜0.01).结论shRNA可有效逆转K562/A02细胞mdr1和GSTπ的多药耐药性.
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X连锁凋亡抑制蛋白在HL-60细胞耐药中的作用
目的探讨X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在纤维连接蛋白(Fn)黏附介导的HL-60细胞耐药中的作用.方法用Fn包被培养板,以牛血清白蛋白(BSA)包被培养板作为对照.通过CCK-8实验检测Fn黏附对柔红霉素(DNR)敏感性的影响,流式细胞仪检测HL-60细胞内DNR浓度的变化,RT-PCR、Western blot检测XIAP、bcl-2、MRP和mdr1基因mRNA和蛋白表达变化.将XIAP反义寡核苷酸通过脂质体法转染Fn黏附培养的HL-60细胞,计算DNR对HL-60细胞的IC50值.结果HL-60细胞与Fn黏附后,对DNR的敏感性下降,Fn组IC50值为0.526 μmol/L,明显高于BSA组(0.132μmol/L)和悬浮培养组(0.123 μmol/L)(P＜0.05);Fn组XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平均较BSA组和悬浮培养组明显上调(P＜0.05);Fn组细胞内的DNR浓度与BSA组和悬浮培养组比较差异无统计学意义(P＞0.05).XIAP反义寡核苷酸可使Fn黏附介导的耐药HL-60细胞XIAP表达明显下调,对DNR的敏感性增加.结论XIAP可能参与了Fn黏附介导的HL-60细胞耐药,应用XIAP反义寡核苷酸能够逆转Fn黏附介导的HL-60细胞耐药.
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汉防己甲素联合屈洛昔芬对K562和K562/A02细胞NF-κB蛋白表达的影响
目的 研究汉防己甲素(Tet)和屈洛昔芬(DRL)单独及联合用药后对K562细胞及其耐药细胞株K562/A02的核因子κB(NF-κB)表达的影响,以进一步探讨其逆转多药耐药的作用机制.方法 采用免疫细胞化学及Western blotting法分别检测Tet(1μmol/L)、DRL(5 μmol/L)单独及联合作用于K562和K562/A02细胞后NF-κB核转位水平和胞核NF-κB蛋白表达水平的变化.结果①K562/A02细胞NF-κB核转位水平[(65.0±4.2)%]及胞核NF-κB蛋白表达(3.545±0.219)明显高于K562细胞[(39.6±0.9)%和2.366±0.141](P＜0.01);②Tet、DRL单独及联合作用6、12 h,对K562细胞NF-κB核转位水平及胞核NF-κB蛋白表达水平无明显影响(P＞0.05);③两药单独及联合作用6、12 h,可明显降低K562/A02细胞NF-κB蛋白核转位水平和胞核NF-κB蛋白表达水平(P＜0.05和P＜0.01),两药联合作用增强(P＜0.05),作用12 h较作用6 h效果更显著(P＜0.05).结论K562/A02细胞的胞核NF-κB蛋白表达水平明显高于K562细胞,NF-κB的活化可能参与了K562/A02细胞耐药的发生;抑制NF-κB活化可能参与了Tet和DRL逆转K562/A02细胞多药耐药过程.
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急性白血病患者P-gp、mdr1、MRP和Topo Ⅱ表达及其与预后关系的研究
目的探讨P糖蛋白(P-gp)、mdr1、MRP和Topo Ⅱ是否为急性白血病(AL)临床耐药的预后因素。[ HTH 方法用单抗UIC2标记，流式细胞术测定45例AL患者的P-gp；用RT-PCR方法检测其mdr1、MRP和Topo Ⅱ的表达。结果耐药组P-gp、mdr1、MRP阳性率均高于敏感组，P值均<0.01, 而Topo Ⅱ耐药组表达阳性率较敏感组降低，但差异无统计学意义。经单因素逻辑回归分析，P-gp、mdr1、MRP、Topo Ⅱ和年龄与临床耐药性显著相关; 性别、发病时白细胞计数、FAB 亚型和骨髓原始＋(早)幼稚细胞比例与耐药性无关。采用多因素逻辑回归分析经以上变量校正后显示P-gp、mdr1、MRP、Topo Ⅱ和年龄仍与耐药性显著相关：P-gp RR=14.87，P=0.003; mdr1 RR=19.98，P=0.003; MRP RR=16.53, P=0.006 ; Topo Ⅱ [ WTBX RR=0.23, P=0.046；年龄 RR=10.87, P=0.013。将36例初发AL患者单独分析，结果发现P-gp、mdr1和MRP亦与完全缓解密切相关。经直线相关分析发现所有病例组和临床耐药组P-gp和mdr1，P-gp和MRP，mdr1和MRP具有相关性(P<0.001) 。结论 P-gp、mdr1、MRP 和 Topo Ⅱ是AL临床耐药的独立预后因素。md r1和MRP具有相关性。
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冈田酸对全反式维甲酸诱导NB4、MR2细胞分化的影响
目的 探讨丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶2A(PP2A)抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OKA)对全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化的影响,探讨PP2A活性与白血病细胞ATRA耐药的关系.方法 用ATRA、OKA、ATRA+OKA分别作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞及其耐药细胞系MR2细胞,采用瑞特染色法和NBT还原实验观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞表面CD11b表达,丝(苏)氨酸蛋白磷酸化酶试剂盒检测细胞内PP2A活性,Western blot法检测细胞内PP2A各亚基表达.结果 ①细胞形态学、NBT还原实验及流式细胞术检测结果均显示,加入OKA抑制蛋白磷酸化酶活性能促进ATRA诱导的NB4细胞分化,并协同ATRA能诱导其耐药细胞MR2细胞发生部分分化.②酶活性分析显示,未处理的NB4细胞PPA活性为(959±83)pmol磷酸盐·min-1,μg蛋白-1;ATRA诱导NB4细胞分化过程中,PP2A活性明显下降[(534±43)pmol磷酸盐·min-1.μg蛋白-1],ATRA+OKA组PP2A活性下降更加明显[(229±23)pmol磷酸盐·min-1·μg蛋白-1];单用ATRA作用于MR2细胞,则PP2A活性无明显影响,而ATRA+OKA诱导MR2细胞分化中,PP2A活性下降.③Western blot.结果 显示,ATRA作用5d的NB4细胞中PP2A-C亚基表达较对照组明显减少,而A和B亚基表达与对照组比较变化不明显;在MR2细胞中,A、B和C亚基表达在处理组与对照组之间无明显差别.结论 ATRA诱导的NB4细胞分化过程中细胞内PP2A-C表达减少,PP2A活性降低.ATRA不能有效抑制MR2细胞内PP2A的活性,可能是MR2细胞对ATRA耐药的机制之一.
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三氧化二砷抑制K562/ADM细胞 P-糖蛋白表达并提高化疗药物的敏感性
目的研究三氧化二砷(As2O3)对人多药耐药白血病细胞K562/ADM的诱导凋亡作用和对P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响,以及As2O3与常规化疗药物对耐药细胞的联合效应. 方法以白血病多药耐药细胞系K562/ADM为As2O3作用的靶细胞,用MTT比色法检测细胞增殖活性,光镜、激光共聚焦显微镜和电镜观察形态学变化,流式细胞术进行细胞周期分析和P-gp表达的检测,激光共聚焦显微镜检测P-gp功能.结果 K562/ADM 细胞对阿霉素(ADM)高度耐受,并与柔红霉素(DNR)和足叶乙甙(Vp16)交叉耐药.0.5～20.0 μmol/L As2O3抑制K562/ADM细胞增殖,抑制活性高于K562细胞.经As2O3诱导后K562/ADM细胞出现典型的凋亡形态学变化和亚G1期细胞比例增高等凋亡特征性改变.As2O3下调K562/ADM细胞P-gp的表达并抑制其功能,增加K562/ADM细胞对ADM、DNR和Vp16的敏感性.结论 As2O3能够诱导白血病多药耐药细胞凋亡,并通过抑制耐药细胞P-gp的表达和功能提高耐药白血病细胞对常规化疗药物的敏感性.
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源于细菌DNA的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞促成熟作用
目的 研究源于细菌CpG基序的寡核苷酸和含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对K562/A02细胞来源的树突细胞(DC)的促成熟作用.方法 联合应用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4诱导K562/A02细胞成为DC.7 d后以瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,用同种混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测、IL-12和IL-6的分泌实验评价DC的成熟程度.然后在DC中分别加入源于细菌CpG基序的寡核苷酸CpG2006以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸A-ODN和T-ODN,处理3 d后再次检测该DC成熟度.结果 K562/A02细胞可在细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4联合作用下分化成为DC,免疫表型检测发现CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为(65.5±8.4)%、(32.0±4.3)%和(18.6±3.2)%,经CpG2006作用后表达升高到(88.9±3.6)%、(53.9±3.2)%和(39.9±7.3)%;经A-ODN作用后升高到(97.0±5.3)%、(63.9±7.3)%和(40.2±7.4)%;经T-ODN作用后升高到(93.3±4.6)%、(58.3±5.6)%和(36.2±6.8)%,与作用前相比差异均有统计学意义.经CpG2006、A-ODN和T-ODN作用后具有典型DC形态的细胞增多.上述3种寡核苷酸处理的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应、诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强,IL-6和IL-12分泌明显增高.结论 源于细菌CpG基序的寡核苷酸以及含细菌短磷酸二酯骨架的寡核苷酸对白血病源性DC有促成熟作用.
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白血病患者可溶性耐药相关钙结合蛋白基因的表达及其临床意义
目的探讨白血病患者可溶性耐药相关钙结合蛋白(Sorcin)基因的表达及其与临床耐药和疗效的关系.方法应用半定量RT-PCR检测95例急性白血病患者、27例非白血病患者和健康人的Sorcin基因表达水平,并分析了Sorcin基因表达的临床意义.结果白血病患者Sorcin基因表达高于对照组,差异有显著性(P<0.001);急性髓系白血病(AML)复发难治组高于初诊组和完全缓解(CR)组;临床耐药组Sorcin基因表达显著高于非临床耐药组(P<0.001);Sorcin基因阳性表达的CR率为20.0%,Sorcin基因阴性表达的CR率为80.0%,差异有显著性(P<0.001);AML各亚型Sorcin基因过度表达存在差异,以M5的阳性表达率高.结论 Sorcin基因过度表达与白血病患者临床耐药密切相关,是影响预后的重要因素,可作为检测临床耐药和判断预后的指标之一.
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抗P-gp/抗CD3双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病耐药细胞
目的研究抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体介导T细胞对白血病耐药细胞的特异性靶向杀伤活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot及活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物;采用人白血病耐药及敏感裸鼠移植瘤模型测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性.结果纯化的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体具有与Jurkat(CD3阳性)和K562/A02细胞(P-gp阳性)的结合活性,结合阳性率分别为86.25%,86.26%;在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体能有效抑制耐药白血病移植瘤的生长,抑瘤率98.57%.结论抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤表达P-gp抗原的耐药肿瘤细胞,具有潜在的临床应用前景.
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HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究
目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.
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环孢菌素D衍生物PSC 833逆转K562/A02细胞多药耐药的研究
目的证实PSC 833逆转剂的高效性,探讨PSC 833逆转肿瘤细胞多药耐药的机制.方法以人红白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为实验研究对象,采用MTT法检测细胞毒性;直接免疫荧光测定法检测P糖蛋白(P-gp)表达水平;RT-PCR法检测mdr1 mRNA水平;以流式细胞术测定两种细胞系内柔红霉素(DNR)的潴留来反映P-gp的外排功能.结果与K562细胞系相比,K562/A02耐药细胞系mdr1 mRNA及P-gp高表达,DNR潴留减少.1?μmol/L的PSC 833对K562/A02细胞的mdr1 mRNA及P-gp表达水平无明显影响(P>0.05),PSC 833对K562/A02细胞的DNR细胞毒性有剂量依赖性增敏作用,其增敏作用至少是环孢菌素A(CsA)、维拉帕米(Ver)的3倍.PSC 833能增加K562/A02耐药细胞系的DNR潴留.1 μmol/L的PSC 833能使K562/A02细胞内DNR潴留量恢复至K562细胞的100.9%,而10 μmol/L CsA只恢复至K562细胞的86.9%, PSC 833对K562细胞系的DNR细胞毒性及DNR潴留均无明显影响(P>0.05).结论 PSC 833较CsA、Ver逆转活性至少高3～10倍,其逆转K562/A02多药耐药的机制可能是通过抑制P-gp功能,而非直接下调mdr1 mRNA及P-gp水平.
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WAVE1基因在K562/A02白血病细胞多药耐药中的作用
目的 探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1(WAVE1)基因在K562/A02白血病细胞多药耐药机制中的作用.方法 将pEFBOS-WAVE1真核表达质粒转染K562细胞构建WAVE1高表达的K562细胞,将WAVE1基因的特异性小片段干扰RNA(WAVE1 siRNA)转染K562/A02细胞构建WAVE1低表达的K562/A02细胞.Western blot和RT-PCR法检测基因转染前后K562/A02细胞及K562细胞WAVE1基因及蛋白的表达;可溶性噻唑盐WST-8染色法检测阿霉素对转染前后细胞的半数抑制浓度(IC50);Hoechest33258染色法检测细胞形态学改变并计算凋亡细胞百分率;RT-PCR检测多药耐药基因mdr1 mRNA表达;Western blot检测Bcl-2表达.结果 ①与K562细胞相比,K562/A02细胞WAVE1 mRNA表达水平增加70%,蛋白表达水平增加63%.②转染WAVE1基因的K562细胞WAVE1过表达,并降低了对阿霉素的药物敏感性,使IC50从转染前的(0.05±0.00)μg/ml,增加到(2.99±0.12)μg/ml,在阿霉素浓度为1、5 μg/ml时,凋亡细胞分别下降30%、35%.③转染WAVE1siRNA的K562/A02细胞WAVE1蛋白表达水平与未转染组相比明显降低,并可增强对阿霉素的药物敏感性,使IC50从转染前的(4.29±0.15)μg/ml下降到(1.85±0.07)μg/ml,阿霉素浓度为1、5 μg/ml时,凋亡细胞分别增加24%、21%.④转染WAVE1的K562细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平均增高,而转染WAVE1 siRNA的K562/A02细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平比转染前明显降低.结论 WAVE1参与了K562/A02细胞多药耐药的形成,其机制可能与调控mdr1和Bcl-2水平有关.
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成人急性白血病患者细胞周期蛋白A基因表达与耐药的关系
目的探讨细胞周期蛋白A(cyclin A)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达以及与耐药的关系.方法采用半定量RT-PCR技术对32例多药耐药和32例化疗敏感的AL患者和20名正常人进行细胞周期蛋白 A、mdr1、TopoⅡα、bcl-2 mRNA水平的测定.结果耐药组患者细胞周期蛋白A及TopoⅡα mRNA的表达水平均明显低于敏感组患者(P<0.01),20名正常人在同一实验条件下未检出细胞周期蛋白A mRNA的表达; 耐药组患者mdrl及bcl-2 mRNA表达水平均明显高于敏感组(P<0.01);64例AL患者中,细胞周期蛋白A与TopoⅡα表达水平呈高度的正相关(r=0.794,P=0.000); 细胞周期蛋白A与TopoⅡα同时阳性低表达的10例AL患者全部耐药;经Binary逻辑回归分析显示细胞周期蛋白A与耐药显著相关.结论细胞周期蛋白A可能会成为判断AL患者预后的新指标,联合TopoⅡα检测对判断AL耐药有意义.
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硼替佐米对多药耐药HL-60细胞增殖的影响及耐药逆转作用
目的 观察硼替佐米对多药耐药白血病细胞增殖的影响及耐药逆转作用,初步探讨硼替佐米抑制多药耐药白血细胞增殖的分子机制.方法 以多药耐药白血病细胞系HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞为模型,以HL-60细胞为对照,用四甲基偶氮唑盐反应比色法(MTT法)测定硼替佐米对HL-60、HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞增殖的抑制作用,计算微毒剂量作为逆转耐药剂量.分4个实验组:HL-60/DNR+柔红霉素(DNR)、HL60/DNR+DNR+硼替佐米、HL-60/VCR+长春新碱(VCR)、HL-60/VCR +VCR+硼替佐米,计算硼替佐米逆转耐药倍数.硼替佐米按浓度递增(10、40、80nmol/L)作用于HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞48 h,实时定量RT-PCR和Western blot方法检测XIAP、cIAP-1、cIAP-2 mRNA和蛋白表达水平及NF-κB活性.结果 硼替佐米呈浓度依赖性抑制HL-60、HL-60/DNR和HL-60/VCR细胞增殖,IC50值分别为(28.90 ±3.99)、(81.19 ±9.34)和(73.48±8.94) nmol/L.10 nmol/L硼替佐米预处理48 h后,DNR对HL-60/DNR细胞的IC50值由(12.90±1.75) μmol/L降低至(3.54±0.57) μmol/L(P ＜0.01),VCR对HL-60/VCR的IC50值由(33.25 ±7.28)μmol/L降低至(9.97±1.15) μmol/L(P ＜0.01),逆转耐药倍数分别为(3.32±0.53)和(2.64±0.28)倍.硼替佐米呈浓度依赖性下调XIAP、cIAP-1、cIAP-2 mRNA和蛋白的表达水平及抑制NF-κB活化.结论 硼替佐米可抑制多药耐药HL-60细胞增殖,并对多药耐药具有一定的逆转作用；其机制可能与下调凋亡抑制蛋白表达相关.
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高三尖杉酯碱诱导的白血病耐药细胞基因表达谱的变化
目的 探讨高三尖杉酯碱(HHT)诱导的人白血病细胞耐药相关分子.方法 在前期建立的HHT诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT的基础上,采用基因芯片技术比较K562/HHT细胞、其亲本K562细胞以及用耐药逆转剂米非司酮(RU486)作用后的K562/HHT(K562/HHT/RU486)细胞三者基因表达谱的差异,选择在这三种细胞中呈动态变化的骨髓细胞X染色体上酪氨酸激酶(BMX)基因用RT-PCR和Western blot法在转录和翻译水平进行验证,进而转染BMX基因到K562和K562/HHT细胞,观察BMX过表达时这两种细胞内柔红霉素(DNR)含量的变化,确定BMX是否在K562/HHT细胞耐药形成中发挥作用.结果 耐药细胞K562/HHT与其亲本K562细胞相比,共有117个基因表达有显著差异,其中57个基因表达明显上调,60个基因表达明显下调,耐药细胞K562/HHT中多药耐药基因mdr1表达明显上调;K562/HHT/RU486细胞与K562/HHT细胞相比,13个基因表达明显上调,37个基因表达明显下调.这些差异表达的基因涉及耐药、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖、转录调节以及离子转运等.基因NM-001721(BMX)、NM-031459(SESN2)、NM-033642(FGF13)和AL 049309(SFRS12)在两组芯片中的表达均有显著差异.其中BMX基因在K562/HHT细胞中的表达与K562细胞相比,明显上调,在K562/HHT/RU486细胞则较K562/HHT细胞减低.进一步用RT-PCR和Western blot法检测得到了相同的结果.RT-PCR和Western blot证实BMX质粒转染的K562及K562/HHT细胞BMX表达均上调,流式细胞术检测到K562及K562/HHT细胞内DNR含量荧光强度分别为79.28±4.04和29.84±2.67,均较转染前荧光强度158.52±8.08和58.58±6.53显著减低.结论 BMX在高三尖杉酯碱诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT耐药性产生中发挥作用.
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靶向siRNA沉默mdr1基因表达及对白血病耐药细胞系K562/ADM的耐药逆转作用
目的 研究小干扰RNA(siRNA)对白血病多药耐药细胞系K562/ADM细胞mdr1基因表达的沉默作用和凋亡抑制的逆转效应.方法 K562/ADM为靶细胞,设计、筛选和合成2对针对mdr1基因mRNA的siRNA(mdr1 siRNA-1和mdr1 siRNA-2),用脂质体介导转染K562/ADM细胞;实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测mdr1 mRNA的表达;流式细胞术测定P-糖蛋白(P-gp)水平和caspase-3活性;细胞形态学和FITC标记的膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)双染色法检测细胞的凋亡.结果 筛选出的mdr1 siRNA-1和mdr1 siRNA-2显著抑制K562/ADM细胞mdr1的表达,mdr1 mRNA的表达分别降低91.2%和82.0%,P-gp水平下降74.1%和84.4%;增强caspase-3活性,活化caspase-3增加约40%;K562/ADM耐药细胞对阿霉素诱导凋亡的敏感性增强,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡率提高约60%.结论 siRNA通过沉默mdr1/P-gp表达而逆转K562/ADM多药耐药细胞的凋亡抑制现象.
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联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究
目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.
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转mdr1基因诱导CIK细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性
目的将多药耐药基因(mdr1)转入细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞,观察其是否产生耐药性并且保持肿瘤杀伤活性.方法用IFN-γ, CD3单抗, IL-2, IL-1等细胞因子体外诱导外周血单个核细胞获得CIK细胞.采用电穿孔方法将mdr1基因表达质粒pHamdr转入CIK细胞.转染后72 h提取细胞总RNA,DNA酶消化残留质粒DNA后进行RT-PCR,鉴定mdr1基因表达;流式细胞仪检测细胞膜耐药蛋白(P-gp)表达.四唑蓝比色法(MTT)检测转基因后CIK细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性;同时检测转染前后CIK细胞对MCF7细胞(人类乳腺癌细胞系)的杀伤活性变化.结果转染mdr1后的CIK细胞mdr1 mRNA阳性,P-gp阳性的CIK细胞为21%～37%(平均27%).转染后CIK细胞获得了多药耐药性,对阿霉素的IC50值较转染前升高了22.3～45.8倍,对秋水仙碱的IC50值升高了6.7～11.35倍.转染前后CIK细胞对MCF7肿瘤细胞的杀伤活性无明显变化(P>0.05).结论 CIK细胞转入mdr1基因后获得了多药耐药性,转染后的CIK细胞仍然保持原有的肿瘤细胞杀伤活性.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选白血病多药耐药相关基因
目的克隆和筛选白血病多药耐药(MDR)相关基因.方法以MDR白血病细胞株K562/DOX为检测样本,以K562细胞株为驱赶样本(对照),应用抑制性消减杂交(SSH)技术分离和克隆K562/DOX细胞中过高表达的基因,构建cDNA消减文库;通过反向Northern斑点杂交法进一步筛选消减文库,对阳性克隆进行序列测定和同源性分析;并采用RT-PCR和Northern blot方法对某些阳性克隆进行进一步的验证.结果发现了11个在K562/DOX细胞中高表达的基因,包括S3核糖体蛋白(S3 ribosomal protein,S3rp)基因、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位2(NADH dehydrogenase subunit2,ND2)基因、My023基因等,其中多数基因与肿瘤MDR的关系尚未见报道.结论筛选到几个可能与白血病MDR形成有关的基因,提示了白血病MDR发生的新机制.
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K562/Vp16细胞系中边缘细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究
目的进一步阐明白血病细胞对伊马替尼耐药的机制.方法经过对K562细胞系长期的鬼臼乙叉甙(Vp16)诱导和克隆筛选,建立了一株耐药细胞系K562/Vp16,利用干细胞高效能将Hoechst 33342荧光染料泵出细胞的特性,采用流式细胞术从K562/Vp16细胞系中分选出一小群细胞,即边缘细胞(Side population,SP),称为K562/Vp16 SP细胞,并初步探讨了其对伊马替尼耐药的机制.结果BCR/ABL和ABL蛋白在K562细胞、K562/Vp16 SP细胞及K562/Vp16非SP细胞(K562/Vp16non-SP)中的表达水平差异无统计学意义;P-gp在K562细胞中不表达,在K562/Vp16 SP 及 K562/Vp16 non-SP细胞中均高表达且表达水平一致;与K562/Vp16 non-SP细胞比较,K562/Vp16 SP细胞对伊马替尼的耐药性更强,并且这种耐药性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转;另外,体内外实验显示,K562/Vp16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562/Vp16 SP细胞.结论白血病细胞对伊马替尼具有一定的耐药性,可能与数量极少的SP细胞有直接的关系.因此,这类数量极少的SP细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞.
