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反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌
目的探讨早期、快速检测嗜肺军团菌的方法.方法根据嗜肺军团菌特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的260 bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细菌DNA,并应用于痰标本的检测.结果所合成的260 bpDNA探针具有高度特异性,只和嗜肺军团菌杂交,与其他细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针低可检测出1 ng的细菌DNA.杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为8%和2%.结论该方法快速、特异,对嗜肺军团菌的早期诊断具有较高的应用价值.
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反义寡核苷酸技术研究进展
反义寡核酸技术,是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基配对与细胞内核酸(DNA或RNA)特异结合形成杂交分子,从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术,是一种新的药物开发方法.其机制是:①反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子,可以激活RNase H,该酶可以切割杂合分子中的RNA链,导致靶mRNA降解.②不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译;另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达,从而纠正错误的剪接.
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杂交法在HPV筛查中弱阳性结果的临床意义
目的:探究杂交法在高危型人乳头瘤病毒(HPV)筛查中产生的弱阳性结果的临床意义.方法:通过杂交法对7 993例女性宫颈脱落细胞标本进行HPV-DNA检测,其中弱阳性结果用荧光定量PCR(FQ-PCR)进一步验证,比较各个弱阳性结果与IC(内部质控)的Ct值,从而判断该弱阳性结果是否具有临床价值.结果:7 993例女性宫颈分泌物标本中,检测出弱阳性标本58例,各弱阳性分型的Ct值大于参考值(38),即病毒核酸浓度不具备实际的临床意义.结论:低浓度的HPV不具有致病性,可以被正常机体的免疫系统清除掉,杂交法在HPV筛查中得到的弱阳性结果需要慎重,以免造成患者的恐慌以及过度医疗.
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主动脉弓杂交手术的现状
腔内修复技术已经成功应用于降主动脉粥样硬化性动脉瘤(DTAA)[1].这一微创技术让DTAA患者得到更快速无痛的治疗,而且让一些不适合外科治疗的高危患者得到治疗.
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反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体
目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法.方法:根据肺炎支原体特异的 P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的 162 bp长链 DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体 DNA,并应用于痰标本的检测.结果:所合成的 162 bp DNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针低可检测出 1 ng的 DNA.杂交法和培养法分别检测 100份痰标本,两者的阳性率分别为 12%和 2%.结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值.
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反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌
目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法.方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263 bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测.结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10 ng细菌DNA.50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份.结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义.
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中国杂交龟鳖及其命名
随着生物学研究技术的不断发展，科学家开始认识到杂交是一种较为普遍的生物学现象。对杂交生物的判断，不仅可以依靠其外部形态特征，而且更可以应用同工酶和DAN序列分析技术。有学者认为，至少25%的植物种类及10%的动物种类,尤其是许多新形成物种,都与杂交或与其它物种间存在遗传渗入有关。杂交不仅发生于人工养殖的动物和栽培植物中,而且也常见于自然界。
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海南与广西两地微小按蚊杂交试验
目的:观察海南微小按蚊与广西微小按蚊之间是否存在生殖隔离.方法:在海南与广西两地分别采集微小按蚊,实验室中建立单雌繁殖线,用人工交配方法进行杂交试验,观察后代雌蚊的可育性;按Coluzzi方法制备杂种F1代雌蚊卵巢营养细胞多线染色体标本,观察各区带的联会情况.结果:各交配组的后代均显示可育;杂种F1代雌蚊的卵巢营养细胞多线染色体各区正常联会.结论:海南微小按蚊与广西微小按蚊之间不存在生殖隔离,是同种.
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比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于点突变的检测效率
目的:比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于CRISPR-Cas9引起的点突变的错配剪切活性.方法:利用野生型和点突变的基因组DNA为模板,PCR扩增出突变位置的基因片段,用不同比例的野生型和点突变的PCR产物进行DNA杂交,分别用T7E1和Surveyor核酸内切酶对杂交后的产物进行切割,琼脂糖凝胶电泳分析结果.结果:当5％点突变DNA与95％野生型DNA杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为9.5％,Surveyor核酸内切酶为3.2％;当点突变DNA与野生型DNA等比例杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为45.6％,Surveyor核酸内切酶为26.4％;且T7E1和Surveyor核酸内切酶均能检测5％的突变DNA.结论:T7E1核酸内切酶检测点突变的效率高于Surveyor.
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肿瘤标志物糖类抗原CA19-9的临床应用进展
糖类抗原CA19-9是Koprowski等人于1979年用人的结肠癌细胞株免疫BALB/c纯种鼠并与髓瘤进行杂交所得的一株编号为1116NS19-9的单克隆抗体,该抗体能与一类与肿瘤相关的糖类抗原起反应,该单抗所识别的抗原命名为糖类抗原CA19-9( Casbohydrate Antigen19-9)[1].
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5株不同群型霍乱弧菌黏粒文库构建及JS9803株文库应用
目的 研究5株不同群型霍乱弧菌(VC)黏粒文库的构建.方法 染色体DNA提取、酶切,质粒DNA提取、酶切及去磷酸化,连接、包装、转染、铺板,克隆子鉴定和保存、菌落原位杂交,PCR和测序.结果 成功构建吴江-2株(EVC流行株产毒株)、86015株(EVC流行株非产毒株)、JS32株(EVC非流行株非产毒株)、JS9803株(O139群VC产毒株)和GD98200株(O139群VC非产毒株)等5株霍乱弧菌的染色体基因组黏粒文库,文库克隆子中插入35～45kb的染色体DNA片段,库容量分别为3000～5000克隆子.从JS9803株文库中筛选出分别携带CTXψ或nct-CTXψ基因组的克隆子,后一克隆子携带的rstR-ig2基因为新类型.结论 成功构建5株不同群型霍乱弧菌染色体基因组黏粒文库,并对JS9803株文库进行应用.
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中国不同地域嗜人按蚊的杂交及多腺染色体观察
目的了解我国不同省、区的嗜人按蚊是否存在生殖隔离和种间差异.方法采用遗传学杂交技术及多腺染色体制片技术,对我国四川、江苏、广西的嗜人按蚊进行杂交,对杂交子1代的唾液腺染色体进行制片观察.结果四川、江苏、广西的嗜人按蚊可以在蚊笼内自然交配,并可连续传代,不存在生殖隔离.唾液腺染色体制片观察,各种杂交组合产生的子1代,其唾液腺染色体均呈完全联会状态.结论此次实验表明,我国四川、江苏、广西的嗜人按蚊不存在生殖隔离,也无种间差异.
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转基因杂交水牛染色体核型分析
目的:分析转基因水牛("海医一号")染色体核型.方法:取水牛耳源静脉血,按人类外周血染色体标本制备方法进行.结果:水牛染色体核型为2n=49(49,XX).结论:转基因杂交水牛核型变化与常规杂交育种相同.
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抑制消减杂交技术及其在微生物研究中的应用
抑制消减杂交(SSH)是近年来兴起的一种分离、克隆差异基因的新技术,它结合了消减杂交和抑制PCR的优点,具有操作简便、特异性强、背景低、重复性好的优点,在多个领域得以广泛应用.现就其在微生物研究中的应用综述如下.
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DNA芯片技术检测乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的初步研究
现分别针对乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因保守区域设计多对聚合酶链反应(PCR)引物,打印制备成芯片,并用限制性显示(RD)技术标记样品,探索此方法制备基因芯片的可行性.
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肝炎病毒诊断分型寡核苷酸芯片的制备与应用
目的 研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸(Oligo)芯片,并进行系列优化及临床应用性研究.方法 从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列,HDV及HCV 4个基因型全长cDNA序列,根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列,以作为设计Oligo探针的备选序列.用Array designer 3.0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析,设计长度均一的60 mer Oligo探针.从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针.Oligo探针合成和纯化后,用芯片打印仪固定在玻片上.为便于研究,先后制备了2种芯片,包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片.采用限制性显示-PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交,并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4.0的探针,选取高特异的探针制备了HBV,HDV、HCV联合诊断分型芯片.结果 从杂交效果来看,研制的Oligo芯片特异性较高,可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型.为了适应临床诊断的要求,对芯片进行了实验条件摸索和一些优化,均取得较好的效果.结论 制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳,具有较为广阔的应用前景,为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备.
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应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因
目的 构建转化生长因子(TGF)β1刺激大鼠肝星状细胞(LX02)反式调节基因的cDNA消减文库,筛选并克隆TGF β1反式调节相关基因,以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制.方法 以TGF β1刺激LX02细胞,同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照.提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆;随机挑取其中35个克隆进行测序,30个列序成功,并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源.结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库,筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成,信号传导、细胞外基质代谢、扰脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因,为进一步阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索.
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乙型脑炎病毒靶序列浓度对LSAW基因传感器检测系统的影响
目的 探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis vires,JEV)靶序列浓度值对漏声表面波(LSAW)基因传感器检测系统的影响.方法 LSAW基因传感器表面固定终浓度为0.5 μmol/L的JEV探针,然后用pH 7.6的10 mmol/L PBS缓冲液(含Na+ 0.3 mol/L)中和终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μmoL/L的JEV靶序列杂交,分别记录相位变化及反应所需时间.结果 与JEV探针反应引起的相位变化是先缓慢上升后趋于缓和的趋势,以1.0 μmol/L靶序列浓度为分界线;杂交平衡时间上除0.05 μmol/L的时间短以外,其他的未见明显变化趋势,当靶序列浓度为1.0 μmol/L,杂交反应平衡时间为33 min.结论 随着靶序列浓度的升高,杂交反应引起的相位变化呈典型的饱和曲线趋势;靶序列浓度为1.0 μmol/L、杂交反应的平衡时间为33 min,是LSAW基因传感器杂交的适反应条件.
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缓冲液pH值对LSAW-bisPNA传感器检测系统的影响
目的 探讨PBS缓冲液pH值对LSAW-bisPNA基因传感器检测系统的影响.方法 LSAW-bisPNA基因传感器表面固定终浓度为1.0 μmol/L的bis-PNA探针,然后分别在pH 5.8～8.0的PBS缓冲液中和相应的靶序列杂交,记录相位变化及反应所需时间.结果 在不同pH值缓冲液中,bis-PNA与靶序列反应引起的相位变化有明显差异(P＜0.01),pH 6.6与pH 6.8时传感器响应信号大,但两者反应所达到的平衡时间有明显差异(P＜0.05),pH值6.6时检测所需时间更短.结论 选择pH 6.6作为bis-PNA和靶序列dsDNA反应的适pH值,在该pH值条件下传感器响应信号大,反应达平衡时间短.
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缓冲液pH值对肽核酸压电基因传感器阵列杂交效应的影响
目的探索PBS缓冲液的pH值对肽核酸压电基因传感器阵列杂交效应的影响.方法压电基因传感器阵列表面先固定上1.5 μmol/L的bis-PNA探针,然后分别在pH 5.8～8.0的PBS缓冲液中和相应的靶序列杂交,记录频率的下降值及反应所需的时间.结果随着pH值从5.8升到8.0,杂交导致的频率下降值先高后低,以pH 6.8为一个分水岭.杂交平衡时间在pH 6.8之前总体上说相差尚不明显,但当pH值从6.8升到8.0时,却骤然增加.结论 bis-PNA和靶序列dsDNA的杂交时适用的pH范围很窄(pH 6.6～7.0).弱酸环境下(pH 6.8时)为容易,pH超过7.5就不适宜杂交.结果从另一个侧面证实了在bis-PNA和dsDNA的杂交过程中"Hoogsteen链第一"的反应机制.
