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HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆
目的克隆与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因. 方法应用酵母双杂交系统,构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个克隆,既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/-Trp-Leu-Ade-His)又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠埃希菌后进行测序,进行生物信息学分析.结果分析结果显示,其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98%的同源性,初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性.结论丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功.
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应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究
目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β(IFNβ)结合蛋白.方法 用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因,连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,提取酵母质粒后转化大肠埃希菌(DH5α)并经氨苄西林抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,进行酶切鉴定及序列测定,并进行生物信息学分析.结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,后得到19个克隆基因,编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白.初步发现铁蛋白与IFNβ具有结合作用.结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNβ具有结合作用的蛋白.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆
目的 应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)相互作用的蛋白.方法 连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-Gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化人大肠埃希细菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证.结果 筛选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体(CAML)29个.对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用.结论 成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索.
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用分子生物学方法检测螨体内汉坦病毒的研究
目的研究汉坦病毒(HV)在革螨、恙螨体内增殖、定位等.方法采用聚合酶链反应和原位分子杂交法检测革螨、恙螨体内HV-RNA.结果用PCR技术从革螨、恙螨体内检测到HV-RNA,低检测为5只螨组;取革螨和恙螨幼虫、若虫定期测定TCID50/ml滴度,证明HV在革螨、恙螨体内可经期传播并有增殖现象;用原位分子杂交技术在革螨、恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到HV-RNA.结论研究结果证明HV在螨体内可经期传播,并有增殖现象;HV通常定位于螨的卵巢和支肠细胞等组织内.为革螨、恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据.
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乙型肝炎病毒基因扩增产物的固相酶联杂交定量分析
目的建立一种能快速、简便定量分析乙型肝炎病毒(HBV)基因的方法.方法用标记有生物素的引物做PCR,使扩增产物被标记,再加入碱性磷酸酶标记的链亲和素.利用酶促显色反应信号显示待测核酸模板的含量.结果对125份两对半表现不同的血清标本检测结果为:大三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAg阳性)标本中 64.9%(24/37)PCR定量阳性,小三阳(HBsAg、HBcAb、HBeAb阳性)标本中 34.2%(13/38)PCR定量阳性,HBsAg和HBcAb阳性标本中6.7%(1/15)定量阳性,单项核心抗体(HBcAb)阳性标本中5.9%(2/34)PCR定量阳性.结论所建立的固相酶联杂交定量方法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果判断客观准确等优点,可广泛应用于临床.
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抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因
目的 利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建重组干扰素β(IFNβ)刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选IFNβ下调HepG2相关基因.方法 重组IFNβ 2000 U/ml刺激对数生长期HepG2细胞,以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照;制备细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份,分别与两种不同的接头连接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后,得到58个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中35个插入片段测序,并通过生物信息学分析,结果 共获得12种编码基因.结论 应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据.
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浙江沿海地区宫颈病变患者中高危型HPV检测及其临床价值
目的 分析宫颈病变患者中高危型HPV的感染情况及特点,探讨HR-HPV DNA检测用于高级别宫颈上皮内瘤变中的价值.方法 回顾性分析采用液基薄层细胞学(TCT)检查、HR-HPV检测和阴道镜检查并行活检的官颈病变患者1130例临床资料.经病理组织学检查证实宫颈炎症448例,官颈上皮内瘤变Ⅰ级和(或)湿疣(CIN Ⅰ/HPV Ⅰ)212例,高级别官颈上皮内瘤变或官颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ级(C1NⅡ/Ⅲ)442例,宫颈浸润癌(均为鳞癌)28例.结果 1130例官颈病变患者中HR-HPV阳性率为65.84％(744/1130).细胞学异常者为862例,其中ASCUS356例、ASCH 84例、LSIL 216例、HSIL 184例、癌22例.病理学≥CINI/HPVI者682例,HR-HPV阳性率为78.59％(536/682).筛查≥CINⅡ病变TCT的灵敏度为88.94％,特异度为32.73％,阳性预测值为48.49％,阴性预测值为80.60％；HC-Ⅱ的灵敏度为90.21％,特异度为51.82％,阳性预测值为57.14％,阴性预测值为88.14％；两者联合的灵敏度为97.45％,特异度为22.42％,阳性预测值为47.22％,阴性预测值为92.50％.结论 HR-HPV在各年龄组宫颈病变患者中均有较高的感染率,随着宫颈病变程度的加深,HR-HPV的感染率逐步升高.HC-Ⅱ检测HR-HPV DNA是筛查宫颈上皮内瘤变可选用的方法.HR-HPV DNA检测是一种有效的ASCUS和LSIL的管理手段,有较高的灵敏度和阴性预测值.
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HPV-DNA分型检测在不同类型的ASC中的意义
目的 了解非典型鳞状细胞(ASC)的两种不同亚型--ASC-US和ASC-H患者临床结局的差异,以及HPV-DNA分型检测在两种不同亚型中的意义.方法 对2005年1月至2007年12月宫颈脱落细胞学判读为ASC的1256例(其中580例同时行HPV-DNA分型检测)行阴道镜及活检,并对上述资料进行分析和总结.结果 在1256例ASC中ASC-US和ASC-H分别占90.1%和9.9%,经阴道镜和宫颈活检病理诊断CIN2及以上的分别为8.5%和24.2%(P=0.000).在ASC-US组HPV高危亚型的感染率为67.2%,不同的HPV-DNA检测结果与阴道镜以及病理检查结果间相比差异有统计学意义(P=0.000).在ASC.H组HPV高危亚型的感染率为47.3%,不同的HPV-DNA检测结果与阴道镜以及病理检查结果间相比差异无统计学意义(P=0.054).结论 ASC的两种不同亚型患者的临床结局不同,应区别对待.HPV-DNA分型检测在ASC-US患者分层处理中有意义,但对于ASC-H患者建议全部行阴道镜检查.
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DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性
目的建立DNA芯片检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因多态性的研究方法并对实验条件进行优化. 方法设计多条寡核苷酸探针,在硅烷化芯片的特定位置上,用点样仪将探针固定,并与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交,杂交结果影印至硝酸纤维素膜,经BCIP/NBT避光显色,用放大镜观察杂交信号呈暗紫色圆点,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型. 结果通过1次杂交反应可检测HBV前C/C区(nt 1896/1814)、BCP区(nt 1762/1764)和P区(nt 528/552)等多个位点的变异,与测序分析结果完全一致,具有较好的检测灵敏度和重复性. 结论 DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性,操作简便易行,技术要求不高,具有临床推广应用价值,而且可以方便地通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应探针,扩大基因芯片的检测应用范围,为临床检测提供了新的方法.
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TNF-α、IL-6基因多态性在HCV相关肝病中的分布特征
本研究对中国汉族人TNF-α、IL-6血清水平及其基因单核苷酸多态性(SNP)与HCV相关肝病的关系进行了探讨.以ELISA测定250例HCV肝病患者和182例健康对照者TNF-a、L-6血清水平,用上海百傲科技有限公司基因多态性芯片检测试剂盒和芯片识读仪检测TNF-α( -238,-308)G/A及IL-6(- 174,-572)G/C,-597C/A位点SNP,操作包括DNA抽提、PCR扩增、杂交、显色及基因芯片识读仪自动输出检测结果等步骤,同时以PCR-RFLP分析随机抽取的部分标本证实芯片分型结果;247例HCV采用基因直接测序法分型.病例按病情进展分为慢性肝炎组及肝纤维化合并肝癌组;按HCV基因型分为1b、2a组.
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微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立
登革病毒1～4型(dengue virus type 1-4,DV1-4)、流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)及黄热病病毒(yellow fever virus,YFV)均为黄病毒属的重要传染病病原,其流行季节及临床症状都极为相似,且暴发日益频繁,发展特异、敏感的快速诊断及鉴别诊断方法,对这类疾病的预防及控制具有重要意义.本研究在对其基因组序列系统分析的基础上,建立了快速检测及鉴别诊断上述病毒的微孔杂交(PCR-ELISA)方法.
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PCR指纹图技术筛选鼠疫耶尔森菌种特异性探针的研究
目的利用PCR指纹图技术筛选细菌种特异性探针,探索利用PCR指纹图技术实现病原菌通用检测的可能性. 方法以鼠疫耶尔森菌为实验对象,利用REP-1和REP-2引物对在非严谨的条件下进行PCR指纹图扩增;将所有扩增片段纯化后,克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109;用生物素化的载体引物扩增克隆化片段,进行末端标记;在硝酸纤维素膜上固定鼠疫杆菌的染色体DNA以及相应对照菌株的染色体DNA,以末端标记的扩增产物进行杂交,通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统显色,判断扩增片段的特异性. 结果经杂交筛选,发现1个长度约为900bp的扩增具有较好的杂交特异性片段,将序列与鼠疫耶尔森菌已完成的基因组序列比较,仅发现4个核苷酸的差异;根据这段序列设计的引物对可以特异性地扩增鼠疫耶尔森菌的模板. 结论利用PCR指纹图技术成功筛选到一段鼠疫耶尔森菌的种特异性探针,为细菌通用检测技术的研究开辟了新的思路.
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血管外科成立联合手术室的做法与体会
随着血管外科腔内介入治疗和影像学的发展,使传统手术与腔内技术有机结合,即"杂交手术"[1].杂交手术可以在同一单元、同一时间将血管介入治疗、外科手术治疗和及时的影像诊断一气呵成,打破了学科壁垒,体现了微创的优势[2].为很好地开展联合手术,我院血管外科于2010年12月成立了联合手术室开展"杂交手术",收到满意效果.现报道如下.
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联合手术室:多学科跨界医疗的新潮流
随着人类疾病谱向多因性转变和现代医学的飞跃发展,实行多学科交叉联合治疗的"一站式杂交"手术正日益发展成熟,并在世界范围内迅速流行.联合手术室又称混合手术室、杂交手术室,是近年来顺应"一站式杂交"手术发展需要而兴起的新手术室模式,这种以传统手术室为基础、可以同时进行影像学检查和常规外科手术的"一站式"联合手术室打破了学科之间的壁垒,实现了介入医学、外科学和影像诊断学三大技术的完美"联合".更为重要的是,联合手术室还有利于即时对手术疗效进行评价,指导手术顺利实施,且可避免资源浪费,是实现疗效大化的全新治疗模式.
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结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测
目的:探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况.方法:采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增;利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测.结果:25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性;25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80%,inhA基因扩增阳性率为68%.结论:耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株;PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据.
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人乳头瘤病毒的致癌性
人乳头瘤病毒(Human Papilloma Viruses,HPV)目前已分离出70多个亚型[1,2],不同类型的HPV感染后可导致不同的临床表现.当感染HPV5、6型时.可引起皮肤增生不良性疣状病变如寻常疣等;引起下生殖道病变的HPV有6、11、16、18、30、31、33～35、39、40、42～45、51～58等24个亚型[3].
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肾上腺髓质素对慢性肾衰竭及血液透析患者血压的影响
肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)是日本学者Ki tamure[1]等于1993年从人肾上腺嗜铬细胞瘤中分离纯化出一种由52个氨基酸组成的多肽.而应用免疫组织化学定位和杂交表明,肾脏是ADM分布较高的器官之一[2],其含量依次为嗜铬细胞瘤肾上腺＞肺＞肾脏＞脑皮质、小肠、心脏[3].
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治疗下肢急性动脉栓塞的杂交策略
急性动脉栓塞是指由栓子导致的肢体动脉急性闭塞，栓子的常见来源有心源性（心房颤动、心肌梗死、风湿性心脏病、人工心脏瓣膜、细菌性心内膜炎或心房黏液瘤等）和血管源性（动脉粥样硬化、动脉瘤、人工血管内血栓、动脉内操作及动脉内异物等）。近几年因风湿性血管疾病及心房颤动引起的急性动脉栓塞逐渐减少，动脉粥样硬化基础上的栓塞和更加复杂疾病模式的患者逐渐增加。
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去整合素和金属蛋白酶10与阿尔兹海默病的研究进展
去整合素和金属蛋白酶（ a disintegrin and metalloprotease ， ADAM）家族为一个包含了三十多个成员的家族，它们在细胞黏附、细胞迁移、白细胞募集、炎症、蛋白水解等方面发挥各自的作用［1］。 ADAM10为ADAM家族中一员，早从牛的脑髓鞘膜中分离纯化所得，当时被称为哺乳动物整合素金属蛋白［2］，其后实验发现其为细胞质髓鞘碱性蛋白酶［3］；随后的研究显示 AD-AM10在人的大脑［4］及外周结构［5］均有表达；而在过表达AD-AM10 cDNA的HEK293细胞中首次证实ADAM10具有切割APP的α分泌酶活性［6］。其后，Postina等［7］将阿尔兹海默病（Alzhei-mer disease，AD）小鼠与ADAM10转基因小鼠杂交，发现小鼠脑内淀粉样斑块明显减少，而α分泌酶切割淀粉样前体蛋白（ amy-loid precursor protein ，APP）所产生的可溶性片段APPsα增多，杂交小鼠的学习及记忆能力均有所增强；与此相反，ADAM10突变小鼠的APPsα减少，淀粉样斑块增多，学习能力降低［8］。上述结果表明，ADAM10是一种功能性的分泌酶，其对APP的加工可抑制淀粉样斑块的形成。
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杂交手术治疗人工血管感染大出血一例
患者男,59岁,半年前因左侧髂动脉闭塞在当地医院行右至左人工血管股-股转流术.术后切口感染,曾以脓肿形成切开引流时发生大出血,后经压迫后出血停止.但右侧吻合口溃疡,长期不能愈合.于2009年9月9日晨起7:00上厕所时,突然出现右腹股沟溃口处溃破出血,失血量约1500 ml,并出现失血性休克(70/50 mm Hg),急来我科抢救,予以伤口局部压迫止血、加压包扎、补液、输血、抗休克等治疗后出血得以控制.血压稳定后,急查心脏血管造影,发现右股总动脉与人工血管吻合口处破口,并有造影剂外溢.拟定在手术室行覆膜支架腔内隔绝、人造血管切除,伤口清创引流术.
